造血器官壞死病病毒M蛋白的可溶性表達(dá)及免疫原性分析

鄭園園，楊延超，李清揚(yáng)，趙寶華

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050700）

傳染性造血器官壞死?。╥nfectious hematopoietic necrosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）引起的一種主要感染鮭、鱒等冷水魚(yú)類的全身性急性傳染病[1]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[2]。自20世紀(jì)80年代在我國(guó)遼寧省本溪市首次報(bào)告該病以來(lái)，該病傳播范圍不斷擴(kuò)大，對(duì)大型魚(yú)類的致死率達(dá)30%，其中對(duì)幼魚(yú)的致死率高達(dá)100%，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)鮭魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3-4]。目前對(duì)于IHNV尚沒(méi)有特定的治療方法，較為常用的預(yù)防措施是接種疫苗[5]。相較于傳統(tǒng)滅活疫苗或減毒疫苗，亞單位疫苗具有更好的安全性和穩(wěn)定性，因此開(kāi)發(fā)或研制高效的抗IHNV抗原及亞單位疫苗對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

IHNV是一種線性單股負(fù)鏈RNA病毒，屬?gòu)棤畈《究疲≧habdoviridae），其編碼的蛋白質(zhì)包括聚合酶蛋白L（polymerase）、非病毒結(jié)構(gòu)蛋白NV（non-virion protein）、糖蛋白G（glycoprotein）、基質(zhì)蛋白M（matrix）、磷酸化蛋白P（phosphoprotein）以及核衣殼蛋白N（nucleprotein）[6]。其中，基質(zhì)蛋白M大小為21～32 kDa，是病毒基因組中最小的一種多功能蛋白，其L區(qū)通過(guò)與宿主蛋白相互作用介導(dǎo)病毒的組裝和出芽。該蛋白對(duì)病毒的致病性極為關(guān)鍵[7]。更有研究[8]表明，用重組IHNV-M蛋白接種虹鱒魚(yú)，可使其產(chǎn)生高水平的特異性IgM抗體，以抵抗IHNV的感染，因而基質(zhì)蛋白M有望成為抗IHNV疫苗研制的新抗原。因此，對(duì)IHNV-M蛋白可溶性表達(dá)的研究顯得尤為重要，這將為IHNV-M蛋白疫苗的成功研制奠定基礎(chǔ)。

M蛋白是IHNV內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，其疏水性遠(yuǎn)大于親水性，因此M蛋白往往以包涵體的形式表達(dá)[9]。要恢復(fù)蛋白生物活性，包涵體蛋白必須經(jīng)過(guò)十分復(fù)雜的變性、復(fù)性操作，而且其復(fù)性效率較低，這大大增加了外源蛋白在大腸桿菌體系中的制備難度[10]。朱玲等[11]將pET-32a用于M蛋白表達(dá)系統(tǒng)，雖實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的大量表達(dá)，但復(fù)性劑濃度的突變影響了活性蛋白回收效率，降低了目的蛋白含量。為克服上述不足，本研究利用麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）與IHNV-M蛋白融合表達(dá)高效獲得了重組MBP-M蛋白。其中，MBP被認(rèn)為是一種“保持酶”，它通過(guò)阻止融合蛋白的聚集而起到促使目標(biāo)蛋白高效可溶性表達(dá)的作用。因此，就提高融合蛋白的溶解性而言，MBP標(biāo)簽是最佳選擇[12]。更有研究[13]顯示，MBP標(biāo)簽對(duì)外源蛋白的生物活性或結(jié)構(gòu)影響最小，可增強(qiáng)融合蛋白的免疫反應(yīng)。目前MBP標(biāo)簽已在一些疏水性蛋白的重組表達(dá)中得以應(yīng)用。例如，有研究[14]將人黏蛋白1（MUC1）與MBP融合表達(dá)，獲得了高純度的可溶性MUC1-MBP蛋白，其可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答且具有較強(qiáng)的免疫原性。

本研究采用MBP標(biāo)簽與IHNV-M蛋白融合表達(dá)策略，通過(guò)構(gòu)建重組菌株pMAL-c2x-m/BL21（DE3），致力于實(shí)現(xiàn)IHNV-M在大腸桿菌BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)，并純化出可溶性目的蛋白，分析檢測(cè)其免疫學(xué)活性，為抗IHNV-M亞單位疫苗研制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），購(gòu)自博邁德生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pMAL-c2x，保存于本實(shí)驗(yàn)室；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、2×Super Pfx MasterMix，購(gòu)自康為世紀(jì)試劑有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶（EcoRI、BamHI、T4 DNA），購(gòu)自TaKaRa生物公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自北京天根生物有限科技公司；SDSPAGE凝膠快速制備試劑盒，購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；MBP標(biāo)簽兔單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG及HRP山羊抗鼠IgG，均購(gòu)自Immunoway Biotechnology 公司；MBP預(yù)裝柱，購(gòu)自NEB公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

4～5周齡雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自恒容生物科技（天津）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中IHNVm基因序列（登錄號(hào)：AB231685），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端分別加上酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI的堿基序列（表1下劃線所示），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.3.2 目的基因獲取 IHNVm基因由安徽通用生物有限公司合成，以合成的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×super pfx MasterMix 25.0 μL，上游引物和下游引物各2.5 μL（10 μmol/L），模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的基因備用。

1.3.3 重組表達(dá)載體pMAL-c2x-m構(gòu)建 將回收的目的基因和pMAL-c2x質(zhì)粒雙酶切，使其分別具有相同的EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn)。酶切產(chǎn)物切膠回收后加入T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至金唯智基因公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主BL21（DE3）中，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.4 MBP-M 融合蛋白初步誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析鑒定 將重組菌株pMAL-c2x-m/BL21、轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的BL21（DE3），用接種環(huán)挑取單克隆轉(zhuǎn)入10 mL LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜；次日取1 mL菌液于100 mL LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌液D600nm約為0.6時(shí)，將菌液分裝至50 mL錐形瓶中各25 mL，加入終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h；將誘導(dǎo)后的菌液離心收集菌體，并將菌體重新懸浮在10 mL重懸裂解液（10 mmol/L的Tris-HCl，0.1%的巰基還原劑，pH 8.0）中，超聲裂解30 min；向分別取得的裂解液上清、裂解液沉淀中加入4×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min后，用10%的SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.3.5 MBP-M融合蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺陷，其表達(dá)的蛋白通常易形成不溶性的包涵體，且不溶性蛋白活性較可溶性蛋白活性低，因此為提高M(jìn)BP-M融合蛋白在上清的表達(dá)量，對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了一定優(yōu)化。取1.5 mL活化好的重組菌液于150 mL LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌液D600nm約為 0.6時(shí)，將菌液分裝到50 mL錐形瓶中各25 mL，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG。將分裝的菌液按照不同溫度在搖床振蕩一定時(shí)間。當(dāng)溫度為20、25 ℃時(shí)，分別振蕩12、20 h；當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，分別振蕩6、12 h；將誘導(dǎo)后的菌液離心，用重懸裂解液重懸并超聲裂解，分別取裂解液上清、裂解液沉淀制樣，最后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.6 MBP-M 融合蛋白純化 以1%的比例將活化的重組菌液擴(kuò)培到100 mL LB（含 Amp）液體培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min 培養(yǎng)12 h，離心收集菌體；用10 mL重懸裂解液重懸后超聲破碎30 min，離心收集上清，用麥芽糖結(jié)合預(yù)裝柱純化。利用洗滌緩沖液（10 mmol/L的Tris-HCl，0.1%的Triton100，pH 8.0）去除雜蛋白，收集流穿液；通過(guò)洗脫緩沖液（10 mmol/L的Tris-HCl，10 mmol/L麥芽糖，pH 8.0）洗脫并收集目的蛋白。利用SDS-PAGE分析目的蛋白純度，利用BCA（Bicinchoninic acid）法檢測(cè)其濃度。

1.3.7 MBP-M融合蛋白鑒定

1.3.7.1 Western blot驗(yàn)證 將純化的MBP-M融合蛋白及MBP標(biāo)簽蛋白通過(guò)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，加封閉液（1×TBST，5%脫脂奶粉），4 ℃封閉過(guò)夜；用1×TBST洗滌4次后，加入1:10 000稀釋的兔抗MBP標(biāo)簽，室溫孵育2 h；洗滌后，加入1:15 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；利用1×TBST 洗滌4次，每次5 min，加入顯色液顯色分析。

1.3.7.2 DDA鑒定 利用DDA（data dependent acquisition）對(duì)融合蛋白一級(jí)質(zhì)譜中豐度最高的子離子進(jìn)行采集、檢測(cè)[15]，將結(jié)果與MBP-M融合蛋白的多肽序列進(jìn)行比對(duì)、分析。

1.3.8 動(dòng)物免疫與鼠抗血清制備 取健康BALB/c小鼠16 只，隨機(jī)分成4組，每組4只，分別為MBP-M融合蛋白免疫組、MBP蛋白免疫組、PBS對(duì)照組、正常組。上述純化的蛋白與弗氏完全佐劑或非完全佐劑混合后得到穩(wěn)定的油包水乳劑，將其免疫BALB/c小鼠，注射抗原（MBP-M融合蛋白、MBP蛋白、PBS）梯度分別為50、100、150、200 μg/只，完全佐劑或非完全佐劑與注射抗原體積比為1:1。免疫時(shí)間為1～4周，共4次，初免采用弗氏完全佐劑，初免后為弗氏非完全佐劑。每次于小鼠腹股溝皮下注射相應(yīng)抗原和佐劑，最后一次免疫后7 d進(jìn)行眼球取血，離心取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9 MBP-M融合蛋白免疫原性檢測(cè)及效價(jià)

1.3.9.1 Western blot檢測(cè) 將MBP-M融合蛋白、MBP蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，以PBS為對(duì)照組，將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，將制得的鼠抗血清以封閉液1:5 000稀釋后作為一抗，以封閉液1:15 000稀釋的 HRP山羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)顯色液顯色后分析，檢測(cè)鼠抗血清的反應(yīng)原性。

1.3.9.2 效價(jià)測(cè)定 將MBP-M融合蛋白稀釋至25 mg/L，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37 ℃包被過(guò)夜；1×TBST洗滌后，加封閉液，37 ℃封閉2 h；洗滌后，待檢血清用封閉液稀釋加入96孔板，稀釋倍數(shù)依次為1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200、102 400、204 800倍，37 ℃孵1 h，PBS組為對(duì)照組；洗滌后，加入二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；加入顯色液TMB，100 μL/孔，37 ℃避光 孵育15 min；加2 mol/L H2SO4終止液，50 μL/孔；最后酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品D450nm值，若P/N≥2.1為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMAL-c2x-m重組質(zhì)粒構(gòu)建

經(jīng)凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增得到的單一DNA條帶，片段大小約600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1-A）。將pMAL-c2x-m重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，對(duì)其進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小約為600 bp（圖1-B），與IHNVm基因大小一致，將驗(yàn)證正確的菌株命名為pMAL-c2x-m/BL21。

圖1 IHNV m基因PCR擴(kuò)增及pMAL-c2x-m重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證結(jié)果

2.2 MBP-M融合蛋白初步誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組菌pMAL-c2x-m/BL21在16 ℃，IPTG終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L條件下，誘導(dǎo)20 h，對(duì)照為轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的BL21。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖2）顯示，MBP-M融合蛋白以可溶形式存在于細(xì)胞裂解液上清中，隨著IPTG濃度的升高，目的蛋白表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)IPTG 濃度為0.5 mmol/L 時(shí)，目的蛋白在上清的表達(dá)量較高，因此選用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

圖2 MBP-M 融合蛋白的初步誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

2.3 MBP-M融合蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

取不同誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞破碎液上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果（圖3）顯示：當(dāng)D600nm=0.6，誘導(dǎo)溫度為25 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)，MBP-M融合蛋白在上清的表達(dá)量較高，因此將其作為最佳誘導(dǎo)條件。

圖3 不同誘導(dǎo)條件樣品的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

2.4 MBP-M融合蛋白純化

重組菌pMAL-c2x-m/BL21按照優(yōu)化的條件誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體并超聲破碎，利用MBP親和層析柱純化收集上清，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)流穿、洗滌和洗脫的蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）顯示，在64 kDa處成功表達(dá)了與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致的MBP-M融合蛋白。

圖4 MBP-M 融合蛋白的純化結(jié)果

2.5 MBP-M融合蛋白鑒定

2.5.1 Western blot分析 將純化的MBP-M及MBP蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，經(jīng)Western blot分析。結(jié)果顯示：MBP-M融合蛋白在64 kDa處有特異性條帶，表明其表達(dá)成功，且與抗MBP標(biāo)簽具有良好的反應(yīng)原性（圖5-A）；MBP蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小約50 kDa，同樣與抗MBP標(biāo)簽有良好免疫反應(yīng)（圖5-B）。

圖5 純化MBP-M及MBP蛋白的Western blot分析結(jié)果

2.5.2 DDA比對(duì)分析 通過(guò)對(duì)MBP-M融合蛋白的多肽序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)約90%為目的蛋白MBP-M（圖6）。

圖6 純化后MBP-M融合蛋白多肽的序列對(duì)比結(jié)果

2.6 MBP-M融合蛋白免疫原性及效價(jià)檢測(cè)

2.6.1 Western blot檢測(cè) 經(jīng)Western blot分析，鼠抗血清與MBP-M融合蛋白、MBP蛋白在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，而與PBS反應(yīng)則未出現(xiàn)條帶（圖7），表明純化的MBP-M融合蛋白誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)。

圖7 MBP-M融合蛋白Western blot（陽(yáng)性血清）鑒定結(jié)果

2.6.2 效價(jià)檢測(cè) 通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)BALB/c小鼠4次免疫后的血清效價(jià)，發(fā)現(xiàn)鼠抗血清效價(jià)可達(dá) 1:25 600（圖8）。

圖8 鼠抗MBP-M融合蛋白血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3 討論

IHNV毒力強(qiáng)、傳播快，嚴(yán)重威脅著鮭魚(yú)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。而研發(fā)具有較強(qiáng)免疫原性的亞單位疫苗是阻斷該病毒傳播的有效手段[16]。相較于核酸疫苗和病毒載體疫苗而言，去除病原核酸及其有害成分的亞單位疫苗，避免了抗原間的競(jìng)爭(zhēng)，免疫效果強(qiáng)，安全性高。研究[17]表明，IHNV-M 蛋白可下調(diào)病毒的復(fù)制，抑制相關(guān)免疫基因的表達(dá)水平，對(duì)病毒的致病力有重要影響。因此M蛋白可作為抗IHNV亞單位疫苗的候選靶抗原。但目前，通過(guò)原核表達(dá)獲得的M蛋白多以包涵體形式存在，大多數(shù)包涵體蛋白經(jīng)復(fù)性后對(duì)其功能造成一定影響[18]。

本研究利用大腸桿菌MBP融合表達(dá)了純度大于90%的MBP-M 融合蛋白。此外，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間，提高了蛋白表達(dá)量和可溶性表達(dá)比例。用純化后的MBP-M蛋白聯(lián)合佐劑免疫小鼠，通過(guò)對(duì)免疫后產(chǎn)生的特異性鼠抗血清分析，發(fā)現(xiàn)IHNV-M蛋白具有較好的免疫原性。因此，本研究獲得的MBP-M蛋白具有可溶性表達(dá)量高、免疫原性強(qiáng)、純化難度低等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，本研究解決了M蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的難題，實(shí)現(xiàn)了IHNV-M的可溶性高效表達(dá)，且獲得的MBP-M融合蛋白具有較強(qiáng)免疫原性，為開(kāi)發(fā)新型抗IHNV亞單位疫苗提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。