滅菌唑與氰烯菌酯復(fù)配對(duì)水稻惡苗病菌的抑制活性

李美霞, 陳香華, 周長(zhǎng)勇, 陳亞麗, 朱春華,曹凱歌, 王建新, 周明國(guó), 段亞冰*,

(1. 江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥系，南京 210095；3. 江蘇省南京市六合區(qū)春華家庭農(nóng)場(chǎng)，南京 211500)

水稻惡苗病是由以藤倉(cāng)鐮孢菌Fusarium fujikuroi為優(yōu)勢(shì)種群引起的種傳真菌病害，在我國(guó)各稻區(qū)均有發(fā)生。發(fā)病植株表現(xiàn)為徒長(zhǎng)、病苗細(xì)高，葉片葉鞘細(xì)長(zhǎng)、葉色淡黃，根系發(fā)育不良；發(fā)病植株產(chǎn)生的分生孢子可借助氣流和雨水傳播，再次侵染谷粒和稻草，形成侵染循環(huán)，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)安全，部分病苗在移栽前死亡[1]，嚴(yán)重時(shí)可造成水稻減產(chǎn)50%以上[2]。病原菌在侵染水稻的同時(shí)，還可產(chǎn)生伏馬毒素及其他有毒次生代謝產(chǎn)物等，從而影響糧食安全[3-4]。目前由于缺乏抗病品種，生產(chǎn)中仍采用以種子處理為主的化學(xué)藥劑防治該病害[5]。

滅菌唑 (triticonazole) 屬于三唑類殺菌劑，主要用于防治禾谷類作物、豆科作物及果樹等真菌病害，對(duì)種傳病害有特效，且持效期長(zhǎng)[6-7]，但我國(guó)目前尚未有滅菌唑用于防治水稻惡苗病的相關(guān)產(chǎn)品登記。基于此，本研究擬開展滅菌唑?qū)λ緪好绮【氖覂?nèi)抑制活性研究及其對(duì)水稻的安全性評(píng)價(jià)，以期為滅菌唑在水稻惡苗病化學(xué)防控上登記使用提供理論依據(jù)。

氰烯菌酯 (phenamacril) 屬于2-氰基丙烯酸酯類殺菌劑，能有效控制由鐮孢菌引起的小麥赤霉病、水稻惡苗病和西瓜枯萎病等多種植物病害[8]。研究表明，該藥劑對(duì)水稻惡苗病防控體現(xiàn)在對(duì)菌絲生長(zhǎng)有較高的抑制活性，且浸種處理后對(duì)水稻整個(gè)生長(zhǎng)期無不良影響，兼具保護(hù)和治療作用[9]。近年來，隨著氰烯菌酯用藥歷史的延長(zhǎng)，水稻惡苗病菌對(duì)其的抗藥性問題日益加劇[10]。為了降低水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn)，本研究擬進(jìn)一步開展氰烯菌酯與滅菌唑混配對(duì)水稻惡苗病菌的聯(lián)合毒力測(cè)定，以期為科學(xué)使用不同浸種劑及延緩水稻惡苗病菌抗性群體的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

95%滅菌唑 (triticonazole) 原藥及25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑 (FS)，均由巴斯夫歐洲公司提供；95% 氰烯菌酯 (phenamacril) 原藥由江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司提供。原藥均用甲醇溶解并配制成1 × 104μg/mL 的母液，置于4 ℃培養(yǎng)箱保存?zhèn)溆谩?/p>

供試水稻品種為南粳5 055，蘇御糯。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：200 g 馬鈴薯，16 g 瓊脂粉，20 g 葡萄糖，加蒸餾水至1 L。

供試菌株：分別從浙江省紹興地區(qū) (編號(hào)為ZJSX-)、江蘇省淮安地區(qū) (編號(hào)為JSHA-) 及江蘇省泰州地區(qū) (JSTZ-) 采集典型水稻惡苗病感病植株，經(jīng)組織分離和單孢純化獲得菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS 測(cè)序鑒定為藤倉(cāng)鐮孢菌Fusarium fujikuroi，于4 ℃培養(yǎng)箱保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻惡苗病菌對(duì)滅菌唑的敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[11]。隨機(jī)選取10 株水稻惡苗病菌菌株，將其從4 ℃培養(yǎng)箱中活化轉(zhuǎn)移至空白PDA 平板上，于25 ℃培養(yǎng)6 d 后，用直徑5 mm打孔器于菌落邊緣約1/3 處打取菌碟，備用。將藥劑與PDA 培養(yǎng)基混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL 的含藥平板，以加入等體積甲醇的PDA 平板作為對(duì)照，每濃度重復(fù)3 次，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑 (cm)，并計(jì)算不同濃度處理下藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑菌率(I，%)，用DPS 數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算毒力回歸方程、有效抑制中濃度 (EC50) 及相關(guān)系數(shù) (r)。

1.2.2 滅菌唑種子處理懸浮劑對(duì)水稻種子發(fā)芽率的影響試驗(yàn) 稱量25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑(FS)，分別制備成有效成分質(zhì)量濃度為60、120和240 μg/mL 的藥液；稱取50 g 水稻種子，25 ℃恒溫于各質(zhì)量濃度藥液中浸泡48 h。每處理重復(fù)3 次，以加入等量清水中浸泡的種子作為空白對(duì)照，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。浸泡完成后，將種子擺放在潤(rùn)濕的雙層濾紙上，于25 ℃、相對(duì)濕度85%條件下培養(yǎng)，5 d 后各處理隨機(jī)選取100 粒種子，計(jì)算發(fā)芽率。

1.2.3 滅菌唑種子處理懸浮劑對(duì)水稻株高和鮮重的影響試驗(yàn) 水稻種子處理同1.2.2 節(jié)，將浸泡后的各處理種子種于一次性塑料杯中，每處理30 粒種子，21 d 后調(diào)查水稻株高和鮮重情況。

1.2.4 水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯的敏感性測(cè)定

隨機(jī)選取10 株水稻惡苗病菌菌株供試，試驗(yàn)方法同1.2.1 節(jié)，PDA 含藥平板中氰烯菌酯終濃度 (質(zhì)量濃度) 分別設(shè)置為：0、0.078、0.156、0.312 5、0.625 和1.25 μg/mL，每濃度重復(fù)3 次，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯和滅菌唑復(fù)配藥劑的敏感性測(cè)定 供試菌株為ZJSX-4。將1 ×104μg/mL 的氰烯菌酯母液與滅菌唑母液分別以質(zhì)量比4 : 1、3 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3 及1 : 4進(jìn)行混合，按照表1 中的質(zhì)量濃度梯度處理，測(cè)定氰烯菌酯和滅菌唑復(fù)配藥劑對(duì)水稻惡苗病菌的抑制活性。采用Wadley 法評(píng)價(jià)聯(lián)合毒力[12]，計(jì)算氰烯菌酯和滅菌唑復(fù)配的增效系數(shù) (SR)：SR ＞1.5為增效作用，1.5 ≥ SR ≥ 0.5 為相加作用，SR ＜0.5 為拮抗作用。

表1 水稻惡苗病菌敏感性測(cè)定試驗(yàn)中氰烯菌酯和滅菌唑復(fù)配藥劑的濃度梯度Table 1 Concent ration gradients of the combinations of phenamacril and triticonazole for the sensitivity tests of F. fujikuroi

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻惡苗病菌對(duì)滅菌唑的敏感性

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定結(jié)果 (表2) 顯示：10 株惡苗病菌株對(duì)滅菌唑均表現(xiàn)敏感，EC50值在0.069 2～0.766 1 μg/mL 之間，表明滅菌唑?qū)λ緪好绮【z生長(zhǎng)具有較高的抑制活性。

表2 水稻惡苗病菌對(duì)滅菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F. fujikuroi to triticonazole

2.2 滅菌唑種子處理懸浮劑對(duì)水稻的安全性

南粳5 055 和蘇御糯水稻種子經(jīng)不同質(zhì)量濃度的25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑處理后，其發(fā)芽率、株高、鮮重指標(biāo)與清水對(duì)照均無顯著差異 (P=0.05) (表3)，表明25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑對(duì)水稻安全性良好，可用于水稻惡苗病的化學(xué)防治。

表3 25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑對(duì)水稻的安全性Table 3 Safety of 25 g/L triticonazole FS on rice

2.3 水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯的敏感性

菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定結(jié)果 (表4) 顯示：10 株惡苗病菌株對(duì)氰烯菌酯均表現(xiàn)敏感，EC50值在0.007 6～0.262 9 μg/mL 之間，表明氰烯菌酯對(duì)水稻惡苗病菌菌絲生長(zhǎng)也具有較高的抑制活性。

表4 水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯的敏感性Table 4 Sensitivity of F. fujikuroi to phenamacril

2.4 氰烯菌酯和滅菌唑復(fù)配對(duì)水稻惡苗病菌的聯(lián)合毒力

同樣采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了氰烯菌酯和滅菌唑各比例復(fù)配藥劑對(duì)水稻惡苗病菌的聯(lián)合毒力，結(jié)果 (表5) 顯示：氰烯菌酯與滅菌唑按不同比例復(fù)配后的增系數(shù) (SR) 均在0.5～1.5 之間，表明復(fù)配表現(xiàn)為相加作用。

表5 水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯和滅菌唑各復(fù)配藥劑的敏感性Table 5 Sensitivity of F. fujikuroi to the combinations of phenamacril and triticonazole

3 結(jié)論與討論

水稻惡苗病又稱徒長(zhǎng)病，是水稻生產(chǎn)中的重要病害之一[13-14]。20 世紀(jì)70 年代，苯并咪唑類殺菌劑被廣泛用于防治水稻惡苗病，但由于長(zhǎng)期使用單一類型藥劑，田間水稻惡苗病菌抗藥性迅速發(fā)展，早在1982 年日本即報(bào)道了水稻惡苗病菌對(duì)苯菌靈已產(chǎn)生耐藥性[15]。20 世紀(jì)80 年代，咪鮮胺繼多菌靈后被大量應(yīng)用，隨后其抗藥性問題也日益嚴(yán)重[16-17]。2002 年，劉永峰等[18]發(fā)現(xiàn)水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺已產(chǎn)生抗藥性；2007 年，陳夕軍等[19]在田間分離到了8 株抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌株；2014 年，鄭睿等[20]發(fā)現(xiàn)咪鮮胺高抗菌株已成為江蘇省水稻惡苗病菌的優(yōu)勢(shì)群體。為了有效延緩水稻惡苗病菌的抗藥性，多種類型化學(xué)藥劑 (氰烯菌酯、戊唑醇、咯菌腈等) 和生防菌劑被陸續(xù)用于防治水稻惡苗病，剛開始應(yīng)用時(shí)效果顯著，很好地控制了病害發(fā)生，但由于生產(chǎn)上慣用單一藥劑防治病害，田間先后出現(xiàn)了對(duì)這些藥劑具有不同抗性水平的病原菌群體，因此其抗藥性問題依然嚴(yán)峻。

氰烯菌酯自2007 年進(jìn)入市場(chǎng)，并于2012 年開始登記用作水稻種子處理劑防治水稻惡苗病，該藥劑與多菌靈、咪鮮胺等無交互抗性[21]。2016年，侯毅平等[22]首次報(bào)道自浙江省紹興地區(qū)分離得到了9 株對(duì)氰烯菌酯高抗的水稻惡苗病菌菌株，其中8 株抗藥性基因型為myosin5 的第219 位密碼子由TCA (絲氨酸) →CCA (脯氨酸) 的突變，另外1 株抗藥性基因型為myosin5 的第219 位密碼子由TCA (絲氨酸) →TTA (亮氨酸) 的突變；2020 年，張智慧等[23]在江蘇省宿遷田間分離到的F.fujikuroi抗性菌株基因型表現(xiàn)為myosin5 第326 位密碼子由AGG (精氨酸) →AGT (絲氨酸) 的突變。隨著藥劑使用年限延長(zhǎng)以及使用劑量和使用頻率增加，抗藥性問題日益嚴(yán)重。因此，研發(fā)殺菌劑協(xié)同增效組合技術(shù)是延緩病原菌抗藥性發(fā)展、延長(zhǎng)藥劑使用年限的主要策略。

三唑類殺菌劑具備高效、廣譜、內(nèi)吸性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有保護(hù)和治療雙重作用，目前已成為滿足市場(chǎng)需求且最具有開發(fā)潛力的殺菌劑類型之一。但滅菌唑在防治水稻惡苗病方面還未有產(chǎn)品登記，也尚未見其對(duì)防治水稻惡苗病是否有效的相關(guān)報(bào)道。因此，研究滅菌唑?qū)λ緪好绮【囊种菩Ч?，能為水稻播種期病害防控提供重要參考。本研究表明，滅菌唑?qū)λ緪好绮【哂休^好的離體抑制活性，且25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑 (FS) 對(duì)水稻作物安全性良好。

為了進(jìn)一步降低單一藥劑對(duì)病原菌群體的選擇壓力，延緩抗藥性產(chǎn)生，本研究測(cè)定了氰烯菌酯和滅菌唑按照不同比例復(fù)配后對(duì)水稻惡苗病菌的聯(lián)合毒力。結(jié)果顯示，氰烯菌酯與滅菌唑在供試的7 種復(fù)配比例下對(duì)水稻惡苗病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果均表現(xiàn)為相加作用，故建議生產(chǎn)中可將滅菌唑與氰烯菌酯輪換或復(fù)配使用以協(xié)同防控水稻惡苗病，進(jìn)一步延緩病原菌對(duì)單一藥劑抗藥性的發(fā)展，從而保障病害防效和水稻生產(chǎn)安全。