人工組合復(fù)合菌系分解木質(zhì)纖維素特征研究

楊夢(mèng)雅 王云龍 安曉雅 張立強(qiáng) 陳 迪 樸仁哲 崔宗均 趙洪顏*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133001； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

木質(zhì)纖維素是植物的重要組成部分，在自然界中含量豐富，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定，使得木質(zhì)纖維素難以被直接工業(yè)化利用。已有研究從自然界中篩選出很多高效的木質(zhì)纖維素降解菌種，如里氏木霉(

Trichoderma

reesei

)、綠色木霉(

T.

viride

)、梭菌(

Clostridium

)、芽孢桿菌(

Bacillus

sp

.

)等。雖然這些菌種在實(shí)驗(yàn)室條件下，能夠表現(xiàn)出較好的纖維素分解能力，但是，在自然環(huán)境條件下，單一菌株對(duì)木質(zhì)纖維素的降解效果普遍不能令人滿意。

近年研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)纖維素的降解有很好的效果，并且都高于單一菌株的生物降解效率。研究表明在自然環(huán)境中，木質(zhì)纖維素的腐解過(guò)程也是復(fù)合菌系協(xié)同作用的結(jié)果。有關(guān)研究也證明了復(fù)合菌系的高效性，崔宗均等培養(yǎng)的纖維素分解復(fù)合菌系MC1，8～10 d對(duì)水稻秸稈的分解率可以達(dá)到99%;王新光等構(gòu)建的復(fù)合菌系對(duì)秸稈的降解率最高達(dá)到63.6%顯著高于單菌株；曹燕篆等篩選出的復(fù)合菌系PSD在6 d內(nèi)對(duì)纖維素的分解率達(dá)到72%；Vu等篩選的復(fù)合菌系能夠顯著提升纖維素降解酶的活性；Dash等培養(yǎng)的復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)素的降解率最高能夠達(dá)到60%；Srivastava等構(gòu)建的SNH-1可以使秸稈糖化率提高23%。雖然已從自然環(huán)境中篩選出一些高效的復(fù)合菌系，但是因?yàn)閺?fù)合菌系的菌落組成多樣，并且木質(zhì)纖維素的生物降解過(guò)程較為復(fù)雜，這給復(fù)合菌系理化特性研究帶來(lái)挑戰(zhàn)。

天然復(fù)合菌系PLC-8是本研究團(tuán)隊(duì)從腐葉土中提取，并經(jīng)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)得到的穩(wěn)定復(fù)合菌系，它能夠在20 ℃條件下保持較高的木質(zhì)纖維素分解能力，30 d對(duì)玉米秸稈的降解率為43.65%，但是因?yàn)槠渚浣M成較為復(fù)雜，我們沒(méi)有完全探明其分解木質(zhì)纖維素的機(jī)理。

目前有關(guān)木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的研究，多數(shù)著重于木質(zhì)纖維素的分解效率，對(duì)人工組合復(fù)合菌系的可行性以及復(fù)合菌系微生物群落動(dòng)態(tài)方面的研究較少，因此，本研究首先對(duì)天然復(fù)合菌系PLC-8進(jìn)行簡(jiǎn)化隨后進(jìn)行人工組合，利用多種方法分離篩選有明顯分解效果的菌株，隨后組合成3種復(fù)合菌系，即復(fù)合真菌、復(fù)合細(xì)菌、真菌與細(xì)菌混合菌系，在3種復(fù)合菌系分解木質(zhì)纖維素過(guò)程中，分別測(cè)定其理化指標(biāo)以及微生物的群落動(dòng)態(tài)變化，比較其分解木質(zhì)纖維素效率的差異，并分析真菌與細(xì)菌在分解過(guò)程中的協(xié)同作用，以及真菌與細(xì)菌共培養(yǎng)所表現(xiàn)出的拮抗與共存過(guò)程的演變，以期為復(fù)合菌系及其人工組合相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

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1

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1

試驗(yàn)試劑

選用改良察氏培養(yǎng)基。主要成分有：分析純KHPO1.00 g、MgSO·7HO 0.50 g、(NH)SO1.00 g、FeSO·7HO 0.01 g、KCl 0.50 g、NaNO1.00 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.2。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 5.00 g、瓊脂15.00 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯粉6.00 g、葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 15.00 g，NHNO1.00 g、酵母膏1.00 g，MgSO·7HO 0.50 g、KHPO1.00 g、蒸餾水1 000 mL。

蛋白胨纖維素培養(yǎng)基：蛋白胨5.00 g、纖維素粉5.00 g、NaCl 5.00 g、CaCO2.00 g、酵母粉1.00 g。

預(yù)處理后玉米秸稈：將玉米秸稈切成7 cm長(zhǎng)小段，用1.5%的NaOH溶液浸泡24 h，然后用蒸餾水沖洗后浸泡24 h至pH為7.0左右，105 ℃烘干至恒重保存。

本研究所用藥品均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

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1

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2

自然復(fù)合菌系篩選、分離和純化

本研究團(tuán)隊(duì)從常年堆積秸稈的腐葉土中取樣，經(jīng)長(zhǎng)期連續(xù)繼代培養(yǎng)，獲得的在低溫下能分解木質(zhì)纖維素的穩(wěn)定復(fù)合菌系PLC-8。木質(zhì)纖維素降解菌株初篩、復(fù)篩及富集培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[19]和[20]，將PLC-8復(fù)合菌系菌液梯度稀釋，采用平板劃線法分離純化單菌株。利用菌株降解濾紙，選擇濾紙崩解效果較好的菌株用于后續(xù)試驗(yàn)，具體劃分參考路鵬等標(biāo)準(zhǔn)，具體過(guò)程如下：在100 mL錐形瓶中倒入80 mL的改良察氏培養(yǎng)基，并且放入濾紙條(2 cm×7 cm)，濾紙條貼壁放置，將濾紙條部分浸沒(méi)在培養(yǎng)液中，定期觀察濾紙的崩壞情況。

1.2 人工組合菌系的構(gòu)建及理化指標(biāo)的測(cè)定方法

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2

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1

構(gòu)建人工組合菌系

選擇菌株構(gòu)建復(fù)合菌系，編號(hào)為N3、N5、N7、N10、N11、P1、P2。其中P1、P2為真菌，其余為細(xì)菌，具體分組見(jiàn)表1。在20 ℃、180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)。

表1 本研究構(gòu)建的3種復(fù)合菌系
Table 1 Three complex strains constructed in this study

復(fù)合菌系編號(hào)Sample ID菌種組合Combination of strainsF1N3、N5、N7、N10、N11F2P1、P2F3N3、N5、N7、N10、N11、P1、P2

1

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2

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2

pH及有機(jī)酸含量測(cè)定

取樣培養(yǎng)液于2 mL離心管中，12 000/(r/min)離心10 min取上清液與乙腈混合，2次離心，利用0.22 μm孔徑有機(jī)濾膜將溶液過(guò)濾，使用高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測(cè)量有機(jī)酸，色譜柱為HITACHI LaChrom C18-AQ(5 μm)，柱溫25 ℃，波長(zhǎng)210 nm，HSO和NaSO配制溶液作為流動(dòng)相，流速0.2 mL/min，每次進(jìn)樣量10 μL,具體方法參照文獻(xiàn)[18]。

1

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2

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3

總重及纖維素成分含量測(cè)定

采用失重法，將濾紙烘干并記錄重量，將培養(yǎng)液與秸稈用濾紙過(guò)濾并烘干，記錄總重，去除濾紙重即可得到秸稈重量。將秸稈粉碎過(guò)篩，取0.5 g裝入濾袋，利用纖維素分析儀(ANKOM 200i，美國(guó)安卡姆科技公司)測(cè)定木質(zhì)纖維素各成分含量，具體方法參照文獻(xiàn)[22]和[23]。

1

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2

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4

木質(zhì)纖維素分解酶活性測(cè)定

分別以濾紙、CMC-Na、微晶纖維素、水楊苷、燕麥木聚糖為底物，緩沖液為KHPO和KHPO4混合配制。采用IUPAC酶活性測(cè)定方法測(cè)定濾紙酶、內(nèi)切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶酶活性。利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度。

1.3 人工組合菌系微生物的動(dòng)態(tài)變化測(cè)定

使用PCR擴(kuò)增儀(S1000TM Thermal Cycle，美國(guó)Bio-RAD公司)。擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA的V3區(qū)和26S rRNA的D1區(qū)，細(xì)菌采用通用引物對(duì)357F-GC和517R，PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[25]。真菌所用引物為NL1-GC和LS2，反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[24]，具體引物序列見(jiàn)表2。

PCR擴(kuò)增后得到各菌株的基因序列，將所得序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。變性梯度凝膠電泳(DGGE)在DCodeTM Universal Mutation Detection System分析儀(美國(guó)Bio.Rad公司)測(cè)定。

表2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study

引物名稱Primer name序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)357fGCCTACGGGAGGCAGCAG517rATTACCGCGGCTGCTGG357f-GCCGCCCGCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGAGCAGNL1GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGLS2ATTCCCAAACAACTCGACTCNL1-GCCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG

2 結(jié)果與分析

2.1 人工組合菌系系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

真菌P1、P2以及細(xì)菌N3、N5、N7、N10、N11的18S、16S RNA系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1和圖2所示?？赏ㄟ^(guò)綜合分析同源性、可靠性數(shù)值和形態(tài)特征，初步鑒定菌株P(guān)1為漆斑菌屬(

Myrothecium

)；P2為青霉屬(

Penicillium

)；N3為鞘氨醇單胞菌屬(

Sphingomonas

)；N5為黃桿菌屬(

Flavobacte

-

rium

)；N7為紅球菌屬(

Rhodococcus

)；N10為假單胞菌屬(

Pseudomonas

)；N11為貪噬菌屬(

Variovorax

)。

標(biāo)尺為1%序列分歧度。 Scale bar: 1% sequence divergence.圖1 真菌18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of fungal 18S rRNA

2.2 木質(zhì)纖維素分解過(guò)程中的微生物動(dòng)態(tài)變化

3種菌系的DGGE圖譜結(jié)果見(jiàn)圖3。其中圖3(a)為菌系F1、F3的細(xì)菌圖譜，可知條帶1在第15天時(shí)消失，條帶2、3隨著分解過(guò)程的進(jìn)行顏色逐漸變淺，展示這3種條帶所代表的細(xì)菌菌種的生長(zhǎng)受到抑制，并發(fā)生優(yōu)勢(shì)菌種演替現(xiàn)象，說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在分解秸稈時(shí)發(fā)生明顯變化。圖3(b)為菌系F2、F3的真菌圖譜，可知條帶沒(méi)有發(fā)生明顯變化，展示條帶所代表的真菌生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，說(shuō)明真菌群落在分解過(guò)程中保持穩(wěn)定狀態(tài)，沒(méi)有發(fā)生群落結(jié)構(gòu)的變化。

2.3 木質(zhì)纖維素分解過(guò)程中的pH變化

圖4為3種復(fù)合菌系在分解過(guò)程中pH的變化情況?？芍?種復(fù)合菌系的pH變化有顯著的差異：復(fù)合菌系F1的pH保持上升狀態(tài)，沒(méi)有回復(fù)趨勢(shì)；F2的pH保持下降狀態(tài)，沒(méi)有回復(fù)趨勢(shì)；F3的pH最初為7.20，在第10 天下降到6.79，隨后回復(fù)至7.20左右。有關(guān)報(bào)道稱：分解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系在分解過(guò)程中，pH變化基本上都呈現(xiàn)先下降至微酸性，再逐漸回升至微堿性并保持穩(wěn)定的規(guī)律，該規(guī)律是復(fù)合菌系具有正常分解能力的表現(xiàn)。因此證明復(fù)合菌F3具有正常的木質(zhì)纖維素分解能力，以及良好的pH自我調(diào)節(jié)能力。

2.4 木質(zhì)纖維素分解過(guò)程中的揮發(fā)性有機(jī)酸變化

利用液相色譜法檢測(cè)玉米秸稈分解過(guò)程中5種有機(jī)酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)的變化。本研究?jī)H檢測(cè)出甲酸和乙酸，未發(fā)現(xiàn)其他有機(jī)酸，可能是復(fù)合菌系所含菌株具有分解有機(jī)酸的能力，能夠?qū)⒈?、丁酸、乳酸分解成其他產(chǎn)物。由表3可見(jiàn)：F1處理組在第15天時(shí)甲酸含量最高為541.31 mg/L；F2處理組在第20 天時(shí)甲酸含量最高為203.08 mg/L；F3處理組第20天時(shí)甲酸含量最高為548.58 mg/L。F1在第15天時(shí)乙酸含量達(dá)到最高值為58.81 mg/L；F2在第20天時(shí)達(dá)到最高值為59.22 mg/L；F3在第10 天時(shí)達(dá)到最高值為52.05 mg/L。3種復(fù)合菌的甲酸、乙酸含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明3種復(fù)合菌均有不同程度的有機(jī)酸分解能力。

標(biāo)尺：2%序列分歧度。 Scale bar: 2% sequence divergence.圖2 細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA

圖3 DGGE圖譜分析結(jié)果Fig.3 DGGE profile analysis results

圖4 3種復(fù)合菌系分解秸稈過(guò)程中pH的變化Fig.4 Changes in pH during decomposition of straw by three complex strains

表3 3種復(fù)合菌系分解秸稈0～30 d有機(jī)酸變化
Table 3 Changes of organic acid from 0 to 30 d for decomposition of straw by three complex strains mg/L

時(shí)間/dTime甲酸 Formic acid乙酸 Acetic acidF1F2F3F1F2F30281.03±5.13241.63±5.49281.03±5.1351.53±0.0522.10±0.0351.05±0.055355.08±3.94129.61±2.13130.38±1.8054.10±0.0155.30±0.0739.09±0.0110506.65±7.66124.97±1.39155.14±2.5458.51±0.0239.03±0.0152.05±0.0315541.31±4.95153.92±1.63163.21±1.2058.81±0.0815.67±0.0226.92±0.0220424.55±4.36203.08±1.24548.58±8.5555.60±0.0159.22±0.0939.00±0.0225155.53±5.35172.60±2.04219.20±1.0157.74±0.1159.01±0.0239.93±0.0730124.79±3.83157.64±2.33162.77±1.3053.62±0.0359.31±0.1439.81±0.01

2.5 木質(zhì)纖維素分解過(guò)程中的各組分變化

木質(zhì)纖維素分解率如圖5所示?？芍涸谔幚淼?0 天時(shí)，復(fù)合菌系F1處理組的秸稈平均減重為8.19%，半纖維素含量下降12.74%，纖維素含量下降7.3l%，木質(zhì)素含量下降0.76%；F2的秸稈平均減重為26.78%，半纖維素下降41.53%，纖維素下降14.10%，木質(zhì)素下降1.16%；F3秸稈平均減重39.80%，半纖維素下降52.64%，纖維素下降25．8%，木質(zhì)素下降6.26%?？梢?jiàn)F1對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力最弱，F(xiàn)3的分解能力最強(qiáng)，可達(dá)到天然復(fù)合菌系PLC-8降解率的80.00%，因此推斷真菌復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)纖維素的分解效率大于細(xì)菌復(fù)合菌系，并且通過(guò)合理的人工組合能夠大幅度還原自然復(fù)合菌系的分解能力。

2.6 木質(zhì)纖維素分解過(guò)程中的多種酶活性變化

由圖6可知：F3的酶活性與F1、F2有顯著差異，纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶的活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第15 天時(shí)達(dá)到整個(gè)過(guò)程的最高值，分別為0.089 3、0.081 3、0.085 4和0.068 2 U/mL，隨后各種酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能原因是：F3的分解效率相對(duì)于F1、F2高，在第15 天時(shí)就已經(jīng)將可直接分解的纖維素分解完全，酶活性因此達(dá)到最高值，隨著纖維素底物的減少，F(xiàn)3復(fù)合菌轉(zhuǎn)向分解木質(zhì)素等物質(zhì)，導(dǎo)致纖維素相關(guān)酶活性降低。而F1、F2產(chǎn)出酶相對(duì)F3少，纖維素的分解效率低，產(chǎn)生的能量不足，抑制菌系的生命活動(dòng)，導(dǎo)致各種酶活性低于F3。

F1的木聚糖酶活性先上升然后趨于穩(wěn)定，并且酶活性最大值比F3低，推測(cè)原因是F1為細(xì)菌復(fù)合菌系，缺少其他木質(zhì)纖維素分解酶。F2木聚糖酶活性大體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是酶活性達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)間比F3晚，可見(jiàn)真菌相較于細(xì)菌產(chǎn)出酶種類較為全面，但是產(chǎn)酶效率較F3低。F3在第15天酶活性達(dá)到最大值0.114 4 U/mL，在第20 天時(shí)酶活性下降，在25 d后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能是因?yàn)檫@一時(shí)期半纖維素被消耗完全，木聚糖酶活性下降，真菌分解木質(zhì)素類有機(jī)物。因?yàn)槟举|(zhì)素被分解，會(huì)使更多的半纖維素被暴露出來(lái)，木聚糖酶能夠直接分解半纖維素，木聚糖酶活性也逐漸升高。

圖5 3種復(fù)合菌系分解秸稈過(guò)程中木質(zhì)纖維素成分及秸稈總重變化Fig.5 Changes in lignocellulosic composition and total straw weight for decomposition of straw by three complex strains

圖6 3種菌系分解秸稈過(guò)程中木質(zhì)纖維素分解酶變化Fig.6 Changes in lignocellulolytic enzymes for decomposition of straw by three complex strains

3 討 論

相較于從自然環(huán)境中分離出的單菌株，人工組合復(fù)合菌系可以實(shí)現(xiàn)菌株間的協(xié)同作用，從而達(dá)到更高的纖維素分解效率；并且復(fù)合菌系能夠自主調(diào)節(jié)pH，維持相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，解決了單菌株分解木質(zhì)纖維素時(shí)受到產(chǎn)物抑制的問(wèn)題。本研究通過(guò)分離自然復(fù)合菌系的菌株，組合成3種復(fù)合菌系，并測(cè)定3種人工菌系分解木質(zhì)纖維素效率及產(chǎn)酶情況，結(jié)果表明復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)纖維素的分解效果優(yōu)于單菌株，這與已有復(fù)合菌系的研究結(jié)果相似，例如：崔鴻亮構(gòu)建的復(fù)合菌系與其中的單菌株相比分解率提高22.3%；李陽(yáng)陽(yáng)等構(gòu)建的復(fù)合菌系與分解率最高的單菌株相比提高11.2個(gè)百分點(diǎn)；江高飛等研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加菌系的豐富度，菌系的酶活性也隨之增加，并且秸稈的降解效率也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

本研究中，簡(jiǎn)化后的復(fù)合菌系F3僅選用了7種菌株，可達(dá)到原自然復(fù)合菌系分解效率的80%，可見(jiàn)人工簡(jiǎn)化菌系在減少菌種的同時(shí)，也能達(dá)到高效的分解效率。李瑩等將自然菌系WSC-9簡(jiǎn)化為菌系F1，10 d可以使水稻秸稈減重73.9%；Kato等通過(guò)研究MC1中菌株關(guān)系，所組合優(yōu)化的細(xì)菌復(fù)合菌系對(duì)纖維素有高效的分解能力；Saurabh等簡(jiǎn)化構(gòu)建的菌系，酶活性最高可達(dá)到8.15 U/mL。

以往有關(guān)復(fù)合菌系的研究大多是純細(xì)菌復(fù)合菌系或者純真菌復(fù)合菌系，例如：Chen等將2種真菌進(jìn)行組合，所構(gòu)建的真菌菌系在最佳條件下木質(zhì)素和纖維素的降解率為26.38%和33.29%；Kaur等構(gòu)建的真菌菌系，72 h對(duì)纖維素的降解率為56.4%；Poszytek等構(gòu)建的MCHCA細(xì)菌復(fù)合菌系能夠有效降解木質(zhì)纖維素；Matthews等利用30種細(xì)菌構(gòu)建的細(xì)菌復(fù)合菌系對(duì)稻草有明顯的降解效果。而在Datsomor等研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的真菌復(fù)合菌系沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的協(xié)同效果，反而出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用，這說(shuō)明菌株之間并不是完全處于協(xié)作的關(guān)系。

細(xì)菌與真菌的相互作用是許多生態(tài)系統(tǒng)功能的重要驅(qū)動(dòng)因素，其協(xié)同作用或者拮抗作用能夠?qū)е挛⑸锇l(fā)生許多特性變化。一般情況下，利用相同資源生存的不同物種之間大多呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的共存培養(yǎng)后，不同物種可以依靠基因的突變來(lái)達(dá)到共存狀態(tài)。對(duì)于自然環(huán)境中的微生物群落來(lái)說(shuō)，土壤理化性質(zhì)和環(huán)境因素，往往限制了真菌和細(xì)菌的分布以及他們的相互作用程度，即使從同一土壤樣本中所分離出的菌株，也存在拮抗或者共存2種可能，人為選擇不同菌株并構(gòu)建復(fù)合菌系可能存在更多的不確定性。李靜等從林下土壤中篩選構(gòu)建的復(fù)合菌系在增加細(xì)菌多樣性的同時(shí)，分解秸稈的能力甚至有所下降；魏蔚等研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系中的菌種從4種增加到7種，降解能力反而減弱；王小娟等利用從枯葉土壤中篩選出的菌株，構(gòu)建的WSD-5復(fù)合菌系可以使麥稈中的纖維素成分減少94.2%；呂育才等將纖維素降解細(xì)菌CTL-6與無(wú)纖維素降解作用的W2-10細(xì)菌共培養(yǎng)，顯著提高了CLT-6的酶活性和降解能力；華彬彬等將纖維素降解細(xì)菌CSK1與其他4種無(wú)纖維素降解能力的細(xì)菌構(gòu)建菌系，發(fā)現(xiàn)在秸稈降解前期0～9 d，菌系表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，但是在分解后期菌系受到pH的影響，抑制了菌系的分解能力。在自然環(huán)境所分離出的微生物群落中，能夠找出互相之間有互利作用的真菌和細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行組合，那么就可以構(gòu)建出穩(wěn)定的復(fù)合菌系。例如：梅新蘭等利用4種菌株構(gòu)建的真菌-細(xì)菌復(fù)合菌系比其余豐富度的菌系分解效率最高提升1.6倍；張必周等構(gòu)建的真菌-細(xì)菌復(fù)合菌系酶活性可達(dá)85%以上，秸稈降解率最高可達(dá)38.79%；侯敏等篩選構(gòu)建的真菌-細(xì)菌菌系能夠顯著提高降解效果。

本研究所構(gòu)建的復(fù)合菌系在分解纖維素后期發(fā)生了明顯的群落組成變化：在細(xì)菌與真菌共培養(yǎng)過(guò)程中，有2種細(xì)菌的DGGE圖譜消失，1組條帶變暗，而其他條帶保持穩(wěn)定狀態(tài)。分析原因，復(fù)合菌系F3所使用的菌株之間具有拮抗和互利2種作用，在培養(yǎng)過(guò)程中菌系通過(guò)自身的群落動(dòng)態(tài)演化，淘汰了其中某些弱勢(shì)菌種，存活下來(lái)的菌株則呈現(xiàn)出互利共存的行為，從而進(jìn)化到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，并且能夠穩(wěn)定分解木質(zhì)纖維素，產(chǎn)酶種類豐富，酶活性也較高，說(shuō)明復(fù)合菌系F3實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的真菌-細(xì)菌共存體系。

4 結(jié) 論

本研究從自然菌系PLC-8中分離篩選出細(xì)菌N3、N5、N7、N10、N11；真菌P1、P2。并將其組合成細(xì)菌、真菌、真菌-細(xì)菌3種復(fù)合菌系。設(shè)置秸稈降解試驗(yàn)，測(cè)定木質(zhì)纖維素的降解率，并利用DGGE法分析微生物的群落結(jié)構(gòu)，主要研究結(jié)論如下：

1)自然復(fù)合菌系PLC-8在經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化后，仍然能夠保持穩(wěn)定的木質(zhì)纖維素分解能力。

2)人工組合復(fù)合菌系F3，是一種穩(wěn)定高效的木質(zhì)纖維素降解菌系，其分解效率高于F1、F2，在分解過(guò)程中能夠保持pH的相對(duì)穩(wěn)定，并且具有分解產(chǎn)物中有機(jī)酸的能力。

3)在分解木質(zhì)纖維素過(guò)程中，細(xì)菌發(fā)生明顯群落結(jié)構(gòu)變化，真菌不發(fā)生變化。在F3中，細(xì)菌與真菌可以實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用，并長(zhǎng)期保持穩(wěn)定狀態(tài)。