劍麻均一化文庫構(gòu)建及PnRXLR5863靶蛋白篩選

楊子平　楊倩　汪詢　柯智　鹿志偉　張燕梅　諶惠邦　周文釗

關(guān)鍵詞：RXLR 效應(yīng)蛋白；劍麻；均一化文庫；蛋白質(zhì)相互作用；斑馬紋病

中圖分類號：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

效應(yīng)蛋白是病原微生物產(chǎn)生的一類有利于病原微生物侵染的蛋白質(zhì)。卵菌中存在數(shù)量龐大的效應(yīng)蛋白基因，其中RXLR 類效應(yīng)蛋白的數(shù)量最多。大豆疫霉約含有396 個(gè)編碼RXLR 效應(yīng)蛋白的基因，擬南芥霜霉菌有134 個(gè)，橡樹疫霉菌有374 個(gè)，馬鈴薯疫霉菌有563 個(gè)，葡萄霜霉菌有100 個(gè)，煙草疫霉存在超過300 個(gè)[1-2]。RXLR 效應(yīng)蛋白的N端含有約20 個(gè)氨基酸的信號肽，在第40～90 位氨基酸處含有一個(gè)保RXLR 基序，之后為序列多態(tài)性的效應(yīng)分子功能區(qū)域，存在數(shù)量不等的W、Y 或者L 基序[3]。RXLR 為胞內(nèi)效應(yīng)蛋白，可以抑制植物ROS 的產(chǎn)生、胼胝的沉淀和SA 的含量等基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RXLR 效應(yīng)蛋白能通過C端功能域結(jié)合寄主內(nèi)靶蛋白，調(diào)節(jié)寄主靶蛋白功能， 抑制或者干擾寄主多個(gè)生理事件。例如Hyaloperonospora arabidopsidisd 的HaRxLL470 與HY5 相互作用并抑制防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4]；大豆疫霉（Phytophthora sojae）的PsAvr3c 與剪切體SKRP 蛋白互作，導(dǎo)致防衛(wèi)相關(guān)蛋白的Pre-mRNA剪切異常[5]；致病疫霉（Phytophthora infestans）的PITG20303 靶向并穩(wěn)定馬鈴薯免疫負(fù)調(diào)控因子絲裂原活化蛋白激酶StMKK1，影響水楊酸信號通路[6-7]；大豆疫霉（P. sojae）的PsAvh262 穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白BiPs，引起細(xì)胞壞死[8-9]。

卵菌屬煙草疫霉引起的斑馬紋病，是劍麻生產(chǎn)中的主要病害。煙草疫霉通過游動(dòng)孢子侵染劍麻的葉片，初期引起斑馬紋的病癥，之后逐步引起葉腐和莖腐[10]。目前關(guān)于劍麻斑馬紋病的研究還處在病原物的分離鑒定、病原流行性方面，而對煙草疫霉侵染劍麻的致病機(jī)制缺乏深入研究。

本課題組已對侵染劍麻不同時(shí)間的煙草疫霉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，轉(zhuǎn)錄組檢測到214 個(gè)編碼RXLR的基因。其中PnRXLR5863 表達(dá)水平高且表達(dá)水平變化顯著，其編碼的蛋白N 端含有信號肽和RXLR-EER 結(jié)構(gòu)域，C 端含有W 和Y 功能結(jié)構(gòu)域。在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)PnRXLR5863，能引起細(xì)胞死亡，推測PnRXLR5863 是侵染劍麻的關(guān)鍵RXLR 效應(yīng)蛋白，但是PnRXLR5863 作用劍麻的靶蛋白和作用分子機(jī)制還不清楚。因此，本研究構(gòu)建了劍麻酵母雙雜交均一化cDNA 表達(dá)文庫，篩選了與PnRXLR5863 相互作用的靶蛋白。結(jié)果為深入研究PnRXLR5863 的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

劍麻（Agave hybrid No.11648）采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所劍麻種質(zhì)保存圃；Trizol 購自Invitrogen 公司；Oligo（dT）、DNA cleanbeads 和PCR mix 磁珠購自諾唯贊公司；均一化試劑盒購自Evrogen 公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hi-Fusion 試劑盒、EcoR I、雙鏈cDNA 純化、酵母轉(zhuǎn)化和文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech 公司；用于配制酵母培養(yǎng)基的試劑和其他試劑購自Sigma-Aldrich 公司。引物合成與DNA 測序委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取 采集Agave hybrid No.11648植株葉片，液氮速凍。將樣品研磨成粉，Trizol 法提取其總RNA。采用Oligo（dT）磁珠純化mRNA。

1.2.2 RNA 的反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系中加入1.0 μLCDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物，1～500 ng 的mRNA，DEPC H2O 補(bǔ)齊到5 μL，72℃ 3 min，立即置于冰上。之后依次加入1.0 μL DTT，1.0 μLdNTP，1.0 μL MMLV Reverse Transcriptase，2.0 μL5×First-Strand buffer，42℃ 90 min，然后70℃15 min 終止，冷卻至室溫，加入1 μL RNase H，37℃ 30 min，產(chǎn)物存放于?80℃保存。CDS Ⅲ引物和SMART Ⅲ引物序列見表1。

1.2.3 雙鏈cDNA 的合成 2.0 μL 單鏈cDNA，2.0 μL 5' PCR 和3' PCR 引物，25 μL Advantage 2Polymerase Mix 合成雙鏈cDNA，加水補(bǔ)齊到50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 6 min，72℃ 10 min，30 個(gè)循環(huán)。5' PCR 引物和3' PCR 引物序列見表1。

1.2.4 雙鏈cDNA 的純化 將1.2 倍樣品體積的磁珠液與雙鏈cDNA 混勻，室溫孵育10 min，轉(zhuǎn)移到磁力架上，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。200 μL 新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠（不要攪動(dòng)磁珠），室溫孵育30 s，小心移除上清；室溫下開蓋干燥磁珠5～10 min，加入30～50 μL 無核酸酶ddH2O，室溫靜置2 min，小心吸取上清至一個(gè)新的無核酸酶EP 管中。

1.2.5 cDNA 均一化 按照以下體系進(jìn)行雜交：1 g ds cDNA，8 μL 2×Hybridization buffer，水補(bǔ)齊到16 μL，將上述溶液平均分成4 份，置于0.2 mLPCR 管中；PCR 儀上98℃放置2 min，迅速轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的68℃ PCR 儀中5 h。按照以下體系進(jìn)行DSN 消化：4 μL 雜交后的cDNA，5 μL 2×DSNmaster buffer （68℃預(yù)熱），1 μL DSN solution （分別為DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水補(bǔ)齊到16 μL，68℃反應(yīng)25 min。按照以下體系進(jìn)行PCR 放大：10 μL 2×DSN stop buffer，室溫放置5 min。5 μL 10×Advantage 2 PCR buffer，1 μL50×dNTP Mix，1.5 μL Primer M1，1 μL 50× Advantage2 Polymerase Mix，1 μL 消化后產(chǎn)物（即DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水補(bǔ)齊到50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 1 min；95℃ 15 s；66℃20 s；72℃ 3 min，11 個(gè)循環(huán)。

1.2.6 cDNA 小片段去除 預(yù)先將CHROMASPINTM TE-400 純化柱中膠體和緩沖液混合均勻，瞬時(shí)離心棄液體。將93 μL 雙鏈cDNA 加入純化柱膠體，700 g 離心5 min。向收集液中加入2.5倍體積無水乙醇和1/10 體積的3 mol/L 乙酸鈉（NaAc），置于?20℃沉淀DNA。用20 μL 無菌水溶解沉淀物，并測定雙鏈cDNA 濃度。

1.2.7 雙鏈cDNA 與pGADT7（lineared）同源重組 按照以下體系進(jìn)行同源重組：2 L ds cDNA，50～200 ng pGADT7，4 μL 5×CE II buffer，2 μLExnase II，水補(bǔ)齊到20 μL，在37℃反應(yīng)30 min，置于冰上。按照以下體系進(jìn)行產(chǎn)物純化：20 μL重組產(chǎn)物，2 μL 核酸助沉劑，55 μL 100%乙醇，混勻后于?20℃放置30 min，13 000 r/min 離心15 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，8000 r/min 離心2 min ， 棄上清； 室溫下晾5～10 min，加入10 μL TE buffer 溶解沉淀。

1.2.8 文庫構(gòu)建 將10 μL 重組產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至50 μL 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，取10 μL 菌液稀釋10 000倍后，從中取100 μL 涂布于含Amp 抗生素的LB平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)。剩余菌液加入甘油至終濃度為20%即為文庫菌液。

1.2.9 文庫質(zhì)量檢測 文庫庫容（CFU/mL）=克隆數(shù)/涂布體積稀釋倍數(shù)?？偪寺?shù)（CFU）=庫容菌液總體積。PCR 克隆鑒定體系如下，10 μL2× PCR Mix，1 μL T7-F，1 μL 3AD，水補(bǔ)齊到20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃ 3min；95℃ 15 s；55℃ 15s；72℃ 5 min，72℃ 5 min，25 個(gè)循環(huán)。

1.2.10 誘餌載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)攜帶EcoR I 酶切位點(diǎn)的特異引物（表1），擴(kuò)增PnRXLR5863 編碼框。將PnRXLR5863 編碼框插入pGBKT7 載體，構(gòu)建誘餌載體。

1.2.11 誘餌載體自激活檢測 將pGBKT7-PnRXLR5863 載體轉(zhuǎn)化AH109 酵母菌株，轉(zhuǎn)化液涂布于不含色氨酸的培養(yǎng)基（SD/-Trp），30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。隨機(jī)挑取6 個(gè)點(diǎn)，用pGBKT7 的載體引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，隨機(jī)取3 個(gè)正確克隆點(diǎn)板至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 板上，30℃培養(yǎng)3～5 d。其中pGBKT7 為陰性對照。

1.2.12 互作蛋白篩選 制備AH109 酵母感受態(tài)，將文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-PnRXLR5863共轉(zhuǎn)化AH109 酵母菌，轉(zhuǎn)化液涂布于SD/-Trp/-His/-Ade 篩選平板。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

為了鑒定所提取的RNA 是否能用于下游建庫，從中吸取2 μL 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測和分光光度計(jì)測量。結(jié)果顯示，能清晰地看到28S 和18S兩條帶，5S 條帶很弱甚至無，表明所提RNA 完整性好，無降解（圖1A）。OD260/OD280 在1.8～2.2之間，表明RNA 純度高；OD260/OD230 大于2，表明糖類、鹽類、有機(jī)溶劑等去除干凈。因此，所提取RNA 可用于下游建庫。

2.2 cDNA 的合成

為了判斷所獲得的ds cDNA 是否合成，PCR結(jié)束后取5 μL 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果顯示ds cDNA 呈現(xiàn)彌散條帶（圖1B），表示各種大小的條帶都有，合成的cDNA 質(zhì)量較好。

2.3 cDNA的純化

為了檢測小片段是否去除，從純化后的溶液里邊吸取5 μL 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果顯示ds cDNA 呈彌散條帶，500 bp 以下幾乎看不到條帶，表明小片段去除干凈（圖1C）。

2.4 克隆計(jì)數(shù)

為了確定文庫庫容，對電轉(zhuǎn)化液稀釋10 000倍。經(jīng)培養(yǎng)，平板上克隆約為532 個(gè)，根據(jù)公式計(jì)算得到庫容為5.32×107 CFU/mL ， 總克隆數(shù)為1.064×108 CFU（圖2）。

2.5 文庫質(zhì)量鑒定

為了檢測文庫的條帶分布，從平板上隨機(jī)挑選24 個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR。檢測結(jié)果顯示，文庫條帶在1000 bp 上下出現(xiàn)，說明文庫片段平均大小在1000 bp（圖3）。

2.6 自激活檢測

為了檢測誘餌載體是否有自激活，將含誘餌載體的酵母菌點(diǎn)至SD/-Trp 、SD/-Trp/-His 、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上。結(jié)果顯示，陰性對照pGBKT7 能在SD/-Trp平板上生長，在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上均不能正常生長。實(shí)驗(yàn)組與對照組生長一致（圖4）。結(jié)果說明誘餌載體無自激活現(xiàn)象。

2.7 靶蛋白篩選

為了獲得陽性克隆，從SD/-Trp/-Leu/-His 篩庫平板上挑取了96 個(gè)克隆（圖5），轉(zhuǎn)板培養(yǎng)一次，對這96 個(gè)克隆進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對PCR 產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST 比對分析，去除重復(fù)獲得23 個(gè)陽性克?。ū?）。蛋白功能注釋結(jié)果顯示，這些蛋白主要參與分子功能和生物過程，涉及泛素化過程、蛋白合成、蛋白翻譯和蛋白修飾等生理事件。

2.8 陽性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將陽性克隆與誘餌載體共轉(zhuǎn)化AH109 酵母菌，點(diǎn)板至SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板，進(jìn)行陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖6），陽性對照能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上生長，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上顯藍(lán)色；陰性對照僅在SD/-Trp/-Leu 平板上能生長，而在其他平板均不能生長。

23 個(gè)陽性克隆能在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His 缺陷型平板上生長，8 個(gè)陽性克隆能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 平板上生長，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上顯藍(lán)色。

3 討論

酵母雙雜交是目前能夠進(jìn)行高通量篩選相互作用蛋白的技術(shù)之一，文庫質(zhì)量直接影響互作蛋白的篩選。通常通過文庫基因的完整性和復(fù)雜性來評估cDNA 文庫的質(zhì)量。cDNA 序列的完整性和豐度決定了文庫的完整性，mRNA 序列的完整直接影響cDNA 系列的完整性。采用SMART 技術(shù)構(gòu)建cDNA 文庫，要求實(shí)驗(yàn)材料少、操作簡單、快速[11]，能夠較真實(shí)地反映樣品中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，但是低豐度表達(dá)基因容易在文庫構(gòu)建過程中丟失，且不利于篩選獲得低豐度表達(dá)基因，高豐度表達(dá)基因也會(huì)給篩選帶來一定的困難[12]。而利用DSN 酶處理cDNA，能降低高表達(dá)基因的拷貝，增加低豐度基因的拷貝[13]，提高篩庫獲得低豐度表達(dá)基因的幾率。文庫的完整性可以通過庫容來進(jìn)行量化評估，高質(zhì)量文庫的庫容至少為106 CFU，低于此指標(biāo)，不利于獲得陽性克隆[11]。文庫片段正確表達(dá)可以增加文庫的復(fù)雜性，通過合成三框cDNA 來實(shí)現(xiàn)文庫復(fù)雜性，目的是保證文庫片段都能表達(dá)出與樣本體內(nèi)相同的蛋白[13]。這樣，一方面能增加獲得互作蛋白的概率，另一方面也能減少假陽性。為了構(gòu)建高質(zhì)量的劍麻酵母cDNA 表達(dá)文庫，本研究從總RNA 中純化了mRNA，采用三框引物合成cDNA，利用DSN 對cDNA進(jìn)行均一化，SMRT技術(shù)構(gòu)建重組文庫質(zhì)粒，最后將質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建了一個(gè)文庫片段平均大小在1000 bp、庫容為5.32× 107 CFU/mL、總克隆數(shù)為1.064×108 CFU 的均一化文庫。

在之前的研究中，為了篩選與劍麻AhKNOX2蛋白相互作用的蛋白，以健康劍麻葉片總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為材料，采用體內(nèi)同源重組的方式，在酵母體內(nèi)構(gòu)建了一個(gè)酵母雙雜交文庫，其文庫總?cè)萘繛?.9106 CFU，插入片段大小主要分布于0.5～3.0 kb 之間，重組率為92%[14]。與前一個(gè)文庫構(gòu)建不同的是，為了篩選與病原菌效應(yīng)蛋白互作的劍麻靶蛋白，選用煙草疫霉侵染的劍麻葉片為材料，目的是激發(fā)劍麻抗病基因的表達(dá)。為排除文庫編碼核糖體蛋白的cDNA 的插入，以及確保文庫插入cDNA 能正確表達(dá)，從總RNA中純化了mRNA，并采用了三框引物對mRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)。為了降低高表達(dá)基因的豐度和提高低表達(dá)量基因的豐度，本研究對合成的雙鏈cDNA 進(jìn)行了均一化。此外，為了提高轉(zhuǎn)化效率，本次采用體外同源重組和電擊轉(zhuǎn)化，在大腸桿菌中構(gòu)建表達(dá)文庫。由文庫質(zhì)量評估可知，新文庫的庫容量達(dá)到107，比前一個(gè)文庫提升一個(gè)數(shù)量級。劍麻CDS 平均長度為1087 bp（未公布的基因組數(shù)據(jù)），新老文庫篩選獲得的陽性克隆插入片段平均長度為920 bp 和1050 bp，排除由于誘餌蛋白功能導(dǎo)致的靶蛋白的差異，2 個(gè)文庫的插入片段均有較好的完整性。

RXLR 是卵菌中第一大類效應(yīng)蛋白，能夠通過與寄主防御蛋白結(jié)合，在表觀修飾水平抑制抗病基因轉(zhuǎn)錄[15-16]；在轉(zhuǎn)錄水平抑制寄主防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄[4， 17-18]；在轉(zhuǎn)錄后水平干擾寄主防衛(wèi)基因的翻譯[5， 19]；干擾寄主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6-7， 20-22]；調(diào)控自噬[23]；調(diào)控細(xì)胞間運(yùn)輸[24]；介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8-9]；操縱活性氧信號[25]。本研究以PnRXLR5863 為誘餌，通過酵母雙雜交從劍麻文庫中獲得23 個(gè)互作蛋白。已知功能的16 個(gè)蛋白，涉及泛素化過程、蛋白合成、蛋白翻譯和蛋白修飾等生理事件。推測煙草疫霉侵染劍麻過程，PnRXLR5863 效應(yīng)蛋白可能作用于劍麻的蛋白代謝。