全自動(dòng)在線頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)水樣中24 種常見(jiàn)農(nóng)藥

俞嘉斌, 鄒 波, 魏春明, 趙 鵬, 董林沛,吳小軍, 宋祥瑞, 楊瑞琴, 張?jiān)品?,

(1. 中國(guó)人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100038)

農(nóng)藥在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，對(duì)水體及土壤等環(huán)境存在一定的污染風(fēng)險(xiǎn)[1]。同時(shí)由于農(nóng)藥容易獲得，還常被不法分子用于實(shí)施投毒犯罪[2]。因此，研究和建立環(huán)境基質(zhì)尤其是水樣中農(nóng)藥的快速高效分析方法，是維護(hù)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境安全、保障生產(chǎn)生活秩序及打擊相關(guān)犯罪的迫切要求。

目前，對(duì)于水基質(zhì)中農(nóng)藥檢測(cè)常見(jiàn)的前處理方法有固相萃取[3-4]、分散液相萃取[5]及QuEChERS[6]等，為提高靈敏度、保護(hù)儀器設(shè)備，這些方法多數(shù)還需要檢測(cè)人員使用萃取劑進(jìn)行提純、濃縮等預(yù)處理，存在檢材用量大、檢出限過(guò)高和檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等弊端，此外，假如遇到渾濁水樣時(shí)容易造成固相萃取柱堵塞，分散液相萃取需要嚴(yán)格控制溫度等，一定程度上影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率。水樣中農(nóng)藥檢測(cè)常用的儀器分析方法有氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC/MS)法[8-11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-15]等，其中GC/MS 在公安實(shí)戰(zhàn)檢測(cè)領(lǐng)域最為常見(jiàn)，且該方法對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥也有較為理想的檢出效果[16]。

固相微萃取技術(shù) (SPME) 是以液-固吸附平衡為基礎(chǔ)，利用分析物不同組分在纖維涂層表面的親和力差異而實(shí)現(xiàn)分離富集的一種方法，在兼具分析速度和效率的同時(shí)，還可最大限度降低分析成本。為了提高農(nóng)藥檢測(cè)的靈敏度，減少有機(jī)試劑的使用，本研究建立了水中24 種常見(jiàn)農(nóng)藥的全自動(dòng)在線頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC/MS) 檢測(cè)技術(shù)。郭震等[17]采用手動(dòng)固相微萃取進(jìn)行水樣的前處理，耗時(shí)長(zhǎng)且萃取穩(wěn)定性不高，而本研究采用全自動(dòng)在線系統(tǒng)進(jìn)行HSSPME 處理，可大幅縮短人工前處理時(shí)間，提高萃取目標(biāo)農(nóng)藥的穩(wěn)定性。此外，現(xiàn)有文獻(xiàn)中鮮有對(duì)萃取溫度和時(shí)間進(jìn)行綜合優(yōu)化的，多采用單變量考察[18-20]，而本研究綜合動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)因素對(duì)萃取溫度和時(shí)間進(jìn)行多變量綜合考察，進(jìn)一步優(yōu)化了萃取效果。所建立方法靈敏度高、精密度較好，為農(nóng)藥投毒、中毒案件的偵辦和相關(guān)物證檢驗(yàn)檢測(cè)提供了新的技術(shù)路線。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC/MS-QP2010 Ultra，日本Shimadzu 公司；色譜柱：DB-5 ms(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)，美國(guó)Agilent 公司；全自動(dòng)多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)：PAL RTC 型 (帶HSSPME 模塊)，瑞士CTC Analytics 有限公司；萃取針：PAL SPME Fibers (100 μm PDMS，85 μm Polyacrylate，95 μm Carbon WR/PDMS)，瑞士CTC Analytics 有限公司；Milli-Q Direct 純水系統(tǒng)，德國(guó)Merck Millipore 公司；Fresco21 型離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；W880 真空離心濃縮儀，北京吉艾姆科技有限公司。

1.1.2 藥劑及試劑

氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑：克百威 (carbofuran)、甲萘威 (carbaryl)、殘殺威 (propoxur)、異丙威(isoprocarb)、抗蚜威 (pirimicarb) 及仲丁威(fenobucarb)。

有機(jī)氯類殺蟲(chóng)劑 (預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，六六六及硫丹兩種農(nóng)藥各自的不同構(gòu)型間由于結(jié)構(gòu)相近、化學(xué)性質(zhì)相似，具有相似的萃取及分析結(jié)果，故本研究選取在公安實(shí)踐案件中最常見(jiàn)的兩種有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑構(gòu)型作為研究代表)：α-六六六 (α-BHC) 和β-硫丹 (β-endosulfan)。

除草劑類：莠去津 (atrazine)、西草凈 (simetryn)、二甲戊靈 (pendimethalin) 及2,4-滴丁酯 (2,4-D butylate)。

有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑：甲拌磷 (phorate)、敵敵畏(dichlorvos)、治螟磷 (sulfotep)、對(duì)硫磷 (parathion)、內(nèi)吸磷 (demeton)、二嗪磷 (diazinon) 及氯唑磷(isazofos)。

擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑：聯(lián)苯菊酯 (bifenthrin)、甲氰菊酯 (fenpropathrin)、反式氯菊酯 (transpermethrin)、四氟苯菊酯 (transfluthrin) 及芐呋菊酯 (resmethrin)。

以上共計(jì)24 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液均由中國(guó)Alta Scientific 有限公司提供，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL；甲醇及NaCl 為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別將1.0 mg/mL 的24 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶液配制成100 μg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存，備用。分別取1 mL上述單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混合，用甲醇稀釋，配制成1.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 液-液萃取步驟 取1 mL 待檢水樣于5 mL的離心管中，加入2 mL 乙酸乙酯，振搖10 min后渦旋離心15 min；取上清液濃縮至干，加入0.4 mL 甲醇復(fù)溶，待GC/MS 分析 (公安鑒定領(lǐng)域?yàn)榉奖闩c液相色譜方法進(jìn)行比較，常統(tǒng)一使用甲醇作為溶劑進(jìn)行GC/MS 分析，且24 種目標(biāo)農(nóng)藥在甲醇中均具有較好的溶解性，故本研究選用甲醇作為復(fù)溶溶劑，通過(guò)分流進(jìn)樣的方式以減少分析中柱流失的影響)。

1.2.3 頂空固相微萃取條件 PAL RTC 型全自動(dòng)在線進(jìn)樣系統(tǒng)SPME 模塊參數(shù)：萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間45 min，孵化時(shí)間10 min，振搖速率250 r/min，進(jìn)樣口解析時(shí)間3 min。

1.2.4 GC/MS 條件

色譜條件：DB-5 ms (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣為高純氦氣 (99.999%)，恒流模式，柱流量1.56 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度260 ℃。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 速率升至280 ℃，保持8 min，總時(shí)長(zhǎng)30 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源 (EI)，離子源溫度200 ℃，接口溫度200 ℃，碰撞能量70 eV。采用全掃描 (SCAN) 和選擇離子監(jiān)測(cè) (SIM) 兩種質(zhì)譜掃描模式，SCAN 模式掃描范圍m/z40～450，確定農(nóng)藥掃描離子、保留時(shí)間以及有無(wú)基質(zhì)干擾，SIM 模式下24 種目標(biāo)農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)24 種目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of twenty-four pesticides

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

為確定最優(yōu)分析條件，根據(jù)同類農(nóng)藥具有相似化學(xué)性質(zhì)和色譜行為這一前提，選取9 種代表性農(nóng)藥進(jìn)行萃取條件優(yōu)化試驗(yàn)，以建立優(yōu)化的萃取方法。其中，敵敵畏和甲拌磷代表有機(jī)磷類，克百威和甲萘威代表氨基甲酸酯類，甲氰菊酯和反式氯菊酯代表擬除蟲(chóng)菊酯類，α-六六六和β-硫丹代表有機(jī)氯類，莠去津代表除草劑類。

2.1.1 萃取涂層材料選擇 由于目標(biāo)物的萃取效率在很大程度上取決于被分析物與纖維涂層的親和性。因此，萃取纖維材料的選擇是整個(gè)固相萃取過(guò)程中最為關(guān)鍵的步驟。本研究選擇聚二甲硅氧烷 (PDMS)、聚丙烯酸酯 (PA) 和碳填充/聚二甲硅氧烷混合材料 (CWR/PDMS) 3 種商用纖維材料進(jìn)行萃取效果比較試驗(yàn)。分別配制質(zhì)量濃度為100 μg/L 的9 種代表性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取2 mL 于20 mL 的頂空瓶中，在萃取溫度60 ℃下，分別采用以上3 種材料萃取30 min，通過(guò)比較各農(nóng)藥特征離子峰面積的大小，確定最佳萃取材料。結(jié)果 (圖1) 顯示，以PDMS (100 μm) 作為檢測(cè)9 種農(nóng)藥的萃取涂層材料時(shí)萃取效果最佳。

圖1 不同萃取涂層材料對(duì)萃取效率的影響Fig.1 Effect of different extraction coating materials on extraction efficiency

2.1.2 萃取溫度及萃取時(shí)間優(yōu)化 萃取溫度和萃取時(shí)間是影響萃取效果的兩個(gè)關(guān)鍵因素[21-23]，本研究綜合考察了這兩個(gè)因素對(duì)萃取效果的影響。配制50 μg/L 的 9 種代表性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別取2 mL 于20 mL 的頂空瓶中，依次設(shè)置15、30、45、60 和75 min 梯度萃取時(shí)間，在40、60 和80 ℃溫度下萃取，根據(jù)農(nóng)藥特征離子峰面積，構(gòu)建出綜合考察萃取溫度和萃取時(shí)間的可視化響應(yīng)面。結(jié)果顯示：當(dāng)萃取溫度升高，甲拌磷和克百威萃取達(dá)到平衡所需的時(shí)間顯著縮短，但同時(shí)也會(huì)對(duì)目標(biāo)物在萃取纖維表面和空氣間的分配系數(shù)產(chǎn)生負(fù)面影響，由于萃取動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)的共同作用，當(dāng)高溫和低溫體系均萃取足夠長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，高溫體系的萃取量卻明顯少于低溫體系。因此，實(shí)踐中是否選擇加熱萃取，需要在縮短分析時(shí)間和提高靈敏度之間依據(jù)實(shí)際情況綜合比較，合理抉擇。

此外，在低溫條件下，甲氰菊酯和反式氯菊酯的萃取效果不佳，即使增加萃取時(shí)間，萃取量的提升也不明顯，而隨著萃取溫度升高，其萃取量有明顯提升。這種現(xiàn)象可能是由于菊酯類農(nóng)藥相對(duì)分子量大、沸點(diǎn)高造成的。而甲萘威和敵敵畏對(duì)高溫均比較敏感，在60 和80 ℃條件下，若萃取平衡后繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，萃取量會(huì)出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這可能與農(nóng)藥的穩(wěn)定性及農(nóng)藥與PDMS萃取材料的親和性相關(guān)。進(jìn)一步結(jié)合α-六六六、莠去津和β-硫丹的可視化曲面分析，本方法優(yōu)化后的萃取溫度為60 ℃、萃取時(shí)間為45 min。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各農(nóng)藥隨萃取時(shí)間和萃取溫度變化的響應(yīng)面反映Fig.2 Response surface reflection of pesticides with different extraction time and extraction temperature

2.1.3 離子濃度選擇 根據(jù)理論研究，提高基質(zhì)中離子濃度可以增大農(nóng)藥在萃取涂層與基質(zhì)間的分配系數(shù)[24]，從而改善檢測(cè)的靈敏度，其中向基質(zhì)中加鹽是最簡(jiǎn)單高效的方法。配制100 μg/L 的9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取2 mL 于20 mL 的頂空瓶中，在不加NaCl 和加入NaCl 至飽和的不同離子濃度條件下，測(cè)試PDMS (100 μm) 萃取纖維對(duì)各目標(biāo)農(nóng)藥的萃取效果。保持其他萃取條件 (萃取溫度45 ℃，萃取時(shí)間45 min) 一致，分別比較目標(biāo)農(nóng)藥在不同離子濃度下特征離子峰面積的變化。結(jié)果 (圖3) 顯示，加入NaCl 后，目標(biāo)農(nóng)藥的萃取效率均有不同程度的提升，因此在后續(xù)研究中，均選擇向水樣中添加NaCl 至飽和狀態(tài)。

圖3 基質(zhì)離子濃度對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of matrix ion concentration on extraction efficiency

2.1.4 進(jìn)樣口解吸時(shí)間優(yōu)化 萃取流程完成后，包裹SPME 纖維的萃取針會(huì)隨自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)立即插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行解吸附。研究中發(fā)現(xiàn)，增加解吸時(shí)間能使分析物從纖維上解吸更完全，但也會(huì)造成纖維材料本身的流失，影響纖維涂層的使用壽命和分析結(jié)果。因此，本研究預(yù)先考察了240、250 和260 ℃不同解析溫度對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果顯示各農(nóng)藥特征離子峰面積無(wú)明顯變化。在此基礎(chǔ)上，將萃取后的2 mL 200 μg/L 的9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在260 ℃下分別解析1、2 和3 min，以各農(nóng)藥的特征離子峰面積作為測(cè)評(píng)依據(jù)，考察檢出效果。結(jié)果 (圖4) 顯示，隨著解析時(shí)間的延長(zhǎng)，敵敵畏、β-硫丹和莠去津3 種農(nóng)藥的響應(yīng)值提升明顯，而其余6 種農(nóng)藥均可在較短的時(shí)間內(nèi)完成解吸。為達(dá)到最佳的分析結(jié)果，本研究確定最優(yōu)解吸時(shí)間為3 min。

圖4 進(jìn)樣口解析時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig.4 Effect of desorption time on extraction efficiency

2.2 HS-SPME-GC/MS 對(duì)24 種農(nóng)藥的檢測(cè)結(jié)果

采用上述優(yōu)化后的萃取條件萃取后，通過(guò)HS-SPME-GC/MS 方法對(duì)24 種目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行分析，其總離子流色譜如圖5 所示，各組分均有效分離且響應(yīng)良好。

圖5 總離子流色譜圖Fig.5 Total ion flow chromatogram

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、線性范圍及檢出限、定量限 在上述優(yōu)化后的萃取條件下，對(duì)24 種目標(biāo)農(nóng)藥的HSSPME-GC/MS 分析結(jié)果參數(shù)進(jìn)行考察，采用目標(biāo)物特征離子峰面積 (y) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣質(zhì)量濃度 (x) 進(jìn)行線性擬合，決定系數(shù) (R2) 均大于0.995 0。24 種農(nóng)藥的檢出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 分別在0.25～5.0 μg/L 和0.5～10 μg/L 之間 (表2)。

表2 24 種目標(biāo)農(nóng)藥的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Results of linearities, LODs and LOQs of twenty-four pesticides

2.3.2 正確度 向空白水基質(zhì)中分別添加10、50和100 μg/L 3 個(gè)水平的各目標(biāo)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行前處理和檢測(cè)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表3。24 種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率在86%～117%之間，在3 個(gè)添加水平下的日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 均小于18%。

表3 24 種目標(biāo)農(nóng)藥的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of twenty-four pesticides (n=6)

2.4 方法比較

為驗(yàn)證本方法的適應(yīng)性和高靈敏度優(yōu)勢(shì)，將本方法與傳統(tǒng)液-液萃取前處理方法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。在添加水平為100 μg/L 時(shí)，本方法中農(nóng)藥的回收率均大于86%，而傳統(tǒng)液-液萃取方法中24 種農(nóng)藥的回收率均小于85%。與傳統(tǒng)液-液萃取[25]直接進(jìn)樣的GC/MS 分析方法相比，HSSPME-GC/MS 方法的檢測(cè)靈敏度明顯提高，并在縮短前處理時(shí)間的同時(shí)還可最大限度減少有毒萃取溶劑的使用；與QuEChERS-GC/MS 分析方法[26]相比，本方法中農(nóng)藥的檢出限及線性范圍也有所改善，但由于多目標(biāo)物共萃取時(shí)產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)吸附現(xiàn)象可能會(huì)導(dǎo)致方法定量誤差，因此需通過(guò)研發(fā)高兼容性的萃取材料加以改善。與傳統(tǒng)浸入式固相微萃取 (DI-SPME) 的農(nóng)藥前處理方法[17]相比，全自動(dòng)在線HS-SPME 可極大程度減少人為誤差，同時(shí)提高農(nóng)藥的回收率，并且相較于正交試驗(yàn)或針對(duì)單一變量考察萃取時(shí)間/萃取溫度的方法，本研究中兼顧萃取動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)的考察方式更為精確，能夠得到更佳的萃取效果。

表4 在線HS-SPME 與傳統(tǒng)液-液萃取方法在回收率分布、有機(jī)溶劑使用及耗時(shí)方面的對(duì)比Table 4 Comparison of the range of recovery, the amount of organic reagent and the consumed time between online HS-SPME and traditional liquid-liquid extraction method

2.5 實(shí)際案例應(yīng)用

2021 年4 月2 日，公安部物證鑒定中心受理了內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)一起魚塘水投毒案件，楊某某報(bào)案稱自家魚塘被人投毒，導(dǎo)致魚苗大面積死亡。案件受理后，采用本研究建立的方法對(duì)送檢的魚塘水樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，從中檢出了氨基甲酸酯類農(nóng)藥仲丁威，整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程為全自動(dòng)一體化操作，總耗時(shí)1.6 h 左右，檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示。本研究所建立的分析方法無(wú)需人工使用有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行萃取，大大節(jié)約了案件物證的檢驗(yàn)時(shí)間，能夠滿足公安機(jī)關(guān)對(duì)魚塘等水域投毒案件水樣中農(nóng)藥檢驗(yàn)鑒定的需求。

圖6 魚塘水檢材色譜圖Fig.6 Chromatogram of fish pond water sample

3 結(jié)論

本研究建立了水中常見(jiàn)24 種農(nóng)藥的HS-SPMEGC/MS 檢測(cè)方法。相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，本方法的靈敏度和分析速度均有較大程度提升，通過(guò)對(duì)主要萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)萃取溫度和萃取時(shí)間兩方面條件綜合進(jìn)行考察，確定了最優(yōu)的萃取條件：選用PDMS 萃取材料，添加NaCl 至飽和提升萃取基質(zhì)中離子濃度，萃取溫度260 ℃，萃取時(shí)間45 min，進(jìn)樣口解析時(shí)間3 min。本研究所建立的方法所需樣品量少 (2 mL)，且無(wú)需使用有機(jī)萃取溶劑，兼具有環(huán)保和安全的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，本方法采用全自動(dòng)在線固相微萃取這一前處理技術(shù)，最大限度減少了人工操作帶來(lái)的偶然誤差，提高了檢測(cè)結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。在同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品時(shí)，萃取步驟和儀器分析能夠同步進(jìn)行，可有效壓縮樣品分析總時(shí)間，提高檢驗(yàn)效率。在后續(xù)研究中，還將繼續(xù)探究血液、尿液、臟器組織等復(fù)雜生物基質(zhì)中農(nóng)藥的在線HS-SPMEGC/MS 分析方法，以期為公安機(jī)關(guān)毒物檢驗(yàn)鑒定提供更優(yōu)的技術(shù)方案。