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    5-氟-胞苷抗腫瘤活性及其機制研究

    2023-04-29 16:19:27王紹昕秦童黃震
    四川大學學報(自然科學版) 2023年5期
    關鍵詞:抗腫瘤凋亡

    王紹昕 秦童 黃震

    摘要:為進一步探求高效、廣譜的抗腫瘤氟代化學修飾小分子藥物,為癌癥治療提出新的解決方案,本研究通過分子對接技術和細胞活性、流式細胞、轉錄組分析、DNA損傷等實驗來探索氟修飾核苷類分子5-氟胞苷的抗腫瘤活性及其作用機制.實驗結果表明,5-氟胞苷在多種腫瘤細胞中的 IC ?50 ?小于 1 μmol/L,且5-F-Cyd較為明顯地調節(jié)了癌癥的發(fā)生與發(fā)展機制,與影響DNA復制、造成DNA損傷和誘導細胞凋亡有關.此外,還發(fā)現(xiàn)氟原子修飾的5-氟胞苷有可能通過干擾聚合酶 θ的修復功能來阻止耐藥的發(fā)生. 因此,5-氟胞苷可作為癌癥治療的潛在候選藥物.

    關鍵詞:核苷類藥物; 抗腫瘤; 凋亡; DNA損傷

    中圖分類號: ?Q291

    文獻標識碼:A

    DOI:10.19907/j.0490-6756.2023.056002

    收稿日期: 2023-04-13

    基金項目: ?西南特色中藥資源國家重點實驗室開放基金(SKLTCM202202, 2022/09-2023/08)

    作者簡介: ??王紹昕(1998-), 女, ?山東臨沂人, 碩士研究生, 研究方向為細胞生物學. E-mail: 1250688706@qq.com

    通訊作者: ?黃震.zhen_huang@scu.edu.cn

    The antitumor activity and mechanism of 5-fluoro-cytidine

    WANG Shao-Xin, QIN Tong, HUANG Zhen

    (Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Educaion, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

    To further explore efficient and broad-spectrum anti-tumor fluorinated chemically modified small molecule drugs and propose new solutions for cancer therapy, this study explored the antitumor activity and mechanism of fluorine-modified nucleoside analog molecule 5-fluorocytidine by molecular docking technique and cell activity, flow cytometry, transcriptome analysis, DNA damage. The experimental results showed that the IC ?50 ?of 5-fluorocytidine in a variety of tumor cells is less than 1 μmol/L. Moreover, 5-F-Cyd significantly regulates the occurrence and development of cancer, affecting DNA replication, causing DNA damage, and inducing cell apoptosis. In addition, it was found that fluorine-atom-modified 5-fluoro-cytidine has the potential to prevent the development of drug resistance by interfering with the repair function of polymerase θ. In conclusion, 5-fluorocytidine may serve as a potential drug candidate for cancer therapy.

    Nucleoside analogs; Antitumor; Apoptosis;DNA damage

    1 引 言

    作為世界上第二大致死病因,癌癥的患病率和病死率逐年升高 ?[1] .根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)公布的數(shù)據(jù),中國以457萬病例位居2020年癌癥新發(fā)人數(shù)的國家榜首,美國和印度分別以228萬和132萬居第二和第三位 ?[2] .短短六年時間,中國新發(fā)癌癥病例就從2016年的406.4萬例,增至2022年的482萬例,增幅高達18.6% ?[3] .在目前我們已知的癌癥中,胰腺癌因其診斷、治療難度高及低生存率被稱為“癌癥之王”.隨著對癌癥發(fā)病機制探索與完善,各種腫瘤的治療得到了長足的發(fā)展,但胰腺癌的診斷與治療在近年來幾乎沒有變化 ?[4] .因此,本研究計劃以胰腺癌細胞株(PANC-1)進行主要的機制探索,為胰腺癌治療提供新思路.

    化療是目前癌癥治療最常見和最有效的主要方法之一 ?[5] .根據(jù)美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)的數(shù)據(jù),美國每年約有65萬名癌癥患者在門診癌癥治療中接受化療.根據(jù)作用機制不同,抗癌化療藥物分為以下六種:a)造成DNA損傷的烷基化劑;b) 摻入DNA或RNA合成鏈中,引起鏈合成中斷的鏈終止劑;c)聚合酶或與核苷酸合成相關酶的活性抑制劑;d)拓撲異構酶I或II的抑制劑;e)有絲分裂和細胞分裂的抑制劑;f)治療癌癥和減輕其他藥物副作用的皮質類固醇 ?[6] .其中,核苷類小分子的主要機制是作為核苷酸合成相關酶的活性抑制劑,干擾核苷酸的合成;作為DNA或RNA合成的底物,或作為聚合酶抑制劑與聚合酶緊密結合,干擾其正常功能的行使,從而引起新生DNA或RNA鏈合成的終止 ?[7] .隨著新冠病毒爆發(fā),人們又開始關注核苷類藥物的抗病毒機理.核苷的修飾可引起其結構、穩(wěn)定性和選擇性變化,從而具有抗病毒或抗癌的效力 ?[8] .需要指出的是,從核苷的結構來看,抗病毒和抗腫瘤并沒有絕對嚴格的區(qū)分 ?[9] .氟原子修飾的核苷類藥物,由于可以提高藥物選擇性、有效性及遞送效率等優(yōu)勢,已成為主要的修飾策略之一.此外,該類藥物還具有易于合成、儲存、運輸和標準化等優(yōu)點 ?[10] .氟代藥物已經(jīng)被用于癌癥、艾滋病毒、瘧疾和天花感染在內的多種疾病治療 ?[11] ,5-氟胞苷(5-F-Cyd)作為一種氟代核苷類藥物,在臨床上被廣泛應用于酵母和真菌感染的治療,其基本機制為先脫氨,轉變成為5-氟尿苷,然后代謝為其它尿苷類似物,并且少量被轉化為5-氟胞苷三磷酸,隨后被摻入RNA合成鏈,進而終止RNA合成 ?[12] .有研究表明,氟胞苷和氟脫氧胞苷對的人宮頸癌細胞株的生長具有較強抑制作用 ?[13] .因此,我們計劃對其抗腫瘤機制進行進一步的研究,以便進一步探求高效、廣譜的抗腫瘤氟代化學修飾小分子藥物,為癌癥治療提出新的廣譜解決方案.

    2 材料和方法

    2.1 實驗材料

    PANC-1細胞、LNCaP細胞、MCF-7細胞、PC-3細胞購自中科院上海細胞所;細胞培養(yǎng)皿、96孔板、離心管購自Corning公司(中國);DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶購自Hyclone公司(美國);澳洲胎牛血清購自Thermo fisher公司(美國);DMSO、 Cell Counting Kit-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司.

    2.2 實驗方法

    2.2.1 小分子核苷藥物的細胞活性實驗 ?取對數(shù)期生長的PANC-1細胞,胰酶消化后離心,棄上清,含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后計數(shù),根據(jù)計數(shù)結果96孔板鋪板.每孔約3500個細胞(具體數(shù)目根據(jù)預實驗確定),各實驗組、陰性對照組和陽性對照組設5個復孔,1個空白組作為背景.37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)貼壁,細胞融合度為 30%~40% 時藥物處理,按濃度梯度(1 nmol/L、 10 nmol/L 、100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L濃度)給藥,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,CCK8處理后測定吸光度.

    2.2.2 5-F-Cyd的流式細胞實驗 ?使用10 μmol/L ?的5-F-Cyd,以及吉西他濱處理PANC-1細胞48 h ,陰性對照組使用PBS處理.經(jīng)Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒處理染色后,上機檢測.

    2.2.3 轉錄組測序 ?PANC-1細胞與10 μmol/L濃度的5-F-Cyd以及未經(jīng)處理的陰性對照組(NC)共同孵育48 h后,用Trizol試劑將細胞從培養(yǎng)板吹打至2 mL離心管,存于-80 ℃或直接送檢.

    2.2.4 DNA損傷實驗 ?用96孔板鋪板,每孔1×10 ?4 個PANC-1細胞,過夜貼壁給藥4~7 h( 50 μmol/L 、 30 μmol/L、20 μmol/L Capecitabine, Cisplatin, B0, B2). 使用DNA損傷試劑盒處理后,用熒光顯微鏡觀察并拍照.

    2.2.5 分子對接 ?在PDB下載蛋白質結構,使用autodock tools預處理小分子結構和蛋白質結構,并設定grid,使用autodock vina進行虛擬對接以及用pymol分析結果.

    3 結果與分析

    3.1 5-氟-胞苷對癌細胞增殖的作用

    使用經(jīng)化學合成的5-氟-胞嘧啶(5-F-Cytosine,5-F-Cyt)和5-氟-胞苷(5-F-Cytidine,5-F-Cyd)在胰腺癌細胞PANC-1,乳腺癌細胞MCF-7,前列腺癌細胞LNcap和PC-3等多種癌細胞系中進行細胞增殖實驗,化合物結構如圖1所示.細胞活性實驗使用吉西他濱(Gemcitabine,Gem)作為對照,設置五個藥物濃度,經(jīng)不同化合物處理48 h的細胞,使用CCK8檢測細胞增殖速率(圖2).實驗結果表明,在多種癌細胞系中,5-F-Cyd均顯示出良好的細胞增殖抑制效果,且5-F-Cyd的活性優(yōu)于廣譜化療藥物吉西他濱.此外,5-F-Cyd在PANC-1、MCF-7、LNcaP細胞系中的IC ?50 分別為0.19 μmol/L、0.85 μmol/L和0.60 μmol/L,展現(xiàn)出顯著抑制腫瘤細胞增殖的活性.

    3.2 ?5-氟-胞苷處理后的轉錄組測序結果分析

    對其處理的PANC-1細胞進行了轉錄組測 序,并對差異基因進行KEGG聚類分析,選取顯著性最高的20個基因繪制不同通路的基因表達差異圖(圖3).5-F-Cyd處理后,DNA復制、DNA損傷與修復、細胞周期、細胞凋亡以及與癌癥相關的多條通路均有上調,顯示5-F-Cyd較為明顯的調節(jié)了癌癥的發(fā)生與發(fā)展,且機制與影響DNA復制、造成DNA損傷和誘導細胞凋亡有關;同時,有機物的代謝以及胞質、細胞器代謝、蛋白質結合等通路發(fā)生了下調,說明5-F-Cyd影響或阻礙了細胞的正常代謝過程.

    3.3 5-氟-胞苷的DNA損傷

    基于轉錄組測序中,5-F-Cyd處理后關于DNA損傷和修復途徑差異表達的結果,為驗證其是否會造成DNA損傷,本研究用磷酸化H2AX (γ-H2AX)作為損傷標志物來檢測DNA損傷情況(DNA雙鏈斷裂).DNA雙鏈斷裂損傷(DNA double strand break damage ,DSB)是最危險的DNA損傷類型之一.哺乳動物細胞中對DSB的首批反應之一是組蛋白變體H2AX的Ser139殘基的磷酸化,H2AX的Ser139殘基的磷酸化導致染色質凝結,并在修復因子的招募中發(fā)揮重要作用,由于H2AX在Ser139位點的磷酸化與DSB具良好相關性,因此磷酸化H2AX(γ-H2AX)是檢測DNA損傷及其修復的敏感標記物.結果顯示,5-F-Cyd處理后的細胞產(chǎn)生了強烈DNA損傷熒光,說明與轉錄組測序結果一致,5-F-Cyd確可引起DNA損傷.

    3.4 5-氟-胞苷的三磷酸形式與pol θ的虛擬對接

    DNA損傷實驗表明,5-F-Cyd可引起DNA雙鏈斷裂損傷,該損傷可通過DNA聚合酶theta(pol θ)介導的末端連接(TMEJ)進行修復.有研究表明,抑制TMEJ的藥物在組合治療策略中非常有效 ?[14] .

    為探究5-F-Cyd造成DNA損傷的分子機理,本研究用分子對接的方式探究氟修飾核苷對于pol θ的親和力影響.結果顯示(圖5),5-F-Cyd的三磷酸形式與pol θ 的 Kd 值為5.94×10 ?-7 ?mol/L, 相對于其天然底物dCTP的 Kd 值(1.40×10 ?-5 ?mol/L)下降了兩個數(shù)量級,即親和力更高.此外,氟修飾還改變了核苷酸的結合位點及其與聚合酶的相互作用力,相比dCTP只與pol θ通過氫鍵連接,5-F-CTP與pol θ的相互作用力更多且出現(xiàn)了鹽鍵的連接(圖6).這些結果表明氟修飾會大大提升核苷與pol θ的親和力,改變核苷酸與pol θ的相互作用力,因此pol θ可能是5-F-Cyd,乃至氟代核苷藥物的潛在靶點.

    3.5 5-氟-胞苷可顯著促進癌細胞凋亡

    基于5-F-Cyd在PANC-1細胞系中顯著抗癌效果,以及引起DNA損傷的結果,推測其抗癌機制之一可能是通過造成DNA損傷,進而促進腫瘤細胞凋亡,殺死腫瘤細胞.本實驗以吉西他濱為陽性對照,通過流式細胞術實驗探究5-F-Cyd的促凋亡活性.結果表明(圖7),經(jīng)藥物處理48 h后:吉西他濱組(Gem)與文獻報道一致,引起14.1%的細胞凋亡 ?[15] ,其中13.0%細胞處于凋亡晚期階段,1.1%細胞處于早凋階段;5-F-Cyd引起70.4%的細胞凋亡,其中68.8%和1.6%的細胞分別處于晚凋和早凋階段.與吉西他濱相比,5-F-Cyd引起更為顯著的凋亡現(xiàn)象.

    4 討 論

    眾多研究表明,DNA損傷劑以及DNA合成抑制劑,常通過造成DNA損傷,進而觸發(fā)細胞凋亡來誘導腫瘤細胞死亡 ?[16,17] ,我們也得出了一致的結論.本研究探索了在多種癌細胞系中具有良好抗癌活性的氟代核苷類似物5-氟-胞苷.我們發(fā)現(xiàn)其在多種細胞系中的活性均優(yōu)于廣譜化療藥物吉西他濱,此外5-氟-胞苷在胰腺癌細胞系PANC-1中的效果較為顯著.眾所周知,胰腺癌作為生存率最低常見癌癥,因發(fā)病位置特殊和發(fā)展速度極快,其診斷和治療都存在極大的困難 ?[18] .胰腺癌是一種侵襲性癌癥,在西方國家中是惡性腫瘤相關死亡的第四大原因 ?[19] .美國癌癥協(xié)會估計,每年大約有4.4萬人死于胰腺癌 ?[20] .本研究以胰腺癌細胞系(PANC-1)為模型探索核苷類藥物的活性和機制,對于胰腺癌的治療具有一定借鑒意義.

    為探索5-氟-胞苷的細胞生物學機制,本研究進行了轉錄組測序分析.結果顯示,經(jīng)5-F-Cyd處理后,PANC-1細胞系中與癌癥發(fā)生發(fā)展、DNA復制、細胞周期、DNA損傷修復等相關的通路發(fā)生明顯上調.DNA損傷實驗和流式細胞術進一步驗證了轉錄組測序結果,5-F-Cyd通過引起DNA損傷,進而促進腫瘤細胞凋亡.此外,本研究借助分子虛擬對接技術,發(fā)現(xiàn)5-F-Cyd的三磷酸形式與pol θ的結合位點和相互作用力與天然底物(脫氧胞嘧啶核苷三磷酸)不同,除氫鍵外還通過鹽鍵與pol θ作用,且結合力更強.因此,5-氟-胞苷很可能以pol θ為靶點,通過阻止其修復雙鏈斷裂損傷,防止耐藥的發(fā)生,強化抗腫瘤效果.pol θ是負責損傷修復的關鍵酶之一.抗腫瘤藥物能引起DNA損傷,然而DNA損傷可以通過DNA損傷反應(DDR) ?[21] ?逆轉,從而對藥物產(chǎn)生耐藥性,這個過程中存在多種DNA聚合酶的參與 ?[22] .因此,DNA聚合酶是重要的藥物耐藥性研究靶點,值得進一步的研究與探索.

    綜上所述,5-氟-胞苷具有顯著的抑制多種腫瘤細胞增殖和促進胰腺癌細胞凋亡的效果,且很可能通過干擾pol θ 的修復功能,阻止耐藥反應的發(fā)生,這些結果為在后續(xù)研究中將其用于胰腺癌治療或探究核苷類藥物的耐藥機制提供了可能.然而,一些核苷類藥物表現(xiàn)出的臨床毒性,限制了它們的使用 ?[23] ,現(xiàn)多采取化學修飾將高活性分子改造為藥物前體的方式 ?[24] ,降低核苷類藥物的毒性.因此后續(xù)工作也將對5-F-Cyd的毒副作用進行研究,并嘗試通過合理的修飾改造方法,降低毒副作用的同時,保留其高抗腫瘤活性.總之,本文對5-氟胞苷抑制癌細胞增殖活性及其作用機制進行了初步探究,其顯著的抑癌活性可使其有望成為癌癥治療和新藥研發(fā)改造的候選藥物,值得進一步研究、探索與改造.

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