富集纖維素降解菌群過(guò)程中微生物群落多樣性分析

王彥偉，祝其麗，吳 波，譚芙蓉，胡國(guó)全，何明雄，高立洪

(1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所 秸稈資源化利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，四川 成都 610041；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用技術(shù)與設(shè)備研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404100)

木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量最大的可再生的生物質(zhì)資源，但木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，使其難以快速被微生物降解，這便限制了纖維素資源化的有效利用[1-3]。獲得能高效轉(zhuǎn)化纖維素的微生物是纖維素資源高值化利用的基礎(chǔ)。利用微生物共培養(yǎng)(復(fù)合菌系)進(jìn)行纖維素降解與生物轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)其高值化利用的有效途徑。實(shí)現(xiàn)纖維素廢棄物的高效利用，已成為緩解能源緊張、提高環(huán)境質(zhì)量、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的有效方法[4-5]。但微生物共培養(yǎng)體系復(fù)雜，不同種類的微生物如何在共培養(yǎng)體系發(fā)揮作用，仍然是急需解析的問(wèn)題之一。

微生物在自然界中的纖維素降解中起主要作用，纖維素降解微生物很容易在不同的生境中找到，如土壤、農(nóng)業(yè)廢棄物、昆蟲內(nèi)臟、糞便和反芻動(dòng)物的瘤胃等[6]。瘤胃是一種具有多種微生物種群的天然纖維素降解系統(tǒng)，通過(guò)微生物相互作用降解纖維素材料[7]。Xing[8]等報(bào)道牛瘤胃微生物促進(jìn)小麥秸稈生物降解了96%～97% 的纖維素和半纖維素。Li[9]等在瘤中發(fā)現(xiàn)2個(gè)微生物組可以促進(jìn)青儲(chǔ)秸稈糖的轉(zhuǎn)化。但是利用單一菌株進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解時(shí)，由于底物抑制和反饋抑制作用的存在，使得木質(zhì)纖維素降解水平低下[10-12]。近些年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)混合的菌群對(duì)復(fù)雜的有機(jī)污染物及天然難降解物質(zhì)如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴和合成燃料等有較強(qiáng)的降解能力[13-15]。大多數(shù)情況下，多菌的降解能力都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單菌，因而纖維素降解復(fù)合菌系已越來(lái)越受到人們的重視。

復(fù)合菌系降解木質(zhì)纖維素時(shí)能夠避免單一菌株降解時(shí)產(chǎn)生的底物抑制和反饋抑制作用，因產(chǎn)酶更加多樣，從而能夠有效地降解木質(zhì)纖維素。Kato[16]等通過(guò)研究復(fù)合菌系中主要菌株間的關(guān)系，從中分離主要菌株，并將厭氧的纖維素降解菌和好氧的非纖維素降解菌株組合在一起，發(fā)現(xiàn)非纖維素降解菌對(duì)纖維素降解起了非常重要的作用。本研究以連續(xù)傳代的纖維素降解復(fù)合菌系為研究對(duì)象，利用16S rRNA 及ITS基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序方法，分析不同傳代復(fù)合菌系降解纖維素過(guò)程中各微生物分類單元的群落組成及其相對(duì)豐度變化，探究復(fù)合菌系群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

接種物：取自四川省金堂縣農(nóng)村合作社新鮮屠宰的山羊瘤胃內(nèi)溶物，4℃保存于無(wú)菌的血清瓶中。配制赫奇遜無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g·L-1)：KH2PO41.0，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.3，NaNO32.5，F(xiàn)eCl30.001，CaCl20.1，pH值7.2。DNeasy Power Soil Kit。

1.2 樣品的傳代培養(yǎng)

以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，配制赫奇遜無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，裝液量為40%(體積比)，1×105Pa、121℃滅菌15 min。接種底物為瘤胃內(nèi)溶物，接種量為10%(體積比)，30℃ 150 rmp·min-1搖床培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)，每隔6 d傳一代，共傳代20次，每一代取樣保存至-80℃冰箱。

1.3 微生物組總DNA提取

選取20次樣品中的10個(gè)樣品，包含第一代及最后一代編號(hào)C1-C10，采用TIANamp公司的DNeasy PowerSoilKit進(jìn)行抽提，采用熒光分光光度計(jì)(Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090)，在260 nm和280 nm處分別測(cè)定DNA的吸光值，檢測(cè)DNA的濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。調(diào)整DNA溶液濃度，DNA工作液保存于4℃，儲(chǔ)存液保存于-20℃。

1.4 PCR擴(kuò)增

以上述DNA 為模板，利用引物對(duì)各樣品基因組DNA V3～V4 區(qū)域及真菌ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將反應(yīng)體系置于ABI Gene Amp?9700 型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(購(gòu)于Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量。利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit 回收純化PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建16S rRNA文庫(kù)及ITS文庫(kù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先對(duì)高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步質(zhì)量篩查；通過(guò)質(zhì)量初篩的序列按照引物和Barcode信息，識(shí)別分配入對(duì)應(yīng)樣品，并去除嵌合體等疑問(wèn)序列；對(duì)獲得的序列進(jìn)行OTU歸并劃分，每個(gè)OTU的代表序列用于分類地位鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析；根據(jù)OTU在不同樣品中的豐度分布，評(píng)估每個(gè)樣品的多樣性水平，并通過(guò)稀疏曲線反映測(cè)序深度是否達(dá)標(biāo)；對(duì)各樣品(組)在不同分類水平的具體組成進(jìn)行分析(并檢驗(yàn)組間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)；通過(guò)多種多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具，進(jìn)一步衡量不同樣品(組)間的菌群結(jié)構(gòu)差異及與差異相關(guān)的物種；根據(jù)物種在各樣品中的組成分布，構(gòu)建互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；根據(jù)16S rRNA及ITS基因測(cè)序結(jié)果，預(yù)測(cè)各樣品的菌群代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序量

對(duì)10個(gè)連續(xù)傳代樣品中細(xì)菌16S rRNA序列測(cè)定，獲得序列量在53885～67722之間，經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量、減噪等方法過(guò)濾，每個(gè)樣品的有效序列在46442～59133條，平均測(cè)序覆蓋率為99.2%。堿基長(zhǎng)度分布于400～450之間。10個(gè)樣品的真菌ITS序列測(cè)定序列量在 78340～97643之間，經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量、減噪等方法過(guò)濾后，每個(gè)樣品的有效序列在71456～89874條，平均測(cè)序覆蓋率為99.6%。堿基長(zhǎng)度分布于100～300之間。

2.2 樣品OUT分布情況

10個(gè)樣品中細(xì)菌屬水平測(cè)序比對(duì)結(jié)果豐富，其中樣品OUT比對(duì)結(jié)果在262～535個(gè)屬，隨著傳代次數(shù)增多，樣品中細(xì)菌屬逐漸減少，其中樣品C1(第1代)測(cè)序?qū)僮疃噙_(dá)到535，樣品C8(第16代)測(cè)序?qū)僮钌?09可比對(duì)屬，隨著傳代進(jìn)行C8，C9，C10復(fù)合系逐漸穩(wěn)定，細(xì)菌構(gòu)建完成(見圖1)。10個(gè)樣品中真菌種水平序列比對(duì)結(jié)果豐富，其中OUT比對(duì)結(jié)果在96～139個(gè)種之間，隨著傳代次數(shù)增多，樣品中真菌種逐漸增多，C10樣品測(cè)序?qū)俜N達(dá)到139個(gè)。C2樣品中可比對(duì)種最少為96個(gè)。樣品中真菌的可比對(duì)序列與細(xì)菌變化趨勢(shì)不同(見圖2)。

圖1 細(xì)菌OTU分布

圖2 真菌OTU分布

2.3 細(xì)菌，真菌群落豐富度和多樣性的影響

為了能較為全面的評(píng)估10個(gè)傳代樣品中微生物群落的Alpha多樣性，表1反映了10個(gè)樣品的多樣性差異，在細(xì)菌群落多樣性分析中，傳代后期樣品C8，C9，C10的 Chao1及Observed species數(shù)值較小，表明豐富度較前7代樣品差異顯著，后期傳代樣品C8的Shannon和Simpson數(shù)值較小，多樣性較其他樣品差異顯著，C8樣品的Pielou’s e指數(shù)小，樣品的均勻度較其他樣品差異顯著。前期樣品的細(xì)菌豐富度、多樣性及均勻度均好于后期傳代樣品。真菌多樣性分析中，前期傳代樣品C1，C2及C3的Chao1及Observed species數(shù)值較小，表明豐富度較后7代樣品差異顯著。樣品C10的Shannon和Simpson數(shù)值較小，多樣性較其他樣品差異顯著。C10樣品的Pielou’s e指數(shù)小，樣品的均勻度較其他樣品差異顯著，真菌群落多樣性分析中，前期傳代樣品中的豐富度較差，但是樣品的多樣性及均勻性高于后期傳代樣品。富集樣品的前期豐度較高，后期變少，可能是部分菌群在富集篩選過(guò)程中退化，作用降低，優(yōu)勢(shì)菌群增加，豐度降低。

表1 樣品Alpha多樣性指數(shù)表

2.4 傳代樣品的微生物群落組成分析

對(duì)各個(gè)物種的組內(nèi)樣品豐度值進(jìn)行歸一化后，再求樣品平均值，分析10個(gè)細(xì)菌屬水平，所展示樣品前20的細(xì)菌屬如圖3，10個(gè)樣品中各種屬展示如下。德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)占13%，纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)占12%，異根瘤菌屬(Allorhizobium)-新根瘤菌屬(Neorhizobium)-副根瘤菌屬(Pararhizobium)-根瘤菌屬(Rhizobium)占4%。在前期樣品(C1)中鏈霉菌屬(Streptomycessp.)大量存在，這可能與瘤胃液的微生物類群相關(guān)，隨著傳代的進(jìn)行，德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)、纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。其中在后期傳代樣品(C7)中纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)、砂單胞菌屬(Arenimonassp.)占據(jù)了優(yōu)勢(shì)地位，有別于其他后期樣品。C8、C9和C10樣品中群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明：厚壁菌門中的種屬占優(yōu)勢(shì)地位，這和報(bào)道中的瘤胃微生物相似，牛瘤胃中厚壁菌門也是秸稈降解的優(yōu)勢(shì)種群[17-18]，同時(shí)在測(cè)序分析中仍然有大量的微生物未被鑒定到屬。已有的研究也表明：自然資源中仍然有許多未被發(fā)現(xiàn)的微生物，可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖3 樣品細(xì)菌屬分類水平物種組成

對(duì)各個(gè)物種的組內(nèi)樣品豐度值進(jìn)行歸一化后，再求樣品平均值，分析10個(gè)樣品真菌屬水平，所展示樣品前20的真菌屬如圖4所示，其中曲霉屬(Aspergillussp.)占8%，古根霉屬(Archaeorhizomycessp.)占6%，被孢霉屬(Mortierellasp.)占3%等。未鑒定到屬分類的真菌菌屬占比最高，大量的未培養(yǎng)的真菌仍然需要進(jìn)一步挖掘。

圖4 樣品真菌屬分類水平物種組成

2.5 組間差異

為了比較樣品間的物種組成差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)各樣品的物種豐度分布趨勢(shì)的展示，研究中，使用屬水平的分類單元組成作為分析對(duì)象，使用平均豐度前50位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。細(xì)菌屬熱圖分析不同樣品的差異較為顯著，不同傳代樣品之間優(yōu)勢(shì)種群存在顯著差異，纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)和 砂單胞菌屬(Arenimonassp.)僅在C7樣品中較為豐富，纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)和假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)在C4、C9、C10樣品中較為豐富，在C1、C2、C3樣品中Pseudomonassp屬占有優(yōu)勢(shì)，但隨著傳代的進(jìn)行，在后面的傳代樣品中，逐漸被其他優(yōu)勢(shì)菌群替代。類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)和 戈馬單胞菌屬(Gommatimonassp.)僅在C2中占有優(yōu)勢(shì)。德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)和獨(dú)島桿菌屬(Dokdonellasp.)分別在C6、C9、C10樣品中顯示為優(yōu)勢(shì)菌屬。熱圖分析顯示隨著傳代的進(jìn)行，樣品中的細(xì)菌微生物群落逐漸改變，優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化，樣品中的群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

為了比較樣品間的物種組成差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)各樣品的物種豐度分布趨勢(shì)的展示，研究中，使用屬水平的分類單元組成作為分析對(duì)象，使用平均豐度前50位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。真菌屬熱圖分析表明不同樣品的差異較為顯著，C10樣品中僅存在曲霉屬(Aspergillussp.)優(yōu)勢(shì)種群。C1、C2、C3、C4、C5樣品中優(yōu)勢(shì)菌種較多，分別是Lactiflcussp.、peniollumsp.、紅酵母菌屬(Rhodotorulasp.)、Llyonectriasp.、附球菌屬(Epicoccumsp.)、星裂盤菌屬(phacidiumsp.)。C7，C9樣品中優(yōu)勢(shì)菌群未被發(fā)掘，在C8樣品中黑團(tuán)胞屬(Periconiasp.)占有優(yōu)勢(shì)。

圖5 細(xì)菌屬水平hotmap 分析

圖6 真菌屬水平heatmap分析

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq 技術(shù)對(duì)連續(xù)傳代的復(fù)合系樣品的群落進(jìn)行高通量測(cè)序，組間差異性分析顯示不同傳代樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，細(xì)菌，真菌熱圖分析表明不同傳代樣品中的細(xì)菌，真菌的優(yōu)勢(shì)菌群不同，前期傳代樣品(C1，C2，C3，C4和C5)中的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、生孢噬纖維菌屬(Sporocytophagasp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)，gemmatatimonassp.、短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)、無(wú)色桿菌屬(Achromobactersp.)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobiumsp.)、鞘氨醇菌屬(Chitinophagasp.)等優(yōu)勢(shì)種屬逐漸消失，前期傳代樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬逐漸被后期傳代樣品中的獨(dú)島桿菌屬(Dokdonellasp.)、纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)等取代，前期傳代樣品(C1，C2，C3，C4，C5)中優(yōu)勢(shì)真菌Lactifluussp.、青霉屬(Peniollumsp.)、llyonectriasp.等被黑團(tuán)胞屬(Periconiasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)取代。以CMCNa為唯一碳源連續(xù)富集、限制性培養(yǎng)過(guò)程中，菌群結(jié)構(gòu)一直處于變化的狀態(tài)，使隨機(jī)性過(guò)程增加。后期傳代樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌纖維弧菌屬(Cellvibriosp.)和假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonassp.)都被報(bào)道過(guò)具有纖維素降解能力的菌屬[19-22]，這類菌屬的保留，可能與其具有木質(zhì)纖維素分解功能的或者輔助降解纖維素功能有關(guān)。測(cè)序結(jié)果分析表明復(fù)合菌系中存在與纖維素降解有直接關(guān)系的菌，也存在可能有未知的功能，或者因適應(yīng)培養(yǎng)基選擇并保留，也可能在接下來(lái)的傳代培養(yǎng)中被“淘汰”。

通過(guò)分析10個(gè)樣品中的OUT分類，在細(xì)菌分類中unclassified_Microbacteriaceae，德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)和纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)3種類型的種屬占比較高，其中德沃斯氏菌屬(Devosiasp.)被報(bào)道過(guò)存在于污泥秸稈堆肥體系、棉花秸稈堆肥體系和秸稈還田的土壤等不同的秸稈降解體系中[23-24]，其在秸稈降解復(fù)合菌系中發(fā)揮著重要的作用。纖維單胞菌屬(Cellulomonassp.)[25-26]是細(xì)菌屬中纖維素酶活力較強(qiáng)的菌株，該菌屬可通過(guò)分泌幾種胞外纖維素酶對(duì)秸稈進(jìn)行水解，在細(xì)菌纖維素降解過(guò)程中有重要的研究意義。在真菌OUT分類中unclassified_fungi(49%)，未鑒定到屬的真菌占大部分，其作用有待于進(jìn)一步解析。Aspergillussp.(8%)[27-28]及古根霉屬(Archaeorhizomycessp.)占6%[29-30]都具備降解纖維素的能力，在秸稈堆肥富集物中都被監(jiān)測(cè)到是優(yōu)勢(shì)菌群，被孢霉屬(Mortierellasp)占3%在復(fù)合系中的作用不明。在自然環(huán)境中，木質(zhì)纖維素的降解是多種微生物共同作用的結(jié)晶，纖維素的徹底降解是通過(guò)多種微生物長(zhǎng)時(shí)間相互作用的結(jié)果。對(duì)于純培養(yǎng)的單菌，不論是細(xì)菌還是真菌，很少有明確報(bào)道表明單菌具有較強(qiáng)的天然木質(zhì)纖維素分解能力。

以CMCNa為底物富集纖維素降解菌系，測(cè)序分析表明復(fù)合系中存在大量的纖維素降解菌，在選擇性底物的作用下，特定的微生物得到了富集，但是連續(xù)傳代的樣品并沒(méi)有獲得穩(wěn)定的復(fù)合系，這可能和培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基組成等有關(guān)。要想獲得穩(wěn)定的復(fù)合系，還需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件等。