啶酰菌胺等8 種殺菌劑對煙草葉斑病菌的生物活性

汪漢成, 黃 宇, 楊金初, 李治模, 蔡劉體,韋克蘇, 孟建玉, 李 忠

(1. 貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2. 貴州大學 農(nóng)學院，貴陽 550025；3. 河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，鄭州 450000；4. 貴州省煙草公司 遵義市公司，貴州 遵義 563099)

由葉斑病菌Didymella segeticola引起的煙草葉斑病是近期在貴州煙區(qū)發(fā)現(xiàn)的新病害，主要為害葉片，初始癥狀為葉片上出現(xiàn)褐色小病斑，周圍有淡黃色暈圈，褐色病斑會很快擴展至整個葉片，嚴重時相鄰病斑會融合形成大面積褐色病斑，煙株感染后通常自底部葉片迅速向中上部葉片擴展，具有暴發(fā)性和危害性強的特點，嚴重時局地煙株發(fā)病率達80%以上，可導致煙葉成片腐爛[1]。該病害易于煙株旺長期開始發(fā)生，具有造成重大損失的風險，尚無有效抗病品種，亟待建立高效防控技術。

化學防治是煙草葉斑類病害防治最經(jīng)濟有效的方法，對于由D.segeticola引起的煙草葉斑病,目前尚未有登記藥劑，相關防控技術研究也鮮有報道?，F(xiàn)階段，煙草真菌性葉斑類病害常用的防控藥劑有菌核凈(dimethachlon)、咪鮮胺(prochloraz)、多菌靈 (carbendazim)、代森錳鋅(mancozeb) 等，少量使用的藥劑有啶酰菌胺(boscalid)、苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole)、丙環(huán)唑(propiconazole) 和氟硅唑 (flusilazole) 等。為了評價這些藥劑在防治煙草葉斑病方面的可行性，筆者就啶酰菌胺等8 種殺菌劑對D.segeticola的生物活性進行了初步研究，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：煙草葉斑病菌D.segeticola菌株YBZ121、YBZ221 和YBZ111，由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室分離、鑒定。

測試培養(yǎng)基與煙葉：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)[2]，用于病原菌的培養(yǎng)和敏感性測定。供試煙草品種為云煙87，烤煙主栽品種，按照常規(guī)育苗方法將其播種植于漂浮育苗池，煙苗8 葉期時，采集底部3-4 葉位煙葉，洗凈晾干后用于藥劑的保護和治療作用測定。

藥劑：93%的菌核凈原藥，購自廣州卡芬生物科技有限公司；99.10%的咪鮮胺原藥，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；95.30% 的氟硅唑原藥，南通柯林化學品有限公司生產(chǎn)；95%丙環(huán)唑原藥，江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；96.80%苯醚甲環(huán)唑原藥，山東壽光雙星農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；85%代森錳鋅可濕性粉劑，杜邦中國集團有限公司生產(chǎn)；96%多菌靈原藥，江蘇藍豐生物化工股份有限公司生產(chǎn)；99.90%啶酰菌胺原藥，Sigma-Aldrich 有限公司生產(chǎn)。

將菌核凈溶于丙酮，咪鮮胺、氟啶胺、氟硅唑、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑均分別溶于甲醇，多菌靈溶于0.20 mol/L 的稀鹽酸，代森錳鋅溶于無菌水中，均分別配成1.00 × 104mg/L 的母液，4 ℃低溫保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用 配制含有系列濃度各藥劑的PDA 平板，其中：菌核凈、氟硅唑和丙環(huán)唑的最終測試質(zhì)量濃度為0、0.16、0.31、0.63、1.25 和2.50 mg/L；苯醚甲環(huán)唑的為0、0.08、0.16、0.31、0.63 和1.25 mg/L；多菌靈的為0、0.50、1.00、1.5、2.00 和2.50 mg/L；代森錳鋅的為0、3.10、6.30、12.50、25 和50 mg/L；咪鮮胺的為0、0.13、0.25、0.50、1 和2 mg/L；啶酰菌胺的為0、0.013 0、0.025 0、0.05、0.10 和0.20 mg/L。制備直徑為5 mm 的菌蝶，將其接種于不同質(zhì)量濃度梯度含藥平板中央，各處理3 次重復，接菌后將平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5 d 后“十字交叉”法測量菌落直徑，計算各藥劑不同劑量下對病原菌菌絲生長的抑制率[3]。

1.2.2 殺菌劑對煙草葉斑病的保護和治療作用測定 選擇強致病力菌株YBZ121 為測試菌株。用質(zhì)量濃度為0.01%的吐溫-80 配制各供試藥液。苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟硅唑、啶酰菌胺、多菌靈及菌核凈的最終測試質(zhì)量濃度均為100、25 和0 mg/L；代森錳鋅的為400、100 和0 mg/L；咪鮮胺的為200、50 和0 mg/L。1.2.2.1 保護作用測定 采用手動噴霧器向離體葉片正反兩面均勻噴施各濃度藥液，直至流淌。以噴施同體積無菌水處理為對照。于施藥24 h 后，用無菌接種針在葉片主脈兩側對稱部位制造相同傷口，分別接菌直徑為5 mm 的病原菌菌餅。每處理3 片煙葉，共6 次重復。接菌后將葉片置于25 ℃、相對濕度 90%及12 h/12 h 光暗交替的人工氣候箱中培養(yǎng)，6 d 后測量葉片病斑面積，計算各藥劑處理對煙草葉斑病的防控效果[4-5]。

1.2.2.2 治療作用測定 方法與保護作用測定相同，不同之處是接菌1 d 后再噴藥[4-5]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 和SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標、菌絲生長抑制率幾率值為縱坐標，建立各藥劑對病原菌菌絲生長的毒力回歸方程，計算EC50值和相關系數(shù) (r)[6]。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

結果 (表1) 表明：8 種供試殺菌劑對3 株D.segeticola菌株的菌絲生長表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中，抑菌活性最強的是啶酰菌胺，其EC50值范圍為0.033 0～0.055 0 mg/L，平均值為(0.047 0 ± 0.012 0) mg/L；其次依次為苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和丙環(huán)唑，其EC50值范圍分別為0.075 0～0.085 0 mg/L、0.22～0.38 mg/L 和0.56～0.79 mg/L；代森錳鋅的抑菌活性最差，其EC50值范圍為12.88～33.82 mg/L。D.segeticola不同菌株菌絲生長對同種藥劑的敏感性存在差異，其中對代森錳鋅的差異最大，最不敏感菌株 (YBZ111) 的EC50值是最敏感菌株 (YBZ121) 的2.63 倍，各菌株對其余7 種供試藥劑的敏感性差異均較小。

表1 8 種殺菌劑對Didymella segeticola 菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of eight fungicides on the mycelial growth of Didymella segeticola

續(xù)表1Table 1 (Continued)

2.2 殺菌劑對煙草葉斑病的保護和治療作用

供試8 種殺菌劑對煙草葉斑病表現(xiàn)出不同的保護和治療作用。各藥劑的防治效果均隨藥劑質(zhì)量濃度的增加而增強，而在相同劑量下，大部分藥劑保護處理時的防效高于其治療處理時的防效(表2)。其中，氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、啶酰菌胺和菌核凈對煙草葉斑病保護作用較強，其在25 mg/L 藥劑質(zhì)量濃度處理下的防效均 ＞85%；其次為多菌靈，25 mg/L 時的防效為82.74%；最弱的為代森錳鋅，100 mg/L 時的防效為70.51%。相比而言，治療作用效果較好的有啶酰菌胺和氟硅唑，其在25 和100 mg/L 下的防效均 ＞80%，且不存在顯著性差異；咪鮮胺在50 和200 mg/L 下的防效分別為85.24%和87.62%；苯醚甲環(huán)唑和多菌靈在25 和100 mg/L 下的防效均分別為76.00%和89.20%、及77.52%和82.43%；菌核凈和代森錳鋅的相對防效較弱，100 mg/L 處理時防效分別為78.93%和63.31%。

表2 8 種殺劑對煙草Didymella segeticola 葉斑病的保護和治療作用Table 2 Protective and curative effects of eight fungicides against D. segeticola leaf spot

3 小結與討論

D.segeticola是近年被診斷的重要植物病原菌，在貴州煙草和茶葉上均有危害[1,7-8]，然而對其防控技術卻缺乏研究，尚無任何防控藥劑登記。病原菌菌絲生長階段和孢子萌發(fā)階段均是其侵染危害的重要階段，抑制病原菌菌絲生長是病害防治藥劑篩選的重要依據(jù)之一。由于D.segeticola的孢子較難培養(yǎng)，故本研究測定并比較了8 種殺菌劑對D.segeticola菌絲生長的敏感性，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶抑制劑啶酰菌胺，三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑和氟硅唑，咪唑類殺菌劑多菌靈和咪鮮胺對D.segeticola菌絲生長均有較強的抑制活性。目前，鮮見有殺菌劑對D.segeticola生物活性的報道，劉順濤等報道了苯醚甲環(huán)唑和多菌靈對與D.segeticola同屬的西瓜蔓枯病病原菌Didymellabryoniae的毒力分別為0.056 0 和0.69 mg/L[9-10]，本研究測定結果與其基本一致。啶酰菌胺及三唑類殺菌劑戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑對D.bryoniae的敏感性基線分別為0.032 0、0.12 和0.031 0 mg/L，本研究所測定的啶酰菌胺及3 種三唑類殺菌劑結果與其類似[11]。另外，代森錳鋅對D.segeticola的抑菌作用弱于已報道的該藥劑對Didymella applanata毒力作用 (EC50在1.33～2.88 mg/L)[12]，這可能與Didymella屬真菌不同菌株對相同藥劑的敏感性間存在著差異有關。

除室內(nèi)敏感性測定外，活體植物組織上評價藥劑的防控效果也是病害防治藥劑篩選的重要依據(jù)。本研究在活體煙葉上評價了8 種殺菌劑對由真菌D.segeticola導致的葉斑病的保護和治療效果，發(fā)現(xiàn)其保護防效均高于治療防效，該結果與這些藥劑對煙草灰霉病和煙草立枯病的防治效果[4,13]類似；同時發(fā)現(xiàn)保護作用和治療作用均較好的藥劑有啶酰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑和咪鮮胺等。已有研發(fā)表明，咪鮮胺的內(nèi)吸傳導活性較弱[14]，而本研究發(fā)現(xiàn)其在離體葉片上仍具有較好的治療活性，推測其原因可能與本研究通過離體葉片噴霧時藥劑通過葉片氣孔等孔口進入葉組織有關，隨后需要進一步研究和驗證。煙葉生產(chǎn)上常使用的菌核凈、多菌靈等也具有較好的防治作用，但病原菌對這些藥劑產(chǎn)生抗性的風險較高。為此，D.segeticola葉斑病發(fā)生時可優(yōu)先選用啶酰菌胺、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑等藥劑進行防治。此外，本文僅測定了藥劑對D.segeticola的菌絲生長階段的抑菌活性，其對病原菌孢子形成與萌發(fā)等其他生活史階段的生物活性、以及其田間防效均有待進一步深入研究。此外，煙草是一種小面積種植的經(jīng)濟作物，2022 年全國年種植面積約86 萬公頃，登記防控煙草病蟲害的藥劑種類較少，下一步有待通過政策引導等措施加強防控藥劑的登記，促進煙草病蟲害防控水平的提升。