二十六味通經(jīng)膠囊中重金屬含量測(cè)定及其安全性評(píng)價(jià)

辛青霞,昝占全,趙正峰,李欣,張金魁,切尼項(xiàng)毛,董海紅,祁靜靜,久美彭措1,2,△（1.青海久美藏藥藥業(yè)有限公司,青海 西寧 810000;2.青海久美藏醫(yī)院,青海 西寧 81000;.青海久美藏藥國(guó)際研究院,青海 西寧 810000;.青海省都蘭縣人民醫(yī)院,青海 都蘭 816199）

中藏藥材中重金屬含量超標(biāo)的問(wèn)題是現(xiàn)在備受熱議的話題[1-2]，現(xiàn)有研究表明，部分中藏藥材中重金屬含量過(guò)高，使藥材的使用存在著重大的安全隱患，是制約中藏醫(yī)藥發(fā)展并走向世界的瓶頸之一[3-4]。因國(guó)際藥品行業(yè)對(duì)中藏醫(yī)藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求日益嚴(yán)格，尤其是中藏藥中殘留的重金屬會(huì)影響其安全性，蓄積導(dǎo)致慢性中毒，重金屬進(jìn)入體內(nèi)主要與人體內(nèi)酶蛋白上的-SH和S-S鏈牢固結(jié)合，使得蛋白質(zhì)變性，酶失去活性，從而出現(xiàn)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能上的損害，重金屬來(lái)源可能為原藥材、輔料，提取過(guò)程中的溶媒及設(shè)備使用過(guò)程中摻雜。制訂中藏藥中重金屬元素的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的工作是非常有必要且勢(shì)在必行。二十六味通經(jīng)膠囊是青海久美藏藥藥業(yè)有限公司的一味國(guó)藥產(chǎn)品，其主要組成為降香、藏木香、藏茜草、訶子、紫草茸、藏紫草、朱砂、羚羊角、沙棘膏、紅花、兔耳草、余甘子、鬼臼、冬葵果、巴夏嘎、火硝、毛訶子、束花報(bào)春、硼砂、寒水石、甘青青蘭、蒺藜、山礬葉、鬼箭錦雞兒、假耬斗菜、小傘虎耳草，功能主治為平和龍血，調(diào)經(jīng)活絡(luò)。用于月經(jīng)不調(diào)、胸背下腹及腰疼痛，該產(chǎn)品療效明確，在青海以及西北地區(qū)口碑較好。

目前對(duì)二十六味通經(jīng)膠囊的副作用未見(jiàn)報(bào)道，這對(duì)于長(zhǎng)期服用二十六味通經(jīng)膠囊的患者尤顯重要。其中膠囊組成成分中含有朱砂毒性成分，火硝、硼砂與寒水石礦物藥等，這些成分的存在使人們?cè)谑褂弥皶?huì)對(duì)安全性產(chǎn)生疑慮，為了打消使用過(guò)程中的安全顧慮，有必要對(duì)二十六味通經(jīng)膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)研究。本實(shí)驗(yàn)采用原子吸收法對(duì)二十六味通經(jīng)膠囊中Pb、Cd、As、Hg的含量進(jìn)行測(cè)定并評(píng)價(jià)其在使用過(guò)程中安全性，為制訂二十六味通經(jīng)膠囊中重金屬元素的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及其臨床安全應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 原子吸收光譜儀（型號(hào)novAA400P，德國(guó)耶拿），微波消解儀（型號(hào)TOPwave，德國(guó)耶拿），鉛、鎘、砷、汞元素的空心陰極燈（型號(hào)AS-1，北京有色金屬研究總院）；熱解涂層石墨管（德國(guó)耶拿）；乙炔氣、高純氬氣；靜音空氣壓縮機(jī)（型號(hào)HF-6100D，北京豪福機(jī)電技衍開(kāi)發(fā)應(yīng)用有限公司），冷卻循環(huán)水泵（型號(hào)HS-Ш，北京赫斯遠(yuǎn)大科技有限公司）；校準(zhǔn)合格的聚四氟乙烯容量瓶，燒杯，漏斗，針筒，針頭過(guò)濾器（0.22μm，13mm，津騰），移液管等。

1.2 試藥 鉛、鎘、砷、汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg/ml，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；硝酸、高氯酸、鹽酸、硫酸、磷酸二氫銨、硝酸鎂、硼氫化鈉、氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純或基準(zhǔn)物質(zhì)，碘化鉀、抗壞血酸、鹽酸羥胺、高錳酸鉀為分析純，超純水等。

供試藥品二十六味通經(jīng)膠囊（本廠自制，批號(hào)：20170607，20180103，20180614，20181102，20190504)。

2 方法

測(cè)定方法按照《中國(guó)藥典》第四部2321通則進(jìn)行測(cè)定[5]，精密量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水稀釋制成每1mL含Ge、In、Bi各1μg的混合溶液。精密量取內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用5%硝酸逐級(jí)稀釋，制成濃度為1μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1 樣品消解及供試品溶液配制 供試品溶液的配制采用微波消解法消解樣品，取供試品粉末0.5g，精密稱定，加硝酸5ml，用TOPwave消解儀執(zhí)行消解及趕酸程序，用2%硝酸溶液轉(zhuǎn)移至25ml或50ml量瓶中，并稀釋至刻度（用于汞的測(cè)定，趕酸溫度設(shè)定在120℃以下，加20%硫酸溶液2ml、5%高錳酸鉀溶液0.5ml，搖勻，滴加5%鹽酸羥溶液至紫紅色恰好消失，轉(zhuǎn)入10ml量瓶中，用水洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻），即得供試品溶液。

2.2 空白溶液的制備 空白溶液的制備每次測(cè)定必須隨行空白對(duì)照，所采用的試劑種類、用量，操作步驟與操作環(huán)境應(yīng)與供試品溶液的制備相同。

2.3 儀器工作條件 原子吸收分光光度計(jì)的工作條件見(jiàn)表1。

表1 原子吸收儀工作條件

2.4 石墨爐升溫程序 依照干燥、灰化、原子化、除雜步驟進(jìn)行，條件見(jiàn)表2。

表2 石墨爐升溫程序

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 為方便操作，將各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用2%硝酸溶液稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于低溫（0℃-5℃）保存。臨用前，取此儲(chǔ)備液，按要求稀釋并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別精密量取Pb、Cd、As、Hg標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1μg/ml）適量，用2%硝酸溶液制成每1ml分別含Pb為0、5、20、40、60、80μg/L的溶液。Cd為0、0.5、1、1.5、2μg/L；As為0、5、10、20、30μg/L；Hg為0、2、6、10、14、18μg/L的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照2.3項(xiàng)下工作條件分別進(jìn)行測(cè)定，以C（μg/L）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，4種線性關(guān)系良好且相關(guān)系數(shù)均在0.9991（含）以上，且回收率范圍均在95%-105%，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種重金屬及有害元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限、定量限

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取二十六味通經(jīng)膠囊0.5g，按“2.1”項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，Pb、Cd、As、Hg測(cè)定前按照“2.5”標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制，按“2.3”項(xiàng)下條件，于0、4、8、12、24小時(shí)測(cè)定5次，含鉛量平均值46.2mg·kg-1，RSD=1.03%；含鎘量平均值0.182mg·kg-1，RSD=2.09%；含汞量平均值3750mg·kg-1，RSD=0.99%；含砷量平均值15.98mg·kg-1，RSD=1.86%。結(jié)果表明所建立的方法穩(wěn)定性良好。

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取已制備好的Pb、Cd、As、Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別將各元素的最高梯度濃度溶液連續(xù)測(cè)定5次，讀取吸光度值，計(jì)算得到Pb、Cd、As、Hg元素吸光值的RSD分別為1.73%、2.19%、2.55%與1.27%，結(jié)果說(shuō)明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下條件測(cè)定，取同一批號(hào)樣品，分別取樣平行測(cè)定5次，分別求得Pb、Cd、As、Hg含量的RSD為1.55%、1.71%、1.38%與1.60%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取適量二十六味通經(jīng)膠囊置100mL錐形瓶中，并按2.3項(xiàng)下原子吸收分光光度計(jì)工作條件分別測(cè)定，計(jì)算回收率。

2017 年-2019年，共生產(chǎn)二十六味通經(jīng)膠囊5批，測(cè)定留樣產(chǎn)品中鉛、鎘、砷和汞含量及加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4數(shù)據(jù)可知，總鎘含量遠(yuǎn)低于《中國(guó)藥典》中單味藥材限量0.3mg/kg，總鉛含量在50mg/kg以下，總砷含量低于20mg/kg，總汞含量相對(duì)較高，平均值為3745mg/kg。各元素單次測(cè)定加標(biāo)回收率均在90%-110%，符合藥典規(guī)定。建議按照《中國(guó)藥典》2015版四部通則2321中原子吸收分光光度法測(cè)定該品種中各重金屬元素總量，并將限量定為：總鎘含量不得過(guò)0.5mg/kg，總鉛含量不得過(guò)100mg/kg，總砷含量不得過(guò)20mg/kg（與原有砷鹽限度檢查限量保持一致），總汞含量不得過(guò)5000mg/kg。

表4 5批二十六味通經(jīng)膠囊重金屬元素含量及加標(biāo)情況

4 討論

4.1 重金屬危害討論 重金屬對(duì)人體的新陳代謝和正常的生理功能具有明顯的傷害作用，并抑制人體正常生理作用的發(fā)揮，同時(shí)人體內(nèi)重金屬含量過(guò)量會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。重金屬危害描述：重金屬進(jìn)入人體后，在體內(nèi)會(huì)嚴(yán)重蓄積，從而導(dǎo)致一系列慢性疾病，由于現(xiàn)在環(huán)境污染的加重，重金屬往往暴露于人體，然后與體內(nèi)有機(jī)成分結(jié)合形成金屬螯合物，機(jī)體中的蛋白質(zhì)與其相結(jié)合，發(fā)生功能性損害甚至致突變、致畸[6-7]。

鉛在人體中主要損害神經(jīng)系統(tǒng)，腎臟和造血器官。主要存在以下幾種現(xiàn)象：小兒發(fā)育遲緩，注意力不集中，智力低下，聽(tīng)覺(jué)出現(xiàn)障礙等，若為慢性中毒，則導(dǎo)致鉛毒性腦病、急性腎功能衰竭[8]等，由于鉛的使用會(huì)使小兒智力低下，故取消了鉛的暫定每周耐受攝入量，無(wú)法設(shè)置其安全限值，鉛攝入量應(yīng)盡可能低，這是由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)（JECFA）（Provisional Tolerable Weekly Intake，PTWI）認(rèn)定的[9]。

鎘致腎損傷是鎘污染對(duì)人體的主要慢性危害。一般認(rèn)為鎘所致的腎損傷是不可逆的，慢性染鎘造成的腎損傷波及到整個(gè)腎臟，進(jìn)入人體的鎘，主要在肝臟中誘導(dǎo)MT的合成并與之結(jié)合成Cd-MT。該復(fù)合物可通過(guò)血液運(yùn)輸達(dá)到腎臟，經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)后大部分被腎小管吸收，然后釋放游離的鎘，產(chǎn)生毒性[10]。砷主要是通過(guò)干擾酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，從而影響各功能，伴隨的疾病主要有糖尿病、外周神經(jīng)病變及高血壓等疾病，還可引起造血抑制、肝臟損傷、感覺(jué)出現(xiàn)紊亂及體質(zhì)量減輕[11]，誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞衰老[12]。

汞主要通過(guò)呼吸道、消化道及皮膚黏膜等途徑進(jìn)入人體產(chǎn)生危害，容易引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙，從而造成人體頭暈頭痛等神經(jīng)衰弱綜合征[13]。除此之外，汞中毒還會(huì)造成中毒性心肌炎等[14]。

從上述各重金屬元素進(jìn)入人體的危害性得出，二十六味通經(jīng)膠囊的安全性評(píng)價(jià)是很有必要的，從而做到公眾放心，臨床用藥安全。

4.2 方法討論 重金屬及有害元素測(cè)定方法通常采用目視法、分光光度計(jì)法、比色法。其中鉛元素測(cè)定還可采用鉛元素原子吸收法、火焰光度法、氫化物法；鎘元素還可采用火焰光度法。由于比色法在重金屬總量測(cè)定中較為常見(jiàn)，儀器操作簡(jiǎn)單，但結(jié)果的準(zhǔn)確度和選擇性較差，且受多種金屬干擾，目前石墨爐原子吸收法靈敏度已達(dá)（10-9-10-14g），可滿足多種金屬同時(shí)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中采用的石墨爐原子吸收法測(cè)定二十六味通經(jīng)膠囊中Pb、Cd、As、Hg含量，該方法重復(fù)性好，操作靈敏可靠、簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，可用于二十六味通經(jīng)膠囊的質(zhì)量控制。在實(shí)驗(yàn)期間需要注意，為了避免在加熱過(guò)程中樣品所含重金屬損失，在對(duì)樣品處理之前，需要對(duì)溫度嚴(yán)格控制，防止其沸騰、糊化，經(jīng)查閱多種關(guān)于安全性評(píng)價(jià)方法及重金屬元素的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)于重金屬測(cè)定有多種方法，因公司經(jīng)費(fèi)有限，現(xiàn)只能采用原有原子吸收技術(shù)來(lái)測(cè)定重金屬元素含量，測(cè)得結(jié)果與藥典標(biāo)準(zhǔn)一致。本公司下一步希望通過(guò)ICP-MS儀，對(duì)原子吸收及各方法作出比較，得出更適合測(cè)定重金屬元素的方法，從而打消使用者對(duì)重金屬元素的顧慮，做到臨床安全用藥。

4.3 重金屬安全性討論 通過(guò)對(duì)二十六味通經(jīng)膠囊中重金屬元素含量測(cè)定及安全性評(píng)價(jià)分析得出[15]，二十六味通經(jīng)膠囊中重金屬含量均未超標(biāo)，均符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》和《中國(guó)藥典》的規(guī)定限范圍內(nèi)，限量定為：總鎘含量不得過(guò)0.5mg/kg，總鉛含量不得過(guò)100mg/kg，總砷含量不得過(guò)20mg/kg（與原有砷鹽限度檢查限量保持一致），總汞含量不得過(guò)5000mg/kg。從數(shù)據(jù)比對(duì)分析來(lái)看，二十六味通經(jīng)膠囊藥用較安全，可為臨床安全用藥提供一定的理論基礎(chǔ)，故對(duì)本制劑中所含重金屬元素進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)研究具有重大意義。