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    環(huán)境DNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

    2023-04-15 19:01:15呂若萱王秀華連新宇
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2023年3期
    關(guān)鍵詞:壺菌水生動(dòng)物病原

    呂若萱,王秀華,李 晨,連新宇,3,楊 冰

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266071;2.上海海洋大學(xué),上海 201306;3.浙江海洋大學(xué),浙江舟山 316022)

    環(huán)境DNA(environmental DNA,eDNA)研究始于1987年,被定義為可檢測(cè)到的短DNA/RNA片段。這些片段來(lái)自活生物體的細(xì)胞成分或其分泌到周?chē)h(huán)境(水、空氣、沉積物)的非生物成分短核酸片段[1-3]。eDNA樣本被提取后,可以使用多種分子生物學(xué)方法檢測(cè)目標(biāo)片段,包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、Sanger測(cè)序等[4-5]。此外,eDNA可直接作為宏基因組學(xué)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,或者在特定目標(biāo)基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。近年來(lái),eDNA 技術(shù)已被應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性研究、資源生物量檢測(cè)以及瀕危種和入侵種檢測(cè)。在水樣、土壤及沉積物等環(huán)境中檢測(cè)eDNA,對(duì)于深入了解和保護(hù)水生動(dòng)物生態(tài)具有巨大潛力[6]。

    利用eDNA方法監(jiān)測(cè)水生系統(tǒng)疫病的研究越來(lái)越多,涉及兩棲類[7-9]、魚(yú)類[10-12]、甲殼類[13-15]等多種水生動(dòng)物。它具有成本低、效率高、非破壞性的特點(diǎn),對(duì)監(jiān)測(cè)高價(jià)值或稀有動(dòng)物疫病優(yōu)勢(shì)明顯。作為組織樣本采集的輔助方法,eDNA方法在早期發(fā)現(xiàn)野生和養(yǎng)殖動(dòng)物群體的疫病入侵或感染導(dǎo)致非明顯臨床癥狀的情況下具有潛在作用。為此,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization of Animal Health,WOAH)正與各成員討論將該方法應(yīng)用于水生動(dòng)物疫病診斷國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的可能性[16]。但eDNA方法也存在缺乏驗(yàn)證以及診斷靈敏度易受影響的問(wèn)題。本文探討了eDNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的潛在用途,以期為深入開(kāi)展eDNA方法在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用提供參考。

    1 eDNA方法的優(yōu)勢(shì)

    相比直接采樣檢測(cè),eDNA方法存在很多優(yōu)點(diǎn):eDNA方法不要求對(duì)水生動(dòng)物宿主進(jìn)行侵入性或致死性采樣,尤其對(duì)稀有或有價(jià)值的水生動(dòng)物或難以采集和捕捉的野生動(dòng)物特別有優(yōu)勢(shì)[17];不需要處理動(dòng)物,避免了獲取非破壞性組織樣本相關(guān)的壓力[18];與單個(gè)動(dòng)物樣本的采集和處理相比,樣本采集和樣本處理時(shí)間及相關(guān)成本可能會(huì)大幅減少[17];環(huán)境樣本可能涉及整個(gè)或大部分養(yǎng)殖種群的動(dòng)物,即使eDNA方法的診斷靈敏度較低,檢測(cè)病原所需的樣本也可能會(huì)少得多(與單個(gè)動(dòng)物樣本相比)。Ardura等[19]運(yùn)用eDNA方法尋找歐洲泥蝸牛(Peringia ulvae)在橫緯度航行壓載水中潛在生存的分子證據(jù),證明了eDNA方法可用于對(duì)宿主無(wú)法采樣情形下的檢測(cè)或評(píng)估。

    2 在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

    2.1 兩棲動(dòng)物

    兩棲動(dòng)物具有可滲透的皮膚,對(duì)環(huán)境干擾的敏感性強(qiáng)同時(shí)具有兩重性的生活方式,通常被認(rèn)為是生態(tài)系統(tǒng)的健康指標(biāo)。而兩棲動(dòng)物種群正在逐步消失或減少,其原因除棲息地退化和環(huán)境被破壞外,新發(fā)傳染病也是重要原因之一[20]。例如:蛙壺菌(Bartrachochytrium dendrobatidis)導(dǎo)致至少501種兩棲動(dòng)物物種數(shù)量減少,其中90種推測(cè)已滅絕[21];蛙病毒屬(Ranavirus)被認(rèn)為是導(dǎo)致兩棲動(dòng)物死亡的常見(jiàn)病原[22];新發(fā)病原蠑螈壺菌(Batrachochytrium salamandrivorans)導(dǎo)致歐洲火蠑螈(Salamandra salamandra)大規(guī)模死亡。

    而快速準(zhǔn)確識(shí)別病原微生物對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)感染,以便采取適當(dāng)?shù)木徑獯胧┲陵P(guān)重要。近年來(lái),環(huán)境樣品(如水)中的病原DNA 檢測(cè)已被成功用于鑒定多種水生動(dòng)物寄生蟲(chóng)、壺菌、卵菌和蛙病毒。

    目前,檢測(cè)蛙壺菌主要通過(guò)收集兩棲動(dòng)物宿主的皮膚拭子,從拭子中提取DNA,使用qPCR方法檢測(cè)病原體的存在和數(shù)量[23]。eDNA方法采用非侵入性采樣方法,對(duì)于檢測(cè)蛙壺菌具有較大潛力。有研究[24-26]通過(guò)過(guò)濾水樣以獲得游動(dòng)孢子和游動(dòng)孢子囊,然后對(duì)過(guò)濾顆粒使用qPCR方法進(jìn)行檢測(cè),成功從小體積(<1 L)水中檢測(cè)到蛙壺菌的存在。該方法具有較高的分析靈敏度,檢測(cè)限低至0.1游動(dòng)孢子[23],甚至0.06游動(dòng)孢子[25]。研究[27-28]顯示,在兩棲動(dòng)物死亡前的棲息地中,采用eDNA方法檢測(cè)到大量蛙壺菌的存在,并且疫病暴發(fā)期間在環(huán)境表面也發(fā)現(xiàn)了蛙壺菌的存在[28],表明eDNA方法可用于疫病預(yù)測(cè),或者提供疫病暴發(fā)期間研究棲息地病原是否存在的依據(jù)。

    Hall等[29]發(fā)現(xiàn),在初始死亡事件發(fā)生前約15 d和發(fā)生后約30 d,eDNA樣本中均可檢測(cè)到蛙病毒,表明即使未觀察到死亡,采用eDNA方法亦可在水體中檢測(cè)到蛙病毒。

    主動(dòng)和被動(dòng)監(jiān)測(cè)是確定兩棲動(dòng)物感染狀態(tài)和需要采取保護(hù)措施的關(guān)鍵因素[23]。目前蠑螈壺菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)主要通過(guò)收集兩棲動(dòng)物宿主的皮膚拭子[30],使用qPCR技術(shù)檢測(cè)是否存在該病原DNA[31],因此需要進(jìn)行大量個(gè)體采樣,成本高昂。而eDNA方法已被證明具有更高的檢測(cè)能力和成本效益。研究[32-33]表明,可以在天然水體和沉積物中檢測(cè)到蠑螈壺菌DNA。Brunner等[18]提出了針對(duì)蠑螈壺菌,從有限種群中收集合并單個(gè)樣本(如拭子)和eDNA樣本的公式,并討論了使用它們的關(guān)鍵假設(shè)和考慮因素,表明eDNA方法在減少樣本量等方面具有很大應(yīng)用潛力。

    2.2 魚(yú)類

    隨著魚(yú)類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化水平的提高,魚(yú)類病害的發(fā)生日益頻繁,成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。而通過(guò)eDNA方法檢測(cè)病原體可以更早地識(shí)別魚(yú)類種群中的感染情況,防止病原進(jìn)一步傳播。

    鮭魚(yú)甲病毒(SAV)是大西洋鮭、虹鱒魚(yú)等魚(yú)類胰腺病的主要病原。目前檢測(cè)SAV的方法主要為魚(yú)類組織取樣、組織病理學(xué)診斷和qPCR檢測(cè)。這些致死性取樣方式耗費(fèi)時(shí)間和資源。水平傳播研究[34-35]表明,可直接從海水中檢測(cè)到SAV。有研究通過(guò)過(guò)濾水來(lái)檢測(cè)水環(huán)境中的病原,如魚(yú)類體外寄生蟲(chóng)Gyrodactylus salaris[17,36]和SAV3亞型[12,37]。

    錦鯉皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)可感染鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)和錦鯉(Cyprinus carpio koi),對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)生巨大影響。CyHV-3存在于受感染魚(yú)類的腸、腎和鰓等多個(gè)器官中[38],糞便中也可檢測(cè)到 CyHV-3[39],因此水體和池塘沉積物可能也有CyHV-3的存在。Honjo等[40]建立了一種使用病毒濃度法和TaqMan PCR 結(jié)合外標(biāo)病毒定量檢測(cè)環(huán)境水體中CyHV-3的方法,表明來(lái)自不同環(huán)境水域的CyHV-3和外部標(biāo)準(zhǔn)病毒的回收率呈正相關(guān),揭示了天然水中存在高水平的病毒DNA(超過(guò)2×105copies/L)。Honjo等[41]還建立了使用外標(biāo)病毒對(duì)天然沉積物中CyHV-3 DNA 進(jìn)行定量檢測(cè)的方法,并發(fā)表了關(guān)于天然湖泊或池塘沉積物中存在CyHV-3的第一份報(bào)告,證明沉積物中的CyHV-3 DNA濃度高于水中的濃度。

    2.3 甲殼類動(dòng)物

    在甲殼類動(dòng)物疫病中,對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、急性肝胰腺壞死病(AHPND)病原、蝦肝腸胞蟲(chóng)(EHP)、傳染性皮下和造血組織壞死病毒(IHHNV)等病原,對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅[42-44],因此開(kāi)展此類疫病監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。Wang等[45]依據(jù)eDNA原理及技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境水體中IHHNV的濃縮和檢測(cè)。張娜等[46]基于eDNA技術(shù)優(yōu)化了檢測(cè)環(huán)境水體中WSSV的切向流濃縮方法,但需要進(jìn)一步研究來(lái)評(píng)估水環(huán)境和土壤中WSSV存在的風(fēng)險(xiǎn),以對(duì)WSSV有更深入和全面的了解。

    鰲蝦瘟不僅可以使本地小龍蝦種群面臨滅絕風(fēng)險(xiǎn),對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)也構(gòu)成嚴(yán)重危害。鰲蝦瘟是通過(guò)變形絲囊霉菌(A.astaci)孢子傳播的。而Strand等[47]證明eDNA方法能夠直接從大型淡水系統(tǒng)中檢測(cè)到A.astaci孢子,還發(fā)現(xiàn)鰲蝦種群中的A.astaci流行率、組織中的感染程度和湖水中的A.astaci孢子密度水平呈正相關(guān),表明該方法在鰲蝦瘟監(jiān)測(cè)中具有巨大潛力。

    2.4 軟體動(dòng)物

    軟體動(dòng)物分布于淡水、海水和陸地,在生態(tài)系統(tǒng)和群落結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著非常重要作用,可保持生態(tài)平衡和凈化水環(huán)境。對(duì)于軟體動(dòng)物,使用eDNA方法檢測(cè)病原相對(duì)于其他水生動(dòng)物起步較晚,研究較少。已有運(yùn)用eDNA方法來(lái)檢測(cè)和量化環(huán)境水體中寄生蟲(chóng)等病原的研究[48-50],并且針對(duì)DNA回收率和環(huán)境樣本中可能存在的抑制劑影響進(jìn)行優(yōu)化[48]。

    3 展望

    近年來(lái)eDNA 技術(shù)發(fā)展迅速,不僅被應(yīng)用于監(jiān)測(cè)瀕危種和入侵種,評(píng)估生物量,還被用于檢測(cè)種群遺傳特征,評(píng)估水生生態(tài)系統(tǒng)生境等,已成為闡明生態(tài)學(xué),如生物多樣性監(jiān)測(cè)、生物量估算及水生動(dòng)物健康狀況監(jiān)測(cè)的有力工具。eDNA方法可有助于增強(qiáng)主動(dòng)監(jiān)測(cè),以便進(jìn)行早期檢測(cè),特別對(duì)稀有、有價(jià)值或難以采集樣本的野生水生動(dòng)物有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),對(duì)水生動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中的疫病監(jiān)測(cè)具有成本優(yōu)勢(shì)。

    但eDNA方法在病原檢測(cè)方面存在一定的局限性。由于環(huán)境對(duì)檢測(cè)對(duì)象的稀釋和核酸的降解,環(huán)境樣品中的目標(biāo)病原DNA/RNA可能很少,這將對(duì)其靈敏度產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。環(huán)境樣本中目標(biāo)DNA/RNA濃度會(huì)因一系列因素而變化,如宿主密度、感染率、感染強(qiáng)度、取樣方法(例如取樣水量、過(guò)濾器孔徑、儲(chǔ)存條件)和環(huán)境條件(例如有機(jī)物量、紫外線)。因此,eDNA方法的檢測(cè)靈敏度在不同地區(qū)、不同時(shí)間點(diǎn)和不同目標(biāo)分類群之間的差異可能比直接進(jìn)行動(dòng)物組織采樣檢測(cè)差異更大[18]。與動(dòng)物組織樣品相比,環(huán)境樣品中的目標(biāo)病原DNA/RNA陽(yáng)性很可能來(lái)自非活病原的污染源,例如熱處理產(chǎn)品中的滅活病原體,因此eDNA檢測(cè)陽(yáng)性并不代表宿主動(dòng)物感染了目標(biāo)病原。

    基于eDNA檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用效果取決于樣本收集和處理方法(如體積過(guò)濾、PCR抑制劑的存在和去除)、生物過(guò)程(如脫落率、時(shí)間變化)和非生物因素(如分析物降解、水動(dòng)力因素)。對(duì)這些因素進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)評(píng)估非常重要,這樣才能正確解釋結(jié)果。只有清楚地了解這些因素如何影響病原體檢出的概率,基于eDNA的檢測(cè)才能在各種環(huán)境中被可靠地使用。

    目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量呈不斷上升趨勢(shì)[51],而水生動(dòng)物疫病是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的主要因素。eDNA方法可以有助于增強(qiáng)水生動(dòng)物疫病主動(dòng)監(jiān)測(cè),尤其是宿主在疫病入侵或宿主感染病原體后沒(méi)有臨床癥狀的情況下。通過(guò)eDNA方法可以有效了解病原體的傳播機(jī)制并可及時(shí)制定暴發(fā)時(shí)的控制措施。對(duì)于稀有或有價(jià)值的水生動(dòng)物等,環(huán)境采樣優(yōu)于動(dòng)物采樣,且eDNA檢測(cè)方法符合動(dòng)物福利國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的需求。eDNA檢測(cè)作為一種具有應(yīng)用前途的工具,在水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)方面有重要意義。

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