miR-199a-5p介導(dǎo)的lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)HIF-1α促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的惡性增殖*

蘇 靜

綿陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，四川綿陽 621000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種典型的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，由單克隆漿細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中異常積累引起[1]。主要特征為骨重塑嚴(yán)重失衡引起的骨病變[2]。MM是一種復(fù)雜的疾病，其潛在的分子機(jī)制尚未完全闡明，探索創(chuàng)新的治療策略對(duì)于有效治療MM患者至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類功能RNA分子，其長度超過200個(gè)核苷酸，幾乎不具有蛋白質(zhì)編碼能力[3-4]。lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和分化中發(fā)揮著重要作用[5]。此外，lncRNA已被證明在人類癌癥中具有異常調(diào)節(jié)作用，可能作為癌癥促進(jìn)因子或癌癥抑制因子發(fā)揮作用[6]。lncRNA ANRIL已在家族性黑色素瘤患者中被鑒定。有研究報(bào)道，lncRNA ANRIL過表達(dá)是幾種人類癌癥的危險(xiǎn)因素。例如，沉默lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素(IL)-33/生長刺激表達(dá)基因2(ST2)減少心肌細(xì)胞凋亡[7]。lncRNA ANRIL通過增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展[8]。lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)自噬途徑中的微小RNA(miRNA)-99a和miRNA-449a促進(jìn)血管生成和血栓形成[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-411-3p介導(dǎo)的lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抑制MM的惡性增殖和腫瘤干細(xì)胞樣特性[10]，表明lncRNA ANRIL、HIF-1α和MM發(fā)展密切相關(guān)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)展中l(wèi)ncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p與HIF-1α具有靶向作用，但是在MM中，三者是否有聯(lián)系尚不明確，而且目前還沒有足夠的證據(jù)表明lncRNA ANRIL在MM細(xì)胞中的表達(dá)和功能。因此，本研究旨在探討lncRNA-ANRIL通過誘導(dǎo)HIF-1α對(duì)MM惡性增殖的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 從本院選取55例MM患者為研究對(duì)象，均符合人民衛(wèi)生出版社出版的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)選取55例健康志愿者作為對(duì)照。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。采集治療前MM患者與健康志愿者的外周靜脈血，離心后收集血漿。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人MM細(xì)胞系U266從美國典藏培養(yǎng)中心(ATCC)獲得，在含有15%胎牛血清(美國Gibco)、1%谷氨酰胺和1%鏈霉素-青霉素(美國Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。過表達(dá)對(duì)照載體(mimics NC)、miR-199a-5p過表達(dá)載體(miR-199a-5p mimics)、敲低對(duì)照載體(inhibitor NC)、miR-199a-5p敲低載體(miR-199a-5p inhibitor)、ANRIL陰性對(duì)照(si-NC)、ANRIL沉默載體(si-ANRIL)、HIF-1α沉默載體(si-HIF-1α)由中國廣東RiboBio公司合成。U266細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)經(jīng)Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen)轉(zhuǎn)染后，接種于6孔板，收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測 miRanda軟件預(yù)測lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)。TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)用于預(yù)測miR-199a-5p的靶位點(diǎn)，用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miR-199a-5p與lncRNA ANRIL或HIF-1α的結(jié)合。構(gòu)建ANRIL野生型(wt-ANRIL)和突變型(mut-ANRIL)報(bào)告載體，并插入psiCHECK-2。構(gòu)建HIF-1α野生型(wt-HIF-1α)和突變型(mut-HIF-1α)報(bào)告載體并插入psiCHECK-2。報(bào)告質(zhì)粒(wt-ANRIL、mut-ANRIL、wt-HIF-1α、mut-HIF-1α)與mimics NC、miR-199a-5p mimics質(zhì)粒用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞48 h。最后，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海Beyotime Biotechnology)檢測U266細(xì)胞的凋亡。U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗，以2 000 r/min離心10 min。U266細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液(500 μL)中，然后與Annexin V-FITC(5 μL)和碘化丙啶(10 μL)在25 ℃條件下孵育20 min。最后采用流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences)對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，計(jì)算凋亡率。

1.2.4細(xì)胞增殖活力測定 將U266細(xì)胞(5 000個(gè)/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染0 h和48 h后，添加10 μL CCK-8(日本Dojindo)到每個(gè)孔，與細(xì)胞孵育4 h。最后在450 nm波長下檢測吸光度。

1.2.5RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 所有的RNA均使用TRIzol試劑(美國Invitrogen)從血漿和細(xì)胞中提取，然后用PrimeScript RT試劑盒按照廠家說明書(日本Takara)將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA采用DNaseⅠ處理樣品，去除樣品中的gDNA。隨后使用miR-X miR第一鏈合成試劑盒(日本Takara)合成cDNA。最后，利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本Takara)和羅氏LightCycler 480 PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列如下：lncRNA ANRIL-F 5′-GGACTACAGATGCACCACCAT-3′；lncRNA ANRIL-R 5′-TGAGCACTGTGTCCATAGCA-3′;miR-199a-5p-F 5′-GGCGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′；miR-199a-5p-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；HIF-1α-F 5′-ACCTATGACCTGCTTGGTGC-3′;HIF-1α-R 5′-GGCTGTGTCGACTGAGGAAA-3′;GAPDH-F 5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′;GAPDH-R 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3′。

1.2.6Western blot U266細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌，用RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解。將等量的蛋白樣品通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用一抗[抗caspase3(英國Abcam,ab32351)、抗caspase 9(英國Abcam，ab32539)、抗Bax(英國Abcam，ab32503)、抗Bcl-2(英國Abcam，ab32124)、抗GAPDH(英國Abcam，ab8485)]和辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育PVDF膜。用Pierce ECL Western blot(美國Thermo Scientific)觀察條帶。采用GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α在MM患者和健康志愿者血漿中的表達(dá)差異 MM患者血漿lncRNA ANRIL、HIF-1α表達(dá)高于健康志愿者(P<0.05)，MM患者血漿miR-199a-5p表達(dá)低于健康志愿者(P<0.05)。見圖1。

注：A為MM患者和健康志愿者血漿lncRNA ANRIL表達(dá)比較；B為MM患者和健康志愿者血漿miR-199a-5p表達(dá)比較；C為MM患者和健康志愿者血漿HIF-1α表達(dá)比較;**表示P<0.05。

2.2lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α三者之間的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件預(yù)測了lncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p和HIF-1α之間的結(jié)合位點(diǎn)(圖2A、2B)。熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，與wt-ANRIL+mimics NC組相比，wt-ANRIL+miR-199a-5p mimics的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-ANRIL+mimics NC組與mut-ANRIL+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2C)；與wt-HIF-1α+mimics NC組相比，wt-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-HIF-1α+mimics NC組與mut-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2D)。進(jìn)一步研究了lncRNA ANRIL對(duì)miR-199a-5p、HIF-1α表達(dá)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)與si-NC組相比，si-ANRIL組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，表明lncRNA ANRIL表達(dá)對(duì)HIF-1α表達(dá)有正向調(diào)控作用，miR-199a-5p表達(dá)對(duì)HIF-1α表達(dá)有負(fù)向調(diào)控作用(圖2E)。

注：A為lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)；B為miR-199a-5p和HIF-1α之間的結(jié)合位點(diǎn)；C為lncRNA ANRIL等雙熒光素酶活性檢測；D為HIF-1α等雙熒光素酶活性檢測；E為qRT-PCR分析HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平;**表示P<0.05。

2.3lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對(duì)U266細(xì)胞增殖活力的影響 分析圖3A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。分析圖3B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05);pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。

注：A為CCK-8檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達(dá)后對(duì)U266細(xì)胞增殖活力的影響；B為CCK-8檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對(duì)U266細(xì)胞增殖活力的影響;**表示P<0.05。

2.4lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響 分析圖4A、4B可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。分析圖4C、4D可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達(dá)后對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響；B為A中細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C為流式細(xì)胞術(shù)檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響；D為C中細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果;**表示P<0.05。

2.5lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對(duì)U266細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 分析圖5A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL和si-HIF-1α組細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。分析圖5B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

注：A為Western blot檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達(dá)后對(duì)Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達(dá)的影響;B為Western blot檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對(duì)Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達(dá)的影響。

2.6lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，過表達(dá)lncRNA ANRIL顯著促進(jìn)了HIF-1α表達(dá)(P<0.05)，而miR-199a-5p mimics組與mimics NC組相比顯著抑制了HIF-1α表達(dá)(P<0.05)，和miR-199a-5p mimics組對(duì)比，lncRNA ANRIL過表達(dá)質(zhì)粒和miR-199a-5p mimics同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后顯著促進(jìn)了HIF-1α表達(dá)(P<0.05)。見圖6。

3 討 論

已有研究表明，lncRNA和miRNA的異常表達(dá)與MM的進(jìn)展有關(guān)[9]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PDIA3P、lncRNA MALAT-1、lncRNA TUG1等在MM患者血漿中呈高表達(dá)[11-12]，而miR-193a、miR-29b-3p、miR-610等呈低表達(dá)[13]。既往研究報(bào)道，lncRNA ANRIL在多種癌癥如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌中可作為癌基因發(fā)揮作用[14-15]，而miR-199a-5p在多種癌癥如胃癌、膀胱癌、宮頸癌中可作為抑癌基因發(fā)揮功能[16]。因此，基于lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在癌癥中的作用，筆者推測lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸可能參與調(diào)控MM發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL在MM患者血漿中呈高表達(dá)，而miR-199a-5p在MM患者血漿中表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測ANRIL與miR-199a-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因檢測和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，miR-199a-5p是lncRNA ANRIL直接作用的靶點(diǎn)，在U266細(xì)胞中miR-199a-5p表達(dá)水平受到lncRNA ANRIL的負(fù)調(diào)控。本研究揭示了lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在MM細(xì)胞中的靶調(diào)控關(guān)系，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在MM中通過與miRNA競爭性結(jié)合發(fā)揮作用。例如，在MM中，lncRNA OIP5-AS1通過與miR-410競爭性結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。lncRNA CCAT1通過與miR-181a-5p競爭性結(jié)合抑制MM細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。因此，揭示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的潛在機(jī)制對(duì)于了解MM的惡性增殖具有重要意義。為了深入研究lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的作用機(jī)制，本研究中將lncRNA ANRIL下調(diào)質(zhì)粒、miR-199a-5p抑制劑或lncRNA ANRIL過表達(dá)質(zhì)粒與miR-199a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染U266細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA ANRIL表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-199a-5p表達(dá)則會(huì)得到相反的結(jié)果。lncRNA ANRIL過表達(dá)質(zhì)粒協(xié)同miR-199a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。雖然lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在神經(jīng)元損傷中的調(diào)節(jié)作用已被報(bào)道[19]，但鮮有其他報(bào)道證實(shí)lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在調(diào)節(jié)MM惡性增殖中的作用，這將為MM治療及復(fù)發(fā)防治提供理論指導(dǎo)。HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的一個(gè)亞基，在缺氧反應(yīng)時(shí)可受到疾病特異性miRNA的調(diào)控。例如，miR-199a通過調(diào)控HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌大鼠產(chǎn)生影響[20]。miR-200c下調(diào)HIF-1α并抑制肺癌細(xì)胞的遷移。miR-199a-5p是一種疾病特異性miRNA，調(diào)控腫瘤中多種惡性生物學(xué)行為。根據(jù)以往的報(bào)道，miR-199a-5p和miR-495在肺癌UPR通路中靶向調(diào)控GRP78[21]。此外，通過靶向HIF-1α-GSK3β-mPTP軸，下調(diào)miR-199a-5p可減弱心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[22]。然而，miR-199a-5p在MM中的具體作用機(jī)制尚不清楚。根據(jù)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測，HIF-1α是miR-199a-5p的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。因此，miR-199a-5p可能通過靶向調(diào)控HIF-1α在MM中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在MM患者的血漿中呈高表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因檢測和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，HIF-1α是miR-199a-5p的靶點(diǎn)，在U266細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)受miR-199a-5p的負(fù)調(diào)控。因此，本研究在U266細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p對(duì)HIF-1α的靶調(diào)控作用。此外，HIF-1α表達(dá)下調(diào)明顯抑制了U266細(xì)胞的增殖，表明HIF-1α對(duì)U266細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了MM患者血漿lncRNA ANRIL和HIF-1α表達(dá)上調(diào)，而miR-199a-5p表達(dá)下調(diào)。此外，lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p調(diào)控HIF-1α表達(dá)，影響細(xì)胞增殖和凋亡。這提示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p/HIF-1α軸可能作為治療MM的潛在靶點(diǎn)。