BRAFV600E突變蛋白及β-catenin、cyclin D1在cN0期甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

宋創(chuàng)業(yè)，孟艷林，劉冰，劉攀云，李偉，嚴(yán)麗，李曉武，苗建軍，尚培中

（中國(guó)人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 1.普通外科 2.疾病預(yù)防控制科 3.內(nèi)分泌科 4.病理科，河北 張家口 075000；5.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 腺體外科，河北 石家莊 050000）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增[1]。在臨床常見(jiàn)的4 種組織病理學(xué)分型中，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最為多發(fā)，約占全部TC 的60%～70%[2]。絕大多數(shù)PTC 進(jìn)展緩慢、惡性度低、預(yù)后良好，但有少數(shù)患者仍可并發(fā)淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，是造成患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存質(zhì)量下降的重要原因[3-5]，此類患者放射性碘治療無(wú)效，預(yù)后較差[6]。臨床上把腫瘤直徑≤1 cm 的PTC 定義為甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）[7-8]，雖生長(zhǎng)緩慢，但常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]，對(duì)于術(shù)前查體及影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（cN0）的PTMC 患者，常規(guī)行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃，可以清除潛在的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，手術(shù)更加徹底并能降低再手術(shù)的發(fā)生率，但同時(shí)可導(dǎo)致神經(jīng)損傷、乳糜漏、甲狀旁腺功能減退等手術(shù)并發(fā)癥的增加。有學(xué)者[10-11]認(rèn)為，BRAFV600E突變及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)異常，可能與PTMC 發(fā)生發(fā)展、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討cN0 期PTMC 中BRAFV600E突變及β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)情況與PTMC 的發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年3 月—2021 年9 月收治經(jīng)手術(shù)治療的cN0 期PTMC 患者120 例，留取癌灶組織、癌旁組織及淋巴結(jié)標(biāo)本，癌旁組織取自距癌灶邊緣2 cm 以上的正常甲狀腺組織，淋巴結(jié)為中央?yún)^(qū)（Ⅵ區(qū)）組織。其中男31 例，女89 例；年齡23～76 歲，平均年齡（53.5±12.7）歲，病變位于甲狀腺左葉36 例，右葉69 例，雙葉均有病變15 例。手術(shù)方式：甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)15 例，甲狀腺全切+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)37 例，甲狀腺腺葉、峽部切除+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)68 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 首次就診；⑵ 術(shù)前查體、B 超、CT 等影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（cN0 期）；⑶ 行甲狀腺切除術(shù)及pCLND；⑷ 切除甲狀腺組織經(jīng)病理證實(shí)為PTMC；⑸ 手術(shù)前后相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果無(wú)缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 非原發(fā)病變；⑵ 既往有PTMC 手術(shù)治療史；⑶ 合并其他惡性腫瘤；⑷ 伴有血液、免疫系統(tǒng)缺陷性疾??；⑸ 急慢性感染或近期應(yīng)用免疫抑制劑等相關(guān)治療藥物。

1.2 試劑與設(shè)備

Ventana 全自動(dòng)免疫組化染色儀（美國(guó)Ventana公司）；兔單克隆陰性質(zhì)控抗體、鼠單克隆抗體試劑、OptiView IHC 檢測(cè)試劑盒及擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Roche 公司）；兔抗人β-catenin、cyclin D1 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；BenchMarkXT 全自動(dòng)切片染色機(jī)（美國(guó)Ventana 公司）。

1.3 方法

1.3.1 BRAFV600E蛋白檢測(cè) 采用Ventana 全自動(dòng)免疫組化染色儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)BRAFV600E蛋白的表達(dá)情況。取組織樣本用4%中性甲醛固定，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，進(jìn)行4 μm 切片。依據(jù)Ventana 全自動(dòng)染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，蘇木精染色5 min 后，顯微鏡下觀察染色。結(jié)果判定：BRAFV600E陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，100 倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野，根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占整張切片同類型細(xì)胞的百分比進(jìn)行分級(jí)。分別采用雙盲評(píng)分法及陽(yáng)性細(xì)胞所占同型細(xì)胞的百分比進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分：無(wú)著色；1 分：淡黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1 分：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%；2 分：陽(yáng)性細(xì)胞占11%～49%；3 分：陽(yáng)性細(xì)胞占50%～79%；4 分：陽(yáng)性細(xì)胞占比≥80%。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：將兩種評(píng)分相乘進(jìn)行總體評(píng)分：0～4 分為低表達(dá)，定義為陰性；5～12 分為高表達(dá)，定義為陽(yáng)性。

1.3.2 β-catenin、cyclin D1 蛋白檢測(cè) 取液氮凍存的PTMC 組織和癌旁組織放入預(yù)冷4%多聚甲醛固定24 h、制成石蠟切片，10%山羊血清室溫封閉1 h，分別滴加β-catenin、cyclin D1 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，次日蒸餾水漂洗3 次，滴加二抗復(fù)合物室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染或不復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并攝片。結(jié)果判定：β-catenin 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而cyclin D1 定位于細(xì)胞核。染色陽(yáng)性是指細(xì)胞核淡黃色至棕褐色著色，僅胞質(zhì)染色視為陰性。綜合判斷高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度評(píng)分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：高倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之平均數(shù)為該例陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，>75%為4 分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4 分為低表達(dá)，定義為陰性；5～12 分為高表達(dá)，定義為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS 23.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，數(shù)據(jù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組樣本中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)情況

檢測(cè)結(jié)果顯示：BRAFV600E蛋白定位于PTMC細(xì)胞質(zhì)，在PTMC 組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，在癌旁組織中呈陰性表達(dá)；β-catenin 蛋白主要表達(dá)于PTMC細(xì)胞質(zhì)中，部分癌旁組織細(xì)胞核內(nèi)也可見(jiàn)表達(dá)；cyclin D1 蛋白主要表達(dá)于PTMC 細(xì)胞核內(nèi)，在癌旁組織中呈陰性表達(dá)（圖1）。

圖1 免疫組化檢測(cè)（×100）Figure 1 Immunohistochemical staining (×100)

2.2 兩組樣本中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)比較

在PTMC 組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白呈高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為70%、35.8%、57.5%，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.7%、20.8%、34.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 PTMC和癌旁組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)比較Table 1 Comparison of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expression in PTMC and paracancer tissues

2.3 BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系

PTMC 組織中，BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)（均P>0.05）；cyclin D1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑有關(guān)，BRAFV600E蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病灶數(shù)目有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；而B(niǎo)RAFV600E、β-catenin 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤直徑無(wú)關(guān)（均P>0.05）；β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與病灶數(shù)目無(wú)關(guān)（均P>0.05）；BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)均與頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P<0.05）（表2）。

表2 BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 2 Relations of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expressions with the clinicopathologic feature of PTMC [n(%)]

3 討 論

TC 是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有內(nèi)分泌腫瘤的95%，占全身實(shí)體惡性腫瘤的1%[12]。PTC 是臨床常見(jiàn)的TC 病理分型，生長(zhǎng)緩慢，多見(jiàn)于年輕女性，預(yù)后良好，被稱為“良性癌癥”[13-14]。臨床上把腫瘤直徑≤1 cm 的PTC 稱為PTMC，在我國(guó)每年新發(fā)PTC 中約30%～40%的患者為PTMC，部分PTMC 病變可呈現(xiàn)出高侵襲性生物學(xué)行為，而并非單純的PTC 早期病變，且常伴有中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（central lymph node metastasis，CLNM），CLNM 發(fā)生率可高達(dá)30%以上[15-16]。有學(xué)者[17-20]認(rèn)為，PTMC 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能與BRAFV600E基因突變、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路蛋白表達(dá)異常有關(guān)。

BRAF 基因，即鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1），位于人類7 號(hào)染色體上，編碼RAF 家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（motigen-activated proteinkinase/extracelluar regulated protein kinase，MAPK/ERK）信號(hào)通路，影響細(xì)胞的分裂和分化，是人類最重要的原癌基因之一[21-22]。BRAFT1799A點(diǎn)突變是最常見(jiàn)的BRAF 基因突變類型，是指第15 位外顯子第1 799 位脫氧核苷酸上的胸腺嘧啶（T）被替換為鳥(niǎo)嘌呤（A），導(dǎo)致蛋白質(zhì)第600 位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）所代替，即BRAFV600E突變，BRAFV600E突變可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和分化[23]。有研究[24]表明，PTC 病變組織中BRAFV600E突變率保持在較高水平，且有明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)。另有學(xué)者[25-26]認(rèn)為，BRAF 基因是PTC 特異度較高的分子標(biāo)志物。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，BRAFV600E突變蛋白在PTMC 組病變組織中陽(yáng)性率高達(dá)70.0%，而在癌旁組織中陽(yáng)性率為31.8%（P<0.05）；亦證實(shí)BRAFV600E突變?cè)赾N0 期PTMC 發(fā)生、進(jìn)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用（P<0.05）。

臨床上對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路研究較多且較深入，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路也叫經(jīng)典Wnt 信號(hào)途徑，具體過(guò)程是：當(dāng)經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路被激活后，分泌到細(xì)胞外的Wnt 與跨膜受體LRP5/6 以及Fzd 結(jié)合形成復(fù)合物并激活受體，進(jìn)而激活胞內(nèi)的Dishevelled 蛋白（Dsh），導(dǎo)致糖原合成酶3（glycogensynthasekinase-3，GSK-3，GSK-3）活性受到抑制使其從axin 上脫落，阻止β-catenin 降解復(fù)合體（主要由APC、axin、GSK-3 構(gòu)成）的形成，故β-catenin 也不會(huì)被磷酸化和降解，使胞內(nèi)β-catenin表達(dá)升高。當(dāng)胞內(nèi)β-catenin 達(dá)到一定水平時(shí)，游離β-catenin 發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，最終實(shí)現(xiàn)某些 特定基因（如C-myc、cyclin D1、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生長(zhǎng)因子等）表達(dá)的增強(qiáng)或減弱。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起著重要作用，亦是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖調(diào)控的關(guān)鍵途徑[27-28]。cyclin D1 是Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的靶基因，在多種腫瘤中cyclin D1 過(guò)表達(dá)，β-catenin的異常表達(dá)均和Wnt 突變有密切聯(lián)系。有研究[29-31]證實(shí)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常激活在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，且惡性腫瘤組織中β-catenin、cyclin D1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)均顯著高于癌旁組織，其表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在PTMC 組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白呈高表達(dá)，陽(yáng)性率均高于癌旁組織，分別為70%、35.8%、57.5%，組間對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性與頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），故二者可能促進(jìn)了PTMC 患者發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示β-catenin、cyclin D1 蛋白異常表達(dá)，可作為cN0 期PTMC 可靠標(biāo)志物。

本研究納入的120 例PTMC 患者病理資料中，BRAFV600E表達(dá)陽(yáng)性率70.0% 與汪杰等[32]報(bào)道的29%～83%基本一致。Zheng 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PTMC原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中常檢測(cè)出BRAFV600E突變。姬巍等[34]研究結(jié)果顯示，BRAFV600E突變型PTMC 的組織侵襲力強(qiáng)，容易侵犯甲狀腺周圍組織，臨床病理分期高；腫瘤多灶、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC 患者，BRAFV600E突變率更高。本研究中cyclin D1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為57.5%，腫瘤直徑≥5 mm、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC 與cyclin D1 表達(dá)明顯相關(guān)（P<0.05）。BRAFV600E基因突變者PTMC 組織中cyclin D1 呈高表達(dá)，cyclin D1表達(dá)上調(diào)與BRAFV600E基因突變呈正相關(guān)，可作為PTMC 臨床病理診斷的重要輔助指標(biāo)，亦可作為評(píng)估PTMC 侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、術(shù)后放射性碘治療及內(nèi)分泌治療的重要參數(shù)。

綜上所述，cN0 期PTMC 組織中BRAFV600E突變及β -catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；BRAFV600E突變及β-catenin、cyclin D1 蛋白高表達(dá)促進(jìn)了PTMC 的發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。