無針免疫豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗效果評價(jià)

張光際，蔡 偉，胡佳偉，崔超越，吳蓮玉，魏旭峰，4

（1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇美鳳力醫(yī)療科技有限公司，江蘇泰州 225300；3.江蘇鉑可醫(yī)療科技有限公司，江蘇泰州 225300；4.無錫明慈心血管病醫(yī)院，江蘇無錫 214000）

豬圓環(huán)病毒病（porcine circovirus disease，PCVD）是一種廣泛流行的豬傳染性疾病，由豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）感染引起[1-3]。斷奶仔豬對本病最易感，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multysystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎-腎病綜合征、繁殖障礙、肺炎、腸炎、先天性震顫等諸多疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前PCV-2感染尚無有效治療措施，且病毒抵抗力強(qiáng)，豬場凈化難度高，因此疫苗接種是當(dāng)前最有效的防控手段之一[4]。針對不同日齡的仔豬可以選擇滅活疫苗或亞單位疫苗，各種商業(yè)化疫苗己在世界各地養(yǎng)殖場廣泛應(yīng)用，但目前常用的有針注射方式存在針刺痛感明顯、注射耗時(shí)、操作不便等缺點(diǎn)[5-6]。無針注射器與皮膚碰撞后使皮膚外層的角質(zhì)層發(fā)生振蕩，產(chǎn)生肉眼看不見的小空隙，通過動(dòng)力源推動(dòng)活塞作用于藥室，快速形成壓力，使藥物通過噴嘴的速度可達(dá)100～200 m/s，藥液以一股極細(xì)的射流穿透皮膚，當(dāng)射流在皮膚內(nèi)受阻其速度衰減到一定程度時(shí)開始呈多向分散，均勻分布在皮下或皮內(nèi)，整個(gè)過程在100 μs內(nèi)快速完成[7-9]。無針注射用于疫苗接種具有注射效率高、避免交叉感染、抗原分散高和動(dòng)物疼痛感低等優(yōu)點(diǎn)。但有報(bào)道[10]稱，對山羊進(jìn)行無針免疫保護(hù)率維持時(shí)間短，免疫效果不確定，其在獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用有待進(jìn)一步觀察。無針注射臨床人用以治療糖尿病給藥多見，而針對仔豬進(jìn)行無針免疫的評價(jià)則較少[11]。本試驗(yàn)分別采用有針注射器和無針注射器為仔豬接種PCV-2亞單位疫苗，觀察仔豬注射后的臨床表現(xiàn)并評估免疫效果，以期為采用無針注射器接種疫苗提供相關(guān)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

40頭3～5周齡三元豬（PCV-2抗原/抗體檢測均為陰性，無其他免疫抑制性疾病病原，個(gè)體均勻），由泰州泰和生物科技有限公司提供。

1.2 主要試驗(yàn)材料

PCV-2亞單位疫苗（Ingelvac CircoFLEX，批號3091476B），由勃林格殷翰動(dòng)物保?。绹┯邢薰咎峁?；PCV-2抗體ELISA檢測試劑盒（批號20220507），購自韓國金諾（MEDIAN）診斷試劑株式會(huì)社；POK-V-MBX獸用無針注射器，由江蘇鉑可醫(yī)療科技有限公司提供；傳統(tǒng)有針注射器，購自江蘇科倫醫(yī)療器械制造有限公司；MR-96A酶標(biāo)儀，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)分組及指標(biāo)

選擇3～5周齡PCV-2抗原/抗體陰性、無其他免疫抑制性疾病病原、個(gè)體均勻的三元豬仔豬40頭，隨機(jī)分成4組（10頭/組），分別為有針組（耳后肌肉注射1.00 mL，1頭份）、無針免疫低（耳后接種0.25 mL，1/4頭份）、中（耳后接種0.50 mL，1/2頭份）、高（耳后接種1.00 mL，1頭份）劑量組。分別于分組后第1天和第21天分2次免疫對應(yīng)劑量的PCV-2亞單位疫苗，并于首次接種后7、14、21、28、42 d采血，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清待檢。

按照PCV-2抗體ELISA試劑盒說明書測定抗體效價(jià)，在630 nm處通過酶標(biāo)儀測定各孔吸光度。S/P≥0.4，判定PCV-2抗體陽性，S/P＜0.4，判定PCV-2抗體陰性。比較不同劑量、方法接種疫苗后抗體產(chǎn)生情況。首次免疫后對所有試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)觀察42 d，觀察指標(biāo)包括：臨床癥狀（精神、采食、飲水、行為）、首次免疫后42 d接種局部的大體觀察、試驗(yàn)動(dòng)物始末體質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以單因素方差分析法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同免疫方法對動(dòng)物臨床表現(xiàn)的影響

各組動(dòng)物經(jīng)不同注射方式免疫后有不同程度的疼痛表現(xiàn)，伴隨免疫后短時(shí)的吼叫、自主行為增加。有針注射組注射時(shí)掙扎時(shí)間較長，痛感明顯；無針免疫低、中、高劑量組動(dòng)物疼痛表現(xiàn)有一定的劑量依賴性，隨注射次數(shù)增加，注射時(shí)吼叫加重，單次接種時(shí)疼痛表現(xiàn)較輕，表現(xiàn)為一過性疼痛，注射后表現(xiàn)良好。各組動(dòng)物經(jīng)不同方式注射后的精神狀態(tài)、進(jìn)食狀況、飲水狀況、自發(fā)行為、注射部位等均未見異常。

2.2 不同免疫方法對動(dòng)物體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)開始前各組動(dòng)物體質(zhì)量均勻，組間體質(zhì)量未見差異（P＞0.05），分組具有可比性。試驗(yàn)結(jié)束后各組動(dòng)物體質(zhì)量未見差異（P＞0.05）。與有針注射組動(dòng)物比較，無針免疫低劑量組試驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)周期內(nèi)增加的體質(zhì)量和平均日增重顯著增加（P＜0.05），其余各組動(dòng)物體質(zhì)量未見差異（P＞0.05）。結(jié)果表明小劑量無針免疫的方式可以促進(jìn)仔豬生長，免疫次數(shù)增加則增重效果消失。具體結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)周期內(nèi)各組動(dòng)物體質(zhì)量變化（，n=10）

表1 試驗(yàn)周期內(nèi)各組動(dòng)物體質(zhì)量變化（，n=10）

注：*表示與有針注射組比較，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同免疫方法對動(dòng)物抗體陽性率的影響

各組動(dòng)物免疫后PCV-2抗體均有不同程度表達(dá)。首次免疫后各組動(dòng)物體內(nèi)抗體均可在第2周達(dá)到100%陽性。有針注射1頭份亞單位疫苗免疫后第3周陽性率有所下降，為80%，經(jīng)過第2次免疫，可有效升至100%，保護(hù)效果較佳。無針免疫1/4頭份亞單位疫苗組動(dòng)物體內(nèi)抗體第1周即可達(dá)到80%陽性率，隨后升至100%，二次免疫后可有效維持100%抗體陽性率。無針免疫1/2頭份亞單位疫苗組動(dòng)物體內(nèi)抗體第1周即可達(dá)到90%陽性率，隨后維持100%陽性。無針免疫1頭份亞單位疫苗組動(dòng)物體內(nèi)抗體第1周陽性率50%，第2周其可迅速提高陽性率至100%，并維持到試驗(yàn)結(jié)束。具體結(jié)果見圖1。

圖1 不同免疫方法對動(dòng)物抗體陽性率的影響

2.4 不同免疫方法對動(dòng)物體內(nèi)抗體水平的影響

以不同方式進(jìn)行PCV-2亞單位疫苗免疫后，各組動(dòng)物體內(nèi)抗體水平均呈現(xiàn)不同程度的升高，二次免疫后抗體升高更顯著。與有針注射組動(dòng)物比較，無針免疫組1頭份亞單位疫苗單次免疫1周后抗體水平較低（P＜0.05），第2周抗體水平顯著升高，二次免疫后抗體水平顯著高于有針注射組（P＜0.05），隨后極顯著高于有針注射組（P＜0.01）；無針免疫低、中劑量組動(dòng)物體內(nèi)抗體水平未見差異（P＞0.05），免疫后各階段抗體水平與有針注射組相當(dāng)（P＞0.05）。與無針免疫低劑量組動(dòng)物比較，中劑量組動(dòng)物免疫后體內(nèi)抗體水平未見差異（P＞0.05），高劑量組動(dòng)物二次免疫后體內(nèi)抗體水平較高（P＜0.05，P＜0.01）。與無針免疫中劑量組動(dòng)物比較，高劑量組動(dòng)物二次免疫后體內(nèi)抗體水平均較高（P＜0.05，P＜0.01）。具體結(jié)果見表2。

表2 不同免疫方法對動(dòng)物體內(nèi)抗體水平S/P的影響（，n=10）

表2 不同免疫方法對動(dòng)物體內(nèi)抗體水平S/P的影響（，n=10）

注：與有針注射組比較，*表示差異顯著（P＜0.05），** 表示差異極顯著（P＜0.01）；與無針免疫低劑量組比較，#表示差異顯著（P＜0.05），##表示差異極顯著（P＜0.01）；與無針免疫中劑量組比較，&表示差異顯著（P＜0.05），&&表示差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

動(dòng)物疫病免疫是指使動(dòng)物淋巴細(xì)胞通過對疫苗的識別、活化、增殖、分化，最后產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子（抗體和細(xì)胞因子）及免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而使動(dòng)物機(jī)體獲得對特定病原微生物的特異抵抗能力。該特異抵抗能力可以增強(qiáng)動(dòng)物抗病力，從而達(dá)到預(yù)防某種動(dòng)物疫病的目的。目前動(dòng)物疫病免疫的主要方法有滴眼、滴鼻、注射及口服免疫等方式。其中，注射免疫具有應(yīng)用廣、可靠性高、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)點(diǎn)，是動(dòng)物疫病預(yù)防的重要手段[12]。注射免疫過程中需要注意注射器械的滅菌與注射部位的消毒，根據(jù)疫苗接種需要，合理選擇不同規(guī)格的針頭。針頭不能太短，避免因針頭短導(dǎo)致疫苗注射在皮下，也不能太長，針頭太長在接種完疫苗抽出時(shí)容易造成疫苗溢出，特別是皮下注射[13-14]。因此現(xiàn)行的注射免疫方法存在一定短板。

無針接種疫苗具有可簡化給藥過程、提高接種人員的職業(yè)安全性、消除注射位點(diǎn)疼痛、減少接種成本以及獲得更好的免疫原性等優(yōu)勢。無針注射可以在100 μs內(nèi)將疫苗快速、均勻接種到皮下或皮內(nèi)[15]。皮膚由表皮、真皮和皮下組織（脂肪層）組成，是外傷和感染的第一道物理和免疫屏障，比肌肉具有更強(qiáng)的免疫原性。真皮層內(nèi)有高濃度的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），通過捕獲和呈遞抗原來誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)。此外，真皮層還有豐富的淋巴和血管。皮內(nèi)接種后，DC吞噬抗原被激活，這些活化的細(xì)胞遷移到淋巴結(jié)，從而依次激活B淋巴細(xì)胞。疫苗誘導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)可吸引炎性細(xì)胞，這些細(xì)胞可分化為DC和巨噬細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答。因此，無針皮內(nèi)免疫反應(yīng)過程可能比有針肌肉注射疫苗免疫反應(yīng)更快、更安全有效[16-17]。與有針注射相比，無針注射產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況持平或更強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)更高水平的抗體滴度和血清抗體轉(zhuǎn)換率。同時(shí)，相比有針注射器注射疫苗后在組織中形成球形液體，無針注射器注射的疫苗形成的高壓射流，在組織中分散較好，無針注射技術(shù)在大規(guī)模免疫接種領(lǐng)域可以發(fā)揮更大作用[18-19]。

本試驗(yàn)無針免疫后動(dòng)物的耐受、自發(fā)活動(dòng)、精神狀態(tài)、飲食飲水等均未見異常。與有針注射組動(dòng)物比較，無針注射低劑量組動(dòng)物試驗(yàn)期間體質(zhì)量增加量和日均增重量均有所提高，反映出無針免疫相對有針注射造成的免疫應(yīng)激更小，無針注射的免疫方式更加安全可靠，減量免疫即可達(dá)到同等免疫效果，可以縮短免疫時(shí)間，便捷操作，同時(shí)可以節(jié)約免疫成本，有效促進(jìn)仔豬生長。

本試驗(yàn)表明，兩種免疫方式均可達(dá)到理想免疫效果。4組試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)2次免疫后體內(nèi)抗體陽性率均達(dá)到100%，且均可以有效維持到試驗(yàn)結(jié)束。無針免疫低、中劑量組動(dòng)物體內(nèi)抗體響應(yīng)速度及二次免疫后保護(hù)效果與有針注射組動(dòng)物無差異。有針組通過耳后肌肉注射，以球形液滴的形式存在于耳后肌肉組織，分散度欠佳，單次免疫第3周抗體陽性率降為80%，單次免疫抗體維持時(shí)間較短，造成一定階段的風(fēng)險(xiǎn)暴露；無針免疫通過高壓射流使疫苗迅速均勻接種到耳后皮下或皮內(nèi)，迅速激活DC、B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)更高的抗體滴度應(yīng)答和血清抗體轉(zhuǎn)換率，并可以有效維持整個(gè)周期的有效免疫。無針免疫高劑量組動(dòng)物體內(nèi)抗體產(chǎn)生減慢，推測原因可能是由于多次免疫刺激，短時(shí)間4次重復(fù)免疫0.25 mL亞單位疫苗導(dǎo)致短時(shí)高速噴射入動(dòng)物皮下和皮內(nèi)的疫苗聚集，抗原劑量非最適免疫劑量，隨著吸收時(shí)間延長及2次免疫迅速激活抗原識別后，無針注射產(chǎn)生疫苗分散度較高的優(yōu)勢得以體現(xiàn)，同等劑量的疫苗經(jīng)有針和無針兩種方式進(jìn)行2次免疫后，無針注射的動(dòng)物體內(nèi)抗體濃度更高。

綜上所述，采用無針注射器進(jìn)行PCV-2亞單位疫苗接種安全、有效，降低免疫劑量仍可達(dá)到理想的免疫效果，且可以促進(jìn)仔豬生長，實(shí)現(xiàn)全周期保護(hù)。綜合無針注射的免疫方式耗時(shí)短、避免交叉感染等特點(diǎn)，可以推廣為養(yǎng)豬業(yè)相關(guān)疫苗接種的有效方式。試驗(yàn)中每組10頭豬的數(shù)量相對較少，在后續(xù)研究中課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大受試動(dòng)物數(shù)量和研究內(nèi)容，更全面地評估無針免疫效果。