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    HPLC 法測(cè)定人血清中游離比阿培南濃度及其在重癥感染中的臨床應(yīng)用

    2022-10-11 06:52:26李博涵彭秘封傳華任琦陳集志徐蘭
    藥品評(píng)價(jià) 2022年14期
    關(guān)鍵詞:阿培南離心管色譜

    李博涵,彭秘,封傳華,任琦,陳集志,徐蘭

    1.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院,江西 南昌 330006;2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908 醫(yī)院,江西 南昌 330002;3.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004;4.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,江西 南昌 330029

    比阿培南是一種新型1β-甲基碳青霉烯類抗菌藥物,通過結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白,能有效地經(jīng)細(xì)菌外膜滲透進(jìn)入周質(zhì)間隙,發(fā)揮強(qiáng)大的殺菌活性[1],對(duì)革蘭陽(yáng)性菌(G+菌)、革蘭陰性菌(G-菌)和厭氧菌等能發(fā)揮廣譜、強(qiáng)大的抗菌活性[2],被廣泛用于特殊病理生理狀況的重癥感染患者的經(jīng)驗(yàn)性治療、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶G-桿菌引起的急慢性感染,臨床上較多地用于腹腔感染、呼吸道感染、敗血癥、婦產(chǎn)科感染、心內(nèi)膜炎及尿路感染[3]。比阿培南為時(shí)間依賴性抗菌藥物,發(fā)揮殺菌活性的前提是抗菌藥物濃度要達(dá)到某水平并維持較長(zhǎng)時(shí)間。比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度高于大多數(shù)G+菌、G-菌和厭氧菌的MIC90(抑制90%細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度),對(duì)非產(chǎn)酶腸桿菌科和敏感金葡菌的敏感率均大于90%[4],但鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌這兩種病原菌的MIC90 可達(dá)到64、16 μg/mL[1],高于比阿培南血清穩(wěn)態(tài)濃度。因此,需監(jiān)測(cè)重癥感染患者中比阿培南的血藥濃度,按監(jiān)測(cè)結(jié)果制定個(gè)體化的給藥方案,提高臨床治療成功率。

    藥物在血中呈游離狀態(tài)的部分能產(chǎn)生藥理效應(yīng),能被機(jī)體轉(zhuǎn)化和排泄,更為準(zhǔn)確的做法是采用游離藥物濃度來評(píng)價(jià)藥效學(xué)和藥物不良反應(yīng)。本研究參考文獻(xiàn)[5-7],建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高的HPLC 法測(cè)定人血清中游離比阿培南濃度,并應(yīng)用于監(jiān)測(cè)ICU 患者比阿培南的血清濃度,為安全合理使用比阿培南提供參考。

    1 儀器與試藥

    LC-15C 型高效液相色譜儀(日本島津);Millipore 超純水儀(美國(guó)Millipore 公司);DL-360D型智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);AUW220D 型電子分析天平(日本島津);TGL-16 型高速離心機(jī)(山東百歐醫(yī)療科技有限公司);XH-B型微量渦旋混合器(上海汗諾儀器有限公司);ST 3100 型pH 計(jì)(常州奧豪斯儀器有限公司);移液槍(Thermo Fisher 公司);超濾離心管(10kD,聚醚砜膜,美國(guó)Millipore 公司)。比阿培南對(duì)照品(批號(hào):A137321337769,純度98.00%,APEXBio 公司);注射用比阿培南(批號(hào):201116125,規(guī)格:0.3 g,正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司);3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS,批號(hào):BCB28902,純度≥99.5%,美國(guó)sigma-Aldrich 公司);醋酸銨(批號(hào):20190620,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);硫酸鋅(批號(hào):202031099,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);滅菌注射用水(四川科倫藥業(yè),批號(hào):M14101008,規(guī)格:500 mL);乙腈、甲醇為色譜純,水為純化水,其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱為Waters Atlantis T3 色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L 醋酸銨緩沖液(pH4.6)(2∶98);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

    2.2 溶液的配制

    MOPS 溶液:精密稱取MOPS 25 mg,置50 mL棕色量瓶中,加適量水溶解,用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值為7,再加水定容至刻度,搖勻,即得濃度為0.5 mg/mL 的MOPS 溶液,4 ℃冷藏保存;比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱取比阿培南對(duì)照品0.021 1 g,置25 mL 棕色量瓶中,用0.5 mg/mL MOPS(pH 7.0)溶液溶解并定容至刻度,搖勻,即得校準(zhǔn)后濃度為0.827 1 mg/mL 的比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液,分裝于1.5 mL EP管中,-20 ℃冷凍保存。

    2.3 樣品的處理

    精密量取血清210 μL,加入0.5 mg/mL MOPS(pH 7.0)溶液160 μL,渦旋混勻1 min,轉(zhuǎn)移至超濾離心管中,15 000 r/min離心10 min,取下層濾液,進(jìn)樣分析。

    2.4 專屬性試驗(yàn)

    A:取空白血清160 μL,加入0.5 mg/mL MOPS溶液(pH 7.0)210 μL,渦旋混勻1 min,轉(zhuǎn)移至超濾離心管中,15 000 r/min 離心10 min,取下層濾液,進(jìn)樣分析。B:取空白血清160 μL,加比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備溶液50 μL,加入0.5 mg/mL MOPS(pH 7.0)溶液160 μL,渦旋混勻1 min,轉(zhuǎn)移至超濾離心管中,15 000 r/min 離心10 min,取下層濾液,進(jìn)樣分析。C:取患者用藥后的血清,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖1,比阿培南保留時(shí)間約為5.4 min,色譜峰形較好,2.5 min 左右的雜質(zhì)峰和其他內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)比阿培南峰型均不造成干擾。

    圖1 HPLC色譜圖:A.空白血清;B.空白血清+比阿培南;C.患者血清

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    取比阿培南對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用0.5 mg/mL MOPS 溶液(pH 7.0)稀釋并配制系列對(duì)照品濃度分別為0.81、1.62、6.46、12.92、25.85、51.69、103.39、206.77 μg/mL。精密量取空白血清160 μL,分別加入上述系列對(duì)照品溶液各50 μL,使比阿培南血清濃度分別為0.20、0.40、1.58、3.16、6.32、12.65、25.30、50.59 μg/mL,按“2.3”項(xiàng)處理,記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),血清中比阿培南濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得比阿培南的線性回歸方程為A=19 558C+531.15,r=0.999 9。定量下限為0.20 μg/mL。結(jié)果表明,比阿培南血清濃度在0.20~50.59 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。

    2.6 回收率試驗(yàn)

    分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的對(duì)照血樣,每個(gè)濃度各5 份,按“2.3”項(xiàng)處理,記錄色譜圖,由回歸方程計(jì)算得出測(cè)定濃度,方法回收率=測(cè)定濃度/理論濃度×100%,結(jié)果見表1。結(jié)果表明方法回收率均符合生物樣品分析要求。

    2.7 精密度試驗(yàn)

    分別配制濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對(duì)照血樣,每個(gè)濃度各5 份,按“2.3”項(xiàng)處理,分別在同一天內(nèi)測(cè)定5 次、每天測(cè)1 次連續(xù)3 天,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度,結(jié)果見表1。比阿培南的日內(nèi)、日間精密度RSD 均<8%,表明精密度符合生物樣品分析要求。

    表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

    2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    分別配制低、中、高濃度為1.54、6.15、24.62 μg/mL 的比阿培南對(duì)照血樣,每個(gè)濃度各3 份,按“2.3”項(xiàng)下方法處理。室溫穩(wěn)定性:室溫放置0、2、4、6、8、12 h;冷藏穩(wěn)定性:4 ℃冰箱冷藏放置48 h;凍融穩(wěn)定性:-20 ℃冰箱凍存,取出置室溫自然融化,再置-20 ℃凍存24 h,此步驟重復(fù)2 次,共進(jìn)行3 次。以上樣品均按“2.3”項(xiàng)下方法處理。結(jié)果顯示樣品連續(xù)凍融3 次后,比阿培南穩(wěn)定性有一定幅度下降,而凍融2 次穩(wěn)定性良好;室溫放置12 h、4 ℃下放置48 h、-20 ℃放置15 d 穩(wěn)定性良好(比阿培南濃度變化<15%,RSD<6.65%)。

    3 治療藥物監(jiān)測(cè)

    3.1 入選病例

    本研究共納入病例69 例,藥敏試驗(yàn)提示為多重耐藥菌感染或(和)對(duì)碳青霉烯類敏感的重癥患者,年齡≥18 歲,使用比阿培南≥3 d。

    3.2 樣本收集及療效判定

    給藥方案為比阿培南0.6 g,加入50 mL 0.9%氯化鈉注射液中,輸液泵泵注2~3 h,每8 小時(shí)給藥一次。比阿培南血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)(用藥2 d)后,于給藥前30 min,外周靜脈采血,測(cè)定谷濃度。本院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)通過本試驗(yàn)方案。根據(jù)《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》(2015 年版)制定臨床療效和微生物學(xué)療效的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。臨床療效:評(píng)定為治愈的標(biāo)準(zhǔn)為癥狀、體征均已消失或完全恢復(fù)正常,且非微生物學(xué)指標(biāo)如影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室等均已恢復(fù)正常;微生物學(xué)療效:微生物清除或未清除但臨床癥狀及體征好轉(zhuǎn)評(píng)定為好轉(zhuǎn)??傆行?(臨床治愈+好轉(zhuǎn))/總例數(shù)×100%。

    3.3 結(jié)果

    參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9],本研究將比阿培南谷濃度目標(biāo)設(shè)定為1~10 μg/mL,測(cè)定結(jié)果見圖2。低于最低檢測(cè)限的患者有5 例;有16 例低于1 μg/mL,根據(jù)《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》(2015 年版)制定的臨床療效和微生物學(xué)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn),其中有13例治療效果不佳,調(diào)整比阿培南用藥方案比如加大單次使用劑量為0.6 g、增加給藥頻次至4 次/日、延長(zhǎng)泵注時(shí)間等,再次監(jiān)測(cè)谷濃度均有明顯上升,均在1~10 μg/mL范圍內(nèi),最終有12例臨床治療有效,1 例患者死亡;46 例在目標(biāo)范圍(1~10 μg/mL)內(nèi),臨床治療有效率為86.96%;有7 例大于10 μg/mL,其中2 例治療無效。

    圖2 比阿培南血清游離谷濃度(實(shí)線表示為目標(biāo)濃度范圍1~10 mg/L)

    4 討論

    4.1 色譜柱的選擇

    比阿培南的水溶性大,在反相色譜柱上,特別是在非極性的C18 色譜柱上保留非常弱。在前期試驗(yàn)中為了獲得適當(dāng)?shù)纳V保留,使用乙腈-0.01 mol/L醋酸銨緩沖液(pH4.6)(2∶98)為流動(dòng)相,因采用的C18 色譜柱不是耐水色譜柱,高水比例的流動(dòng)相引起色譜柱硅膠基質(zhì)發(fā)生降解、修飾碳鏈倒伏斷裂,導(dǎo)致C18 色譜柱柱效快速下降、色譜峰型變差或拖尾等。因此,本研究換用了對(duì)極性大的化合物保留能力強(qiáng)、在水流動(dòng)相中性能穩(wěn)定的Waters Atlantis T3色譜柱,解決了普通C18 色譜柱難以保留極性化合物這種難題。

    4.2 樣品處理方法的選擇

    目前關(guān)于比阿培南血清濃度測(cè)定方法包括微生物效價(jià)法[10]、硫酸鋅或硫酸銨蛋白沉淀法[6,8,10]、沉淀蛋白后反洗法[11]、超濾離心法[6-7]、固相萃取法[12]等,但考慮到微生物效價(jià)法干擾因素較多,準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性較差,而固相萃取法因操作步驟繁瑣,且衍生化試劑和衍生化產(chǎn)物的不穩(wěn)定性易影響到測(cè)定結(jié)果,兩種方法均無法快速有效監(jiān)測(cè)比阿培南血清濃度。本研究選擇并比較了硫酸鋅蛋白沉淀法和超濾離心法對(duì)血樣分離效果的影響。經(jīng)硫酸鋅沉淀蛋白后的樣品,雖然處理過程簡(jiǎn)便、成本低,但可能是因?yàn)榱蛩徜\與比阿培南產(chǎn)生共沉淀,或者比阿培南濃度因硫酸鋅稀釋血樣后有所下降[5],比阿培南提取回收率僅33%左右,樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過并靜置后仍變得渾濁不清,易堵塞色譜柱,色譜圖雜質(zhì)峰較多,干擾比阿培南峰,這結(jié)果與多篇文獻(xiàn)[6,8,10]報(bào)道不同。而超濾離心管處理的血樣提取回收率>95%,能較好地保持比阿培南分子在血清中的活性,樣品澄清無雜質(zhì),經(jīng)過約10 min 的處理就可快速用于測(cè)定,適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血清濃度,也可減少比阿培南因其不穩(wěn)定性導(dǎo)致的降解,是目前較好的血樣處理方法。比阿培南的蛋白結(jié)合率約10%,與蛋白結(jié)合的比阿培南分子量超過超濾離心管膜孔的截止尺寸(10 kD),將不能被濾過。超濾離心法具有簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn),可作為測(cè)定比阿培南游離濃度的首選方法。

    4.3 比阿培南血清游離濃度監(jiān)測(cè)

    本研究測(cè)定的比阿培南血清游離濃度波動(dòng)范圍為0~24.32 μg/mL,說明比阿培南在體內(nèi)代謝過程個(gè)體化差異較大,這可能是因?yàn)榕c健康人群相比較,比阿培南在ICU 患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有很大差異,如Cmax(峰濃度)、AUC 0~8 h(0~8 h 內(nèi)的藥時(shí)-曲線下面積)小于健康人群,而T1/2(半衰期)、Cl(清除率)、Vd(表觀分布容積)遠(yuǎn)大于健康人群[4],從而導(dǎo)致血藥濃度個(gè)體化差異較大。

    在影響藥效達(dá)標(biāo)率(PTA)的諸多因素中如MIC(最低抑菌濃度)、Vd、T1/2 等,MIC 的權(quán)重最大,達(dá) 90%以上,且MIC 值與PTA 成反比[13]。比阿培南對(duì)敏感菌株、中介需氧菌和非產(chǎn)酶腸桿菌科等病原菌的清除率較高且細(xì)菌耐藥發(fā)生率較低;對(duì)ICU常見的耐藥菌如多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的MIC90 分別為32~64、16~64 mg/L,敏感率均<30%[4,14]。

    ICU 患者血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)個(gè)體差異大,病理生理狀態(tài)不同,本研究通過監(jiān)測(cè)比阿培南血清游離濃度,驗(yàn)證其是否在目標(biāo)范圍內(nèi),并結(jié)合患者臨床癥狀及感染程度,制定比阿培南的個(gè)體化給藥方案,對(duì)大部分患者抗感染治療有一定的指導(dǎo)作用,能進(jìn)一步促進(jìn)臨床合理用藥,避免不良反應(yīng)的發(fā)生,提高臨床用藥安全性和有效性。

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