乙基伊維菌素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

李 冰, 齊 歡, 張成宏, 張紹勇,張立欽, 向文勝, 王繼棟*,

(1. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

阿維菌素 (avermectin) 和米爾貝霉素 (milbemycin)是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類高效低毒生物源殺蟲劑，二者及其衍生物，如伊維菌素(ivermectin)、多拉菌素 (doramectin)、?，斁?emamectin)、埃珀利諾菌素 (eprinomectin)、塞拉菌素 (selamectin) 和米爾貝肟 (mibemycin-oxime)、樂平霉素 (lepimectin)、莫西菌素 (moxidectin) 等[1-4]已在農(nóng)林植物害蟲[5-6]、害螨[7-8]與動(dòng)物寄生蟲[9-10]的防治中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品安全、畜牧業(yè)和醫(yī)藥健康發(fā)展具有重大意義。但是，由于害蟲抗藥性的產(chǎn)生[11-12]以及人們對(duì)低毒、高效、環(huán)境友好型藥物的迫切需求，亟需研發(fā)新品種以滿足社會(huì)的需要。

甲基伊維菌素(methyl ivermectins)和乙基伊維菌素 (ethyl ivermectins) (圖式1)，亦稱作天維菌素A/B (tenvermectins A/B)，是從組合生物合成構(gòu)建的基因工程菌Streptomyces avermitilisAVEH39[13]和Streptomyces avermitilisMHJ1101[14]中獲得的一種新型十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其對(duì)小菜蛾、黏蟲、棉鈴蟲、松材線蟲和朱砂葉螨的室內(nèi)毒力比同類化合物更強(qiáng)[15]，而對(duì)大鼠和小鼠經(jīng)口毒性明顯小于阿維菌素，對(duì)斑馬魚、大型溞的毒性遠(yuǎn)低于阿維菌素[16]。在室內(nèi)選育的小菜蛾中，抗甲基伊維菌素品系RS 品系僅與氯氰菊酯存在中等水平交互抗性，與乙基伊維菌素、阿維菌素B1a、氯蟲苯甲酰胺和多殺菌素不存在交互抗性[17]。因此，甲基和乙基伊維菌素具有開發(fā)為新一代微生物源農(nóng)藥的潛力。

圖式1 甲基伊維菌素和乙基伊維菌素結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of methyl ivermectin and ethyl ivermectin

乙基伊維菌素對(duì)松材線蟲和朱砂葉螨的活性高于甲基伊維菌素[18]。但是，上述兩株基因工程菌主要產(chǎn)生甲基伊維菌素，乙基伊維菌素的產(chǎn)量較低[13-14]。高昂的制造成本嚴(yán)重制約了以乙基伊維菌素為主成分的新農(nóng)藥開發(fā)，如何提高乙基伊維菌素的產(chǎn)量成為該產(chǎn)品能否開發(fā)成功的關(guān)鍵影響因素。

本研究對(duì)S.avermitilisAVE-H39 進(jìn)行誘變選育，以期篩選出乙基伊維菌素的高產(chǎn)菌株。通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)乙基伊維菌素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高乙基伊維菌素的發(fā)酵單位。研究結(jié)果將為開發(fā)以乙基伊維菌素為主成分的新型十六元大環(huán)內(nèi)酯農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株和主要儀器

以StreptomycesavermitilisAVE-H39 為基因工程菌，由工業(yè)阿維菌素生產(chǎn)菌株中的阿維菌素PKS 的裝載模塊和部分延伸模塊用米爾貝霉素PKS 的相應(yīng)模塊通過兩步替換而獲得，保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心。

ZXSD-R1270 恒溫培養(yǎng)箱和ZWY-2112D 搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；ARTP-IIS誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；L550 離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JP-060 超聲儀，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司；50 L 發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備銷售有限公司；Agilent 1260 HPLC 色譜儀，安捷倫科技公司；Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)，安捷倫科技公司；ZF-7A 紫外分析儀 (254/365 nm)，驥輝分析儀器有限公司。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 玉米淀粉和可溶性淀粉和麥芽糊精，上海源葉生物科技有限公司；甘露醇，青島明月海藻集團(tuán)有限公司；麥芽抽提物和瓊脂，美國(guó)BD 公司；酵母抽提物，英國(guó)Oxoid公司；酵母粉，安琪酵母股份有限公司；棉籽餅粉、黃豆粉和花生餅粉，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；CaCO3，山東優(yōu)索華工科技有限公司；亞硝基胍，德國(guó)Sigma 公司；甲基磺酸乙酯，上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；葡萄糖、淀粉酶和蔗糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇和乙腈，均為色譜純，美國(guó)TEDIA 公司。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L，酵母抽提物4 g/L，麥芽抽提物10 g/L，瓊脂18 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，玉米淀粉20 g/L，黃豆粉10 g/L，酵母抽提物10 g/L，CaCO32 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉100 g/L，淀粉酶0.2 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黃豆粉20 g/L，蒸餾水1 L，CaCO33 g/L，pH 7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 固體平板及斜面培養(yǎng)：取甘油管保藏的孢子懸浮液100 μL 均勻涂布于直徑90 mm的固體平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d。

搖瓶發(fā)酵：刮取固體平板培養(yǎng)的孢子，接種于裝有30 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 三角搖瓶中，于28 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)48 h；移取1.5 mL轉(zhuǎn)接至裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角搖瓶中，于28 ℃、220 r/min 條件下?lián)u瓶發(fā)酵12 d，取樣檢測(cè)。

50 L 罐發(fā)酵：刮取斜面培養(yǎng)的孢子，接種于裝有200 mL 種子培養(yǎng)基的1 000 mL 三角搖瓶中，于28 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)48 h；轉(zhuǎn)接至50 L 發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量5% (V/V)，發(fā)酵罐裝量30 L，在線監(jiān)控培養(yǎng)。

1.2.2 高產(chǎn)菌株選育 分別通過紫外 (UV)、常壓室溫等離子體 (ARTP)、亞硝基胍 (NTG)、甲基磺酸乙酯 (EMS) 或復(fù)合誘變手段，對(duì)發(fā)酵菌株進(jìn)行誘變選育。

孢子懸浮液：取生長(zhǎng)7 d 的斜面培養(yǎng)物，刮取孢子至無菌水中，用雙層紗布過濾制備孢子懸浮液，調(diào)整其濃度為107～108個(gè)/mL。

UV 誘變：取1 mL 孢子懸浮液，用功率30 W、波長(zhǎng)254 nm 的紫外燈，距液面20 cm 處分別照射處理20、40、60 和80 s 后，計(jì)算各時(shí)長(zhǎng)致死率和正突變率。

ARTP 誘變：取25 μL 孢子懸浮液，涂于載片上，設(shè)定氣流量10SLM，入射功率100 W，流出口間距2 mm，分別處理30、40、50 和60 s 后，計(jì)算各時(shí)長(zhǎng)致死率和正突變率。

NTG 誘變：對(duì)物理誘變處理耐受的菌株，按前述方法制備孢子懸浮液后，在28 ℃、220 r/min條件下，分別用質(zhì)量濃度為500、1 000、1 500 和2 000 mg/L 的NTG 處理40 min 后，計(jì)算致死率和正突變率。

EMS 誘變：取1 mL 孢子懸浮液，在28 ℃、220 r/min 條件下，分別用濃度為0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L 的EMS 處理60 min 后，計(jì)算致死率和正突變率。

復(fù)合誘變：選擇上述兩種或者多種誘變方法，連續(xù)處理孢子懸浮液進(jìn)行誘變，篩選乙基伊維菌素發(fā)酵效價(jià)提高的菌株。

1.2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化 對(duì)誘變選育獲得的高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，以優(yōu)化發(fā)酵工藝，進(jìn)一步提高乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)。

單因素試驗(yàn)：1) 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，氮源不變，分別考察葡萄糖、蔗糖、甘露醇等速效碳源和玉米淀粉 (添加0.02% 淀粉酶)、麥芽糊精、可溶性淀粉等遲效碳源，篩選最優(yōu)碳源；2) 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，碳源不變，分別考察酵母粉、酵母抽提物、蛋白胨等速效氮源和玉米漿干粉、棉籽餅粉、黃豆粉、花生餅粉等遲效氮源，篩選最優(yōu)氮源；3) 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，碳源和氮源不變，分別添加(NH4)2SO4、MgSO4、K2HPO4、NiCl2、CoCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4等無機(jī)鹽和微量元素，配合CaCO3，篩選最優(yōu)無機(jī)鹽和微量元素；然后對(duì)pH、接種量、搖瓶裝量、搖床轉(zhuǎn)速等進(jìn)行單因素試驗(yàn)。本研究中所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，培養(yǎng)基中玉米淀粉默認(rèn)添加0.2 g/kg 的淀粉酶。

Plackett-Burman 試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)為響應(yīng)值，采用三水平法比較各個(gè)因素之間的差異和整體的差異，對(duì)各因子的顯著性進(jìn)行排序，篩選出對(duì)產(chǎn)量有顯著影響的因子[19]。

最陡爬坡試驗(yàn)：依據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果分析，結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)際需要，對(duì)顯著因素設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，包括各因素的變化幅度和方向，以期最快地逼近最大響應(yīng)區(qū)域，獲得較為理想的響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)：根據(jù)爬坡試驗(yàn)結(jié)果的中心點(diǎn)進(jìn)行Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[20-22]，采用三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

數(shù)據(jù)分析：利用Design-Expert V8.0.6 分析軟件進(jìn)行回歸分析以獲得最優(yōu)組合。

驗(yàn)證試驗(yàn)：根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的最佳條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，比較真實(shí)值與預(yù)測(cè)值，確定優(yōu)化結(jié)果。

1.2.4 分析方法 取1 mL 發(fā)酵液，加入乙醇4 mL，超聲處理50 min，4 000 r/min 離心15 min，取上清進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。

HPLC 條件： Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇) :V(乙腈) :V(水) =81 : 7 : 12，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。采用外標(biāo)法計(jì)算乙基伊維菌素的效價(jià)。

菌體濃度 (packed mycelial volume, PMV)：準(zhǔn)確量取發(fā)酵液10 mL 于刻度離心管中，4 000 r/min離心15 min，檢測(cè)固體所占發(fā)酵液的體積百分比即為菌體濃度。

總糖：采用斐林試劑法檢測(cè)發(fā)酵過程中總糖含量[23]。

氨基氮：發(fā)酵過程發(fā)酵液中的氨基氮采用甲醛滴定法檢測(cè)[24]。

數(shù)據(jù)分析：利用Design-Expert V8.06 軟件對(duì)試驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以確定數(shù)據(jù)顯著差異性，進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合并求解最優(yōu)解。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種選育結(jié)果

2.1.1 物理誘變結(jié)果 對(duì)供試菌株孢子懸浮液進(jìn)行UV 誘變后發(fā)現(xiàn) (圖1)，照射時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致菌株致死率高，而UV 照射時(shí)間短的菌種形態(tài)變化較大，得到的單菌落多為光禿型，突變株的發(fā)酵單位較出發(fā)菌株大幅降低，負(fù)突變率高，故而不采用UV 誘變作為選育的主要誘變手段。

圖1 UV 誘變時(shí)間對(duì)S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突變率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

由圖2 可知：孢子懸浮液用ARTP 誘變處理30 s 時(shí)，致死率約為63%，正突變率約為2.2%；處理40 s 時(shí)致死率約為82%，正突變率約為4.8%，正突變率最高；處理50 s 時(shí)致死率約為90%，正突變率約為3.6%；處理60 s 時(shí)致死率約為97%，正突變率約為2.8%。因此選擇40 s 作為ARTP 誘變處理時(shí)間。

圖2 ARTP 誘變時(shí)間對(duì)S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突變率的影響Fig.2 Effect of ARTP irradiation time on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

2.1.2 化學(xué)誘變結(jié)果 由圖3 可知：使用NTG 誘變時(shí)，正突變率較物理誘變有大幅提高，在NTG質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 時(shí)，正突變率最高，為13.8%，致死率約為79%；在NTG 質(zhì)量濃度為500 mg/L 時(shí)，致死率約為53%，正突變率約為5.2%，致死率和正突變率相對(duì)都較低；在NTG 質(zhì)量濃度為2 000 mg/L 時(shí)，致死率約為98%，正突變率卻只有約為6.8%；在NTG 質(zhì)量濃度為1 500 mg/L 時(shí)，致死率約為90%，正突變率約為12.6%，較為理想。因此選擇1 000 和1 500 mg/L 的NTG處理40 min 作為主要的NTG 誘變條件。

圖3 NTG 質(zhì)量濃度對(duì)S. avermitilis AVE-H39 菌株孢子致死率和正突變率的影響Fig.3 Effect of NTG concentration on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

由圖4 可知：使用EMS 誘變時(shí)，菌株整體的致死率和突變率均不如NTG 誘變。在EMS 濃度為0.2 mol/L 時(shí)，致死率和正突變率都較低，致死率約為44%，正突變率約為3.6%；在EMS 濃度分別為0.4 和0.5 mol/L 時(shí)，致死率分別為76%和88%，正突變率分別為5.6%和5.7%；因此選擇0.4 和0.5 mol/L 的 EMS 處理60 min 作為主要的EMS 誘變條件。

圖4 EMS 濃度對(duì)S. avermitilis AVE-H39 菌株致死率和正突變率的影響Fig.4 Effect of EMS concentration on spore lethal rate and positive mutation rate of S. avermitilis AVE-H39 strain

本研究初始，甲基伊維菌素和乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)分別為1 936 和971 mg/L。選育前期采用物理誘變手段，以ARTP 誘變?yōu)橹?，?dāng)處理一段時(shí)間后菌株對(duì)物理誘變逐漸耐受、乙基伊維菌素發(fā)酵效價(jià)提升效率大幅降低時(shí)，改用化學(xué)誘變手段，以NTG 誘變和EMS 誘變交替使用，當(dāng)菌株對(duì)單一化學(xué)誘變因素逐漸耐受后，再采用復(fù)合誘變手段。經(jīng)過多輪選育之后獲得了一株乙基伊維菌素的高產(chǎn)菌株 (圖5)，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，該菌株生產(chǎn)乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)最高可達(dá)4 125 mg/L，為原始菌株的4.25 倍，且甲基伊維菌素的搖瓶發(fā)酵效價(jià)降至791 mg/L (圖6)，降幅為59%。從圖5 中可以發(fā)現(xiàn)，與原始菌株相比，誘變獲得的高產(chǎn)菌株在形態(tài)上已經(jīng)發(fā)生了較大變化，且高產(chǎn)菌株產(chǎn)孢更少，褶皺更多。

圖5 選育前后菌落形態(tài)對(duì)比Fig.5 Colony morphology before and after strain improvement

圖6 選育前后搖瓶發(fā)酵HPLC 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Fig.6 HPLC chromatograms of the shake-flask fermentation broths before and after strain improvement

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn) 由圖7 至圖12 可知：最優(yōu)速效碳源為甘露醇，最優(yōu)遲效碳源為玉米淀粉；最優(yōu)速效氮源為酵母抽提物，最優(yōu)遲效氮源為黃豆粉；無機(jī)鹽選擇添加(NH4)2SO4效果最好，微量元素選擇CoCl2、FeSO4。單因素試驗(yàn)進(jìn)一步確定較優(yōu)發(fā)酵條件：甘露醇30.0 g/L，玉米淀粉120.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，黃豆粉30.0 g/L，CaCO33.0 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，F(xiàn)eSO40.02 mg/L，轉(zhuǎn)速220 r/min，pH 7.2，裝液量30 mL/250 mL，接種量5%，溫度28 ℃。

圖7 速效碳源種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.7 Effect of available carbon sources on fermentation titer

圖8 遲效碳源種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.8 Effect of delayed carbon sources on fermentation titer

圖9 速效氮源種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.9 Effect of available nitrogen sources on fermentation titer

圖10 遲效氮源種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.10 Effect of delayed nitrogen sources on fermentation titer

圖11 無機(jī)鹽種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.11 Effect of inorganic salts on fermentation titer

圖12 微量元素種類對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.12 Effect of trace elements on fermentation titer

2.2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn) 使用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì) (表1 和表2)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析 (表3)，其中，P＞ |t|值的大小決定了各個(gè)考察因素的顯著水平，P≤ 0.05 證明該因素對(duì)乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)具有顯著影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各因素中影響顯著且從大到小的排序分別為A：玉米淀粉 (P= 0.009 6)、E：黃豆粉 (P= 0.028 3)、G：(NH4)2SO4(P= 0.036 2)，其他因素影響不顯著(P＞ 0.05)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman experiment

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Plackett-Burman experiment

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 ANOVA analysis of Plackett-Burman design

2.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)玉米淀粉、黃豆粉和(NH4)2SO4這3 個(gè)關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)并進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。結(jié)果 (表4)表明： 在試驗(yàn)2 條件下，乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)最高，說明最優(yōu)發(fā)酵條件在其附近，故以試驗(yàn)2的條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The corresponding responses of the steepest ascending experiment

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert V8.06 軟件，采用Box-Benhnken 方法對(duì)選育得到高產(chǎn)菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行三因子三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見表5，以A：玉米淀粉、B：黃豆粉、C：(NH4)2SO4為自變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 5 Factors and levels in Box-Behnken experiment design

表6 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiment

對(duì)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：效 價(jià)Y= 4 856 + 151.00A+121.63B+ 20.38C+ 10.00AB- 24AC+ 2.75BC-162.13A2- 78.38B2- 139.37C2。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見表7。

由表7 可知：回歸模型的P值為0.010 6 ＜0.05，失擬P值為0.243 3 ＞ 0.05，因此該模型顯著且失擬不顯著。該模型的決定系數(shù)和調(diào)整決定系數(shù)分別為R2= 0.946 9 和AdjR2= 0.853 1，說明該模型與樣本的相關(guān)性較高，回歸方程的擬合程度較好，其最終分析結(jié)果穩(wěn)定可信，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。玉米淀粉與黃豆粉、玉米淀粉與(NH4)2SO4、黃豆粉與(NH4)2SO4相互影響的等高線及響應(yīng)面見圖13、14 和15。對(duì)該模型求極大值，當(dāng)玉米淀粉為149.8 g/L、黃豆粉為38.1 g/L、(NH4)2SO4為3.04 g/L時(shí)，乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)達(dá)到理論預(yù)測(cè)的最大值4 942.34 mg/L。對(duì)其他因素和條件結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行選擇，優(yōu)化后培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件為：玉米淀粉149.8 g/L，黃豆粉38.1 g/L，(NH4)2SO43.04 g/L，甘露醇30.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，CaCO33.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，F(xiàn)eSO40.002 mg/L，轉(zhuǎn)速220 r/min，pH 7.2，裝液量30 mL/250 mL，接種量 5%，發(fā)酵溫度28 ℃。

圖13 玉米淀粉與黃豆粉對(duì)乙基伊維菌素效價(jià)的交互影響Fig.13 Interaction effect of corn starch and soybean powder on the titer of ethyl ivermectin

表7 回歸模型的方差分析Table 7 ANOVA analysis for response surface quadratic model

圖14 玉米淀粉與(NH4)2SO4 對(duì)乙基伊維菌素效價(jià)的交互影響Fig.14 Interaction effect of corn starch and (NH4)2SO4 on the titer of ethyl ivermectin

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用調(diào)整優(yōu)化后的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)達(dá)到4 965 mg/L，較優(yōu)化前的工藝提高了20%，與理論值4 942.34 mg/L 的偏差為0.46%，實(shí)測(cè)值與模擬預(yù)測(cè)值接近，表明該模型合理可靠，具有實(shí)用價(jià)值。另外，驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)測(cè)甲基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)為784 mg/L，沒有增長(zhǎng)，說明該培養(yǎng)基組成有利于菌株乙基伊維菌素單組分的累積。

2.2.6 罐發(fā)酵試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果，在50 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行工藝放大，發(fā)酵過程中的菌體濃度 (PMV)、總糖、氨基氮、pH 及乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)等代謝相關(guān)參數(shù)變化曲線見圖16。由圖可知，發(fā)酵液中總糖在整個(gè)發(fā)酵過程中一直呈下降趨勢(shì)，前96 h 下降較快，之后緩慢下降，在接近發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)基本保持不變；氨基氮在前48 h內(nèi)急速下降，之后一直上下波動(dòng)；PMV 在48 h 達(dá)到高峰，其前期的變化基本與總糖和氨基氮的消耗成正比，之后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定在50% 左右，發(fā)酵后期PMV 下降，原因可能在于菌絲老化自融；發(fā)酵液pH 值總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，前14 h 內(nèi)pH 值下降較快，之后開始緩慢上升，發(fā)酵264 h 之后pH 值開始快速上升，接近發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)pH 值趨近8.0。發(fā)酵產(chǎn)物乙基伊維菌素在發(fā)酵24 h 就可以檢測(cè)到，整個(gè)發(fā)酵周期呈上升趨勢(shì)，前200 h 左右效價(jià)日增量較多，之后產(chǎn)物累積速率放緩，接近發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)略有下降，發(fā)酵288 h 時(shí)乙基伊維菌素的效價(jià)達(dá)到峰值，為4 886 mg/L，略低于搖瓶發(fā)酵。

圖15 黃豆粉與(NH4)2SO4 對(duì)乙基伊維菌素效價(jià)的交互影響Fig.15 Interaction effect of soybean powder and (NH4)2SO4 on the titer of ethyl ivermectin

圖16 發(fā)酵代謝相關(guān)參數(shù)變化曲線Fig.16 Variation curves of metabolism-relevant parameters during the fermentation process

3 結(jié)論與討論

通過合成生物學(xué)手段獲得的甲基和乙基伊維菌素作為新一代十六元大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲抗生素，關(guān)于其發(fā)酵效價(jià)的研究報(bào)道比較少，除本研究的原始菌株外，Huang 等報(bào)道的基因工程菌株中甲基和乙基伊維菌素總效價(jià)為3 400 mg/L，HPLC 圖譜顯示其中乙基伊維菌素的含量不足1/3[14]，目前國(guó)內(nèi)外尚無對(duì)其產(chǎn)生菌誘變選育的研究報(bào)道。與阿維菌素在120～550 m3發(fā)酵罐中9 000 mg/L 以上的發(fā)酵效價(jià)相比[25]，乙基伊維菌素的發(fā)酵單位較低，制約了其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。因此，通過選育手段，得到乙基伊維菌素的高產(chǎn)菌株，可以推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在鏈霉菌菌種選育中，單一誘變手段使用一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象，引起微生物的回復(fù)突變，導(dǎo)致菌種選育效率大幅降低[26-28]。本研究在對(duì)多個(gè)單一誘變法進(jìn)行考察的基礎(chǔ)上，采用多種誘變手段對(duì)基因工程菌S.avermitilisAVE-H39進(jìn)行了多輪選育，獲得了乙基伊維菌素的高產(chǎn)突變菌株，其發(fā)酵效價(jià)水平達(dá)到4 125 mg/L，較出發(fā)菌株的發(fā)酵效價(jià)提高了4.25 倍，菌株的外觀形態(tài)相比原始菌株也發(fā)生了較大變化。

響應(yīng)面優(yōu)化法是通過將復(fù)雜的組合因素在小區(qū)域內(nèi)用多項(xiàng)式模型來擬合、計(jì)算，具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工藝優(yōu)化[29-32]。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化了乙基伊維菌素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵工藝。在優(yōu)化培養(yǎng)基的方案中，考慮到微生物生長(zhǎng)代謝，設(shè)計(jì)了速效碳源和遲效碳源搭配，速效氮源和遲效氮源搭配，添加無機(jī)鹽和微量元素，較為全面地滿足了菌株全產(chǎn)程的營(yíng)養(yǎng)需求。通過單因素試驗(yàn)確定最優(yōu)速效碳源為甘露醇，最優(yōu)遲效碳源為玉米淀粉；最優(yōu)速效氮源為酵母抽提物，最優(yōu)遲效氮源為黃豆粉；無機(jī)鹽選擇(NH4)2SO4；微量元素選擇CoCl2和FeSO4。通過Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選確定了關(guān)鍵因子為玉米淀粉、黃豆粉和(NH4)2SO4，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定了關(guān)鍵因子的最適濃度范圍，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定了其最佳發(fā)酵條件為：玉米淀粉149.8 g/L，黃豆粉38.1 g/L，(NH4)2SO42.04 g/L，甘露醇30.0 g/L，酵母抽提物20.0 g/L，CaCO33.0 g/L，CoCl20.01 mg/L，F(xiàn)eSO40.002 mg/L，轉(zhuǎn)速220 r/min，pH 7.2，裝液量30 mL/250 mL，接種量5%，發(fā)酵溫度28 ℃。經(jīng)驗(yàn)證，在優(yōu)化后的條件下，高產(chǎn)乙基伊維菌素的突變菌株，其搖瓶發(fā)酵效價(jià)可達(dá)到4 965 mg/L，與模擬預(yù)測(cè)值接近。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果，50 L 罐放大發(fā)酵時(shí)乙基伊維菌素效價(jià)峰值達(dá)4 886 mg/L，并統(tǒng)計(jì)了50 L 罐發(fā)酵過程中的菌體濃度、總糖、氨基氮、pH 值等代謝相關(guān)參數(shù)變化，為乙基伊維菌素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了參考。

本研究通過菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化，極大地提高了乙基伊維菌素的發(fā)酵效價(jià)水平，使得開發(fā)和生產(chǎn)以乙基伊維菌素為主成分的新農(nóng)藥品種具有了經(jīng)濟(jì)可行性，后續(xù)還可以通過高產(chǎn)關(guān)鍵元件的精確定位、改造及制備工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步降低其生產(chǎn)成本，提升經(jīng)濟(jì)價(jià)值。