B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的調(diào)控機(jī)制研究①

傅增輝 林再紅 金 艷 姜 巖 劉 晶 于繪麗 張廣萍

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，齊齊哈爾 161002）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的慢性炎癥性脫髓鞘性自身免疫病。MS的臨床癥狀不僅包括運(yùn)動(dòng)障礙，還包括認(rèn)知缺陷［1-2］。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是已建立的MS模型，其特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥和神經(jīng)退行性變，并表現(xiàn)出與人類MS在臨床和組織病理學(xué)上的相似性［3-5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期的復(fù)發(fā)-緩解型MS患者維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（retinoicr acid-related orphanreceptorγt，RORγt）、B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激 活 因 子（B cell activating transcription factor，BATF）可能通過共同調(diào)控輔助性T細(xì)胞17（helper T cell 17，Th17）的分化，從而促進(jìn)Th17及其細(xì)胞因子IL-17高表達(dá)，促使MS的發(fā)生與進(jìn)展［6］。研究發(fā)現(xiàn)，RORγt在MS和EAE的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，BATF與RORγt在多種自身免疫病中具有關(guān)聯(lián)性［7-8］。本研究將通過髓鞘少突細(xì)胞糖蛋白多肽35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55）、完全弗氏佐劑（complete Freund"s adjuvant，CFA）和百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）誘導(dǎo)EAE模型，檢測小鼠Th17水平，觀察脊髓組織BATF、RORγt、IL-17的表達(dá)及病理表現(xiàn)，旨在探討B(tài)ATF與EAE發(fā)病關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt的關(guān)系，為進(jìn)一步研究及臨床治療提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體質(zhì)量18～20g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（黑）2016-001。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定，并通過齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。建模前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)1周。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、EAE組、EAE+甲潑尼龍（methylprednisolone，MP）組，每組10只。

1.1.2 主要試劑MOG35-55（批號(hào)：20190415020）購自英國Biorbyt公司；CFA（批號(hào)：201907143）購自美國Invivogen公司；將10 mg MOG35-55溶于2 ml生理鹽水，并與含2.5 mg/ml結(jié)核桿菌的CFA等體積混合，使用玻璃注射器反復(fù)抽打至完全融合，制成油包水樣乳劑。PTX（批號(hào)：19024392）購自英國Abnova公司；IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)：EF19014060）購自美國LSM公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)：1902250101）購自上海生工生物工程有限公司；勒克斯固藍(lán)（Luxol Fast Blue，LFB，批號(hào)：19066032）購自上海歌凡生物科技有限公司；淋巴細(xì)胞分離液（批號(hào)：1906460143）購自美國Sigma公司；FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體（批號(hào)：6110899）、Alexa Fluor 647標(biāo)記的大鼠抗小鼠IL-17抗體（批號(hào)：201907140214）均購自美國BD Pharmingen公司；臺(tái)盼藍(lán)染色液（批號(hào)：19036326）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；BATF、RORγt和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；Trizol試劑（批號(hào)：19013621）購自Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RP1105）購自美國Solarbio公司；熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)：190500310）購自美國Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立和干預(yù)措施［9］以2%（質(zhì)量濃度）戊巴比妥麻醉小鼠，按3 ml/kg給予小鼠背部沿脊柱中線兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射抗原乳劑0.2 ml，分別于0 h、48 h腹腔注射給予小鼠PTX 200 ng建立EAE模型。正常對照組小鼠以同法背部皮下注射不含MOG35-55和結(jié)核桿菌的乳劑。EAE+MP組在EAE組的基礎(chǔ)上，造模后第12天，小鼠發(fā)病達(dá)高峰時(shí)開始給予MP（100 mg/kg），每日以生理鹽水稀釋后自尾靜脈緩慢注入，1次/d，連續(xù)3 d后均減半藥量再給藥2 d，共給藥5次。自免疫當(dāng)天起，隔天觀察并記錄小鼠行為特征，采用五分法對小鼠進(jìn)行Kono"s評(píng)分［10］。0分：活動(dòng)正常，無明顯臨床癥狀；1分：尾部無力；2分：后肢無力，翻轉(zhuǎn)后可自行恢復(fù)；3分：尾部及雙后肢癱瘓，翻轉(zhuǎn)后不能自行恢復(fù)；4分：四肢癱瘓；5分：瀕臨死亡或死亡。神經(jīng)功能評(píng)分≥1分即認(rèn)為發(fā)病。共觀察26 d。

1.2.2 血清IL-17水平檢測免疫后第26天，取小鼠眼眶血至EP管，室溫靜置2 h，4℃、3 000 r/min離心20 min，離心半徑8 cm，收集上清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測時(shí)取適量血清，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.3 組織標(biāo)本采集免疫后第26天，以2%（質(zhì)量濃度）戊巴比妥麻醉小鼠，預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，打開腹腔暴露脾臟，用鑷子輕輕取出脾臟，采集脊髓組織，部分以4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛固定后制成石蠟切片，剩余組織置于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 脾臟淋巴細(xì)胞中Th17表達(dá)將脾臟置于200目無菌篩網(wǎng)，剪碎后碾磨，PBS（pH=7.4）沖洗，收集細(xì)胞懸液添加至淋巴細(xì)胞分離液。密度梯度離心，比重1.088±0.001，450 g、10 min，臺(tái)盼藍(lán)染色確保細(xì)胞存活率＞95%。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入2μl PMA/離子霉素混合物或BFA/莫能霉素混合物，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。Th17染色：加入4μl FITC標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，4℃避光孵育30 min，洗滌，加入100μl破膜劑A液，室溫避光孵育5 min，鞘液洗滌1次后，加入50μl破膜劑B液，再加入2μl Alexa Fluor 647標(biāo)記的IL-17抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細(xì)胞儀檢測，并應(yīng)用CytExpert2.0.0.153軟件分析。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 病理染色染色前，將切片在二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水化（100% 5 min，85% 5 min，70%5 min），PBS沖洗。按照說明書要求，對脊髓切片進(jìn)行HE和LFB染色［11-12］。分別評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤和脫髓鞘。HE染色在光學(xué)顯微鏡下（×400）分析每只小鼠5個(gè)不同的切片。LFB染色觀察每個(gè)切片的脊髓白質(zhì)內(nèi)至少10個(gè)（×40）隨機(jī)分布的視野。使用Image-Pro Plus軟件對被LFB藍(lán)色覆蓋的面積進(jìn)行定量，并表示為所檢查白質(zhì)總面積的百分比（LFB藍(lán)色占比）。計(jì)算每只小鼠LFB藍(lán)色占比的平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達(dá)將凍存組織在液氮中研磨，加Trizol提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：37℃孵育60 min，85℃溫育5 min，逆轉(zhuǎn)錄后5倍稀釋cDNA，取2μl cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-actin正向引物：3"-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-5"，反向引物：3"-AGGGACTTCCTGTAACAATGCA-5"；BATF mRNA正向引 物：3"-AGCGAAGAACCTGGAGAAACA-5"，反 向引 物：3"-TTCAGCACCGACGTGAAGTA-5"；RORγt mRNA正 向 引 物：3"-GGCTCCCTGGATGAATAGAATG-5"，反向引物：3"-AGGCAGAGGCAGAAAATGTAAAG-5"。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6 min。按照2-ΔΔCt相對定量計(jì)算公式計(jì)算各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，分析目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE小鼠臨床癥狀評(píng)分自免疫后第10天開始，EAE小鼠陸續(xù)出現(xiàn)臨床癥狀，EAE模型組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分于第24天達(dá)高峰，隨后有所緩解；EAE+MP組小鼠于治療第6天（免疫后第18天）開始，其神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于EAE組（均P＜0.05），見圖1。

2.2 EAE小鼠血清IL-17蛋白表達(dá)水平與對照組相比，EAE組小鼠血清IL-17蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組顯著降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組小鼠脾臟組織Th17/CD4+水平與對照相比，EAE組Th17/CD4+升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組顯著降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達(dá)水平與對照相比，EAE組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；給予MP治療的EAE+MP組較EAE組均顯著降低（均P＜0.05），見圖4。

圖1 各組小鼠臨床癥狀評(píng)分比較Fig.1 Comparison of clinical symptom scores of mice in each group

圖2 各組小鼠血清IL-17蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of serum IL-17 protein expression level of mice in each group

圖3 各組小鼠脾臟組織Th17/CD4+比較Fig.3 Comparison of Th17/CD4+in spleen of mice in each group

圖4 各組小鼠脊髓組織BATF、RORγt mRNA表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of expression levels of BATF and RORγt mRNA in spinal cord of mice in each group

圖5 各組小鼠HE和LFB病理染色結(jié)果Fig.5 Pathological staining results of HE and LFB in mice of each group

2.5 各組小鼠HE和LFB病理染色結(jié)果 如圖5所示，HE染色檢查每只小鼠的脊髓切片中單核細(xì)胞的浸潤情況，EAE小鼠的脊髓切片中有許多血管周圍的單核浸潤細(xì)胞簇，而對照組小鼠的脊髓中沒有這些炎癥細(xì)胞浸潤。給予MP治療的EAE+MP組較EAE組小鼠脊髓中觀察到較少的細(xì)胞浸潤。EAE組LFB藍(lán)色占比較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明EAE小鼠有明顯的神經(jīng)髓鞘脫失；而MP治療的EAE+MP組LFB藍(lán)色占比較EAE組小鼠明顯增多，代表MP治療可減輕神經(jīng)髓鞘的脫失。

2.6 相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，EAE組（n=10）小鼠脊髓BATF mRNA與血清IL-17表達(dá)、脾臟組織Th17/CD4+水平、脊髓RORγt mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.833、r=0.716、r=0.514，均P＜0.05）；EAE組小鼠脊髓BATF mRNA與LFB染色藍(lán)色占比呈負(fù)相關(guān)（r=-0.801，P＜0.05）。

3 討論

糖皮質(zhì)激素是目前臨床用于控制MS急性加重期最重要的藥物之一。糖皮質(zhì)激素可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子等機(jī)制達(dá)到治療EAE的作用［13］。構(gòu)建EAE小鼠模型，并予MP治療，其神經(jīng)損害表現(xiàn)得到明顯改善，Kono"s評(píng)分降低；而模型組病情無改善，Kono"s評(píng)分升高。說明MP可使EAE的癥狀緩解、縮短病程。Th17作為CD4+T細(xì)胞的一種亞群，其不同于Th1、Th2和Treg，已被證實(shí)在神經(jīng)免疫疾病中扮演重要角色。IL-17是一類由Th17分泌的具有多重功效的細(xì)胞因子，在Th17中高表達(dá)，可通過誘導(dǎo)各種促炎因子和趨化因子等參與局部組織的炎癥反應(yīng)，在炎癥和自身免疫病，特別MS中發(fā)揮重要作用。EAE小鼠將產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)繼給健康小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生嚴(yán)重的EAE，并且發(fā)現(xiàn)IL-17的受體受阻或IL-17缺陷的小鼠抵抗EAE［14-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EAE小鼠IL-17表達(dá)較對照組明顯增多，而給予MP可降低IL-17水平。

BATF為AP-1超家族成員，激活蛋白酶1（AP-1）可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，AP-1與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)特定基因的轉(zhuǎn)錄引起的細(xì)胞增殖、分化有關(guān)［16］。SCHRAML等［17］發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的BATF-/-的CD4+和CD8+T細(xì)胞IL-17水平下降，上調(diào)BATF后IL-17水平上升；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BATF-/-的小鼠T細(xì)胞不能誘導(dǎo)Th17相關(guān)細(xì)胞因子如RORγt等的表達(dá)分化。RORγt是控制Th17分化的特異因子，CD4+T細(xì)胞在某些細(xì)胞因子的協(xié)同刺激中，激活Stat3途徑誘導(dǎo)RORγt表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)未致敏的CD4+T細(xì)胞向Th17分化。RORγt在Th17高表達(dá)，可誘導(dǎo)IL-17基因表達(dá)，參與多種炎癥反應(yīng)和自身免疫病的病理變化，阻斷RORγt基因，則Th17分化受到抑制，IL-17表達(dá)下調(diào)［18-19］。

本研究利用MOG35-55、CFA和PTX建立EAE小鼠模型，結(jié)果顯示，BATF與RORγt的表達(dá)顯著高于對照組，病理切片脊髓中血管周圍有大量單核細(xì)胞浸潤，IL-17及炎癥細(xì)胞的表達(dá)同樣顯著升高，表明BATF和RORγt在EAE的炎癥中發(fā)揮重要作用，與既往結(jié)論相一致，而將MP給予EAE小鼠后則與之相反。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠脊髓BATF、RORγt的表達(dá)與IL-17蛋白表達(dá)及脊髓神經(jīng)髓鞘脫失程度呈正相關(guān)。提示BATF和RORγt可能通過調(diào)控Th17的分化發(fā)育，進(jìn)而影響其關(guān)鍵炎癥細(xì)胞和因子，從而調(diào)控中樞神經(jīng)的炎癥。SCHRAML等［17］在敲除BATF基因時(shí)，IL-17表達(dá)下降，此時(shí)即使用慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)RORγt，也并不能增加IL-17的表達(dá)。在RORγt缺乏時(shí)，過表達(dá)BATF可引起IL-17水平上調(diào)。由于RORγt是調(diào)控Th17分化發(fā)育的特異性轉(zhuǎn)錄因子，課題組推測，缺乏RORγt可能會(huì)引起Th17分化過程受阻，從而一定程度上減少EAE等自免疾病的發(fā)病，這與SCHRAML等［17］的結(jié)論相反，提示在BATF缺乏的條件下，RORγt不能通過誘導(dǎo)BATF的產(chǎn)生而促進(jìn)Th17分化，但BATF可以誘導(dǎo)RORγt的產(chǎn)生。由于BATF和RORγt在IL-17的表達(dá)中均扮演必要角色，因此，BATF和RORγt在Th17的分化發(fā)育及表達(dá)中可能有協(xié)同作用。且本實(shí)驗(yàn)中EAE小鼠模型脊髓組織中BATF與RORγt的表達(dá)及其與EAE小鼠脊髓髓鞘脫失、細(xì)胞因子的表達(dá)具有相關(guān)性，BATF在EAE炎癥中的重要作用可能是通過調(diào)控RORγt表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，與研究組前期的臨床研究結(jié)果相符，但BATF與RORγt間的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。