中性粒細胞在膿毒癥中的作用及研究進展①

謝楠茜 張亞星 李甜甜 劉 丹 鄭月娟（上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院中醫(yī)藥免疫中心，上海 201203）

膿毒癥是一種機體對感染反應失調(diào)導致的危及生命的器官功能障礙［1］。主要由感染引起的伴隨有全身性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的一種危重疾病，病死率高達30%～70%［2］。其主要病機是感染的清除障礙引發(fā)免疫失調(diào)，系統(tǒng)性炎癥反應和凝血功能障礙，最終導致多器官功能衰竭，甚至休克［3］。在膿毒癥早期，局部感染不能被有效控制導致固有免疫細胞的過度活化，從而引發(fā)“細胞因子風暴”，導致SIRS。膿毒癥晚期，大量免疫細胞由于早期的過度活化而損傷或死亡，引發(fā)免疫功能低下和持續(xù)的免疫抑制，從而造成膿毒癥的復發(fā)或者繼發(fā)感染［4］。膿毒癥的高發(fā)病率和高病死率一直是醫(yī)學界面臨的巨大挑戰(zhàn)，主流治療包括抗感染和支持治療，尚無特異性的治療方案［5］。

膿毒癥患者的免疫功能狀態(tài)與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)，免疫調(diào)節(jié)治療成為研究的一個熱點。在膿毒癥中，中性粒細胞參與抗感染、炎癥誘導和組織病理損傷，同時也存在中性粒細胞的功能障礙和遷移功能異常。在最初的炎癥反應中，膿毒癥引起的全身炎癥性反應導致了中性粒細胞的過度產(chǎn)生和過度反應；然而未消退的炎癥將導致中性粒細胞發(fā)揮抗炎作用，促使膿毒癥患者進入免疫抑制狀態(tài)；此時存在中性粒細胞的數(shù)量和功能不足，又可能造成膿毒癥的復發(fā)及院內(nèi)繼發(fā)感染，患者的病死率將大幅度提高［3］。本文綜述了在膿毒癥中，中性粒細胞的數(shù)量、半衰期、抑制性細胞類群、生物學行為及其功能，并探討中性粒細胞作為治療靶點的研究現(xiàn)狀和應用前景。

1 膿毒癥時中性粒細胞數(shù)量、半衰期的改變

中性粒細胞是一種多形核白細胞，是人類免疫系統(tǒng)中最豐富的循環(huán)白細胞群，占健康成人所有循環(huán)白細胞的50%～70%［6］。其在感知和清除細菌和真菌等微生物方面具有很高的效力。中性粒細胞減少癥患者更易發(fā)生微生物感染［7］。

1.1 數(shù)量增加通常認為中性粒細胞起源于骨髓內(nèi)共同髓系祖細胞（common myeloid progenitor，CMP），但最近研究發(fā)現(xiàn)其起源于淋巴預處理的多潛能祖細胞（lymphoid-primed multipotent progenitor，LMPP），LMPP由造血干細胞分化而來，可以進一步分化為粒細胞-單核細胞前體（granulocyte-monocyte progenitor cell，GMP），繼而經(jīng)歷原始粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞、帶狀中性粒細胞等分化階段，最終發(fā)育為成熟的中性粒細胞［8］。

中性粒細胞是最早從血液中遷移到感染和炎癥部位的吞噬細胞，具有數(shù)量多、更新快、壽命短的特點。成人骨髓每天可產(chǎn)生（1～2）×1011個中性粒細胞。當細菌感染，骨髓受到炎癥因子刺激時，可增至1×1012個以補充其在循環(huán)中的數(shù)量，其中包含大量的未成熟中性粒細胞［9］。成熟的中性粒細胞表面標志為CD11b+Ly6G+CXCR2+CD101+，而不成熟的中性粒細胞不表達CXCR2和CD101［10］。因此，計算血液循環(huán)中不成熟中性粒細胞與中性粒細胞總數(shù)的比例可以作為SIRS的診斷參考。

在正常情況下，中性粒細胞在骨髓內(nèi)的遷移取決于滯留信號和釋放信號的平衡，分別由趨化因子受體CXCR4與配體CXCL12以及CXCR2與配體CXCL1/2這兩對分子介導的，最終僅有一小部分成熟的中性粒細胞釋放到血液中［11］。CXCR4/CXCL12和VLA-4/VCAM-1信號途徑對于中性粒細胞在骨髓內(nèi)滯留起關(guān)鍵作用，當這些分子表達下調(diào)，可以促使中性粒細胞從骨髓內(nèi)釋放。CXCR2對于中性粒細胞釋放起作用，其配體包括趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL6。故CXCR4/CXCL12和CXCR2/CXCL1/2兩個信號分子對的拮抗作用共同決定了中性粒細胞從骨髓向血循環(huán)的遷移比例。血循環(huán)中衰老的中性粒細胞也可通過上調(diào)CXCR4和CCR5以及下調(diào)CXCR2和CD62L表達，而歸巢于骨髓，從而被骨髓內(nèi)巨噬細胞清除［12］。中性粒細胞滯留和釋放的穩(wěn)定有助于維持骨髓中中性粒細胞的數(shù)量，以應對突發(fā)的感染狀況。

膿毒癥患者往往表現(xiàn)為外周血中性粒細胞的大量和快速增加，而釋放入外周中性粒細胞增多可導致骨髓內(nèi)中性粒細胞儲存池耗竭，使未成熟細胞釋放入血。未成熟中性粒細胞的識別、吞噬能力低下，不能有效清除病原體；其變形性差，更易在毛細血管內(nèi)積聚，引起血管閉塞、組織缺氧，造成器官損傷［13］。

在膿毒癥時，促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和細菌產(chǎn)物可以促進粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）的 表達，促進中性粒細胞的分化和成熟。此外，在膿毒癥中，骨髓內(nèi)CXCL12的表達下調(diào)，CXCL1升高，從而促使中性粒細胞釋放到血液中［14］。G-CSF可誘導CD34+粒系祖細胞增殖分化，也可通過抑制CXCR4/CXCL12信號軸來促進成熟中性粒細胞從骨髓遷出。

1.2 凋亡減少、半衰期延長在穩(wěn)態(tài)條件下，人和小鼠的中性粒細胞在血流中的半衰期為6～12 h，然后進入脾臟、淋巴結(jié)、肝臟或骨髓組織中，停留1～2 d執(zhí)行吞噬和殺傷功能，最終經(jīng)歷自發(fā)凋亡，被單核/吞噬細胞清除［15-16］。中性粒細胞表達抗凋亡蛋白Mcl-1（myeloid cell leukaemia-1）抑制中性粒細胞凋亡。在嚴重膿毒癥患者中，Mcl-1顯著增加，抑制中性粒細胞凋亡，促進其壽命增加了幾倍［17］。細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和補體5a（component 5a，C5a）可延長中性粒細胞的壽命［3］。涉及如下信號通路，LPS和C5a激活中性粒細胞胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2通路、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3 kinases，PI3K）和下游Akt通路，促進下游的抗凋亡蛋白Bad磷酸化，從而抑制細胞色素C從線粒體釋放，減少凋亡。C5a還能增強抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達，降低促凋亡蛋白Bim的表達。此外，LPS可抑制髓核分化抗原（myeloid nuclear differentiation antigen，MNDA）遷移和裂解，從而阻止Mcl-1被蛋白酶體降解。中性粒細胞的壽命延長可使其在組織中進行更復雜的活動，如有助于炎癥的消除或引發(fā)適應性免疫應答，但其在組織中的持續(xù)存在也可導致組織器官的損傷［18］。

2 中性粒細胞的異質(zhì)性與膿毒癥

循環(huán)中的中性粒細胞具有相對較低的轉(zhuǎn)錄活性和短壽命的特點，因此一直被認為是終末分化的細胞，具有保守表型和功能的同質(zhì)群體。但最近通過功能表型分析，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞在慢性炎癥和腫瘤中也存在異質(zhì)性［19］。異質(zhì)的中性粒細胞表型的概念最初是由GALLIN提出。隨后，許多研究證實在炎癥狀態(tài)下，存在不同中性粒細胞亞群，其具有免疫激活或免疫抑制等不同的作用［20］。

中性粒細胞的異質(zhì)性和可塑性主要體現(xiàn)在細胞核形態(tài)、細胞密度、中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET）釋放與否及受體表達等特征方面［21］。中性粒細胞亞群的改變情況，可能用于炎癥的風險評估。

2.1 低密度中性粒細胞（low density neutrophil，LDN）中性粒細胞通常是通過密度梯度離心的方法從外周血中分離出來的。絕大多數(shù)中性粒細胞比淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque）比重大，被稱為正常密度中性粒細胞（normal density neutrophil，NDN）；而輕于該分離液的細胞，被稱為LDN，NDN通常包括終末分化的和不成熟的中性粒細胞。在穩(wěn)定狀態(tài)下，終末分化的中性粒細胞處于靜止狀態(tài)。系統(tǒng)性炎癥促進中性粒細胞新生，也促進不成熟中性粒細胞遷移入血，這個現(xiàn)象稱為緊急粒細胞生成［22］。這些不成熟中性粒細胞多為晚幼粒細胞或帶狀中性粒細胞，其密度被認為與成熟中性粒細胞相似。因此，大多在緊急粒細胞生成狀態(tài)下遷移入血的不成熟粒細胞屬于NDN，少數(shù)屬于LDN［23］。有意思的是，LDN中存在一個具有免疫抑制功能的亞群，在實體腫瘤、惡性血液病、HIV感染和膿毒癥等多種疾病中可以發(fā)現(xiàn)這個抑制性LDN亞群的增加［24］。該亞群可以抑制T細胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生，被定義為免疫抑制性LDN，也因其不成熟表型被認為是粒細胞樣-髓源抑制細胞（granulocytic-myeloid derived suppressor cells，G-MDSC），但還沒有證據(jù)表明G-MDSC等同于這群LDN［25］。LDN中還有促炎性LDN亞群（pro-inflammatory LDN），在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎等重癥自身免疫病中被發(fā)現(xiàn)［26］。故根據(jù)細胞密度，中性粒細胞可分為LDN和NDN。

LDN在膿毒癥的免疫抑制階段起關(guān)鍵的作用。在膿毒癥患者中，G-MDSC中包括低密度粒細胞群（low density granulocyte，LDG），通過精氨酸酶依賴機制抑制T細胞功能，增加患者院內(nèi)感染的風險［27］。

2.2 CD16brightCD62Ldim中性粒細胞 在穩(wěn)定狀態(tài)下，血循環(huán)中的成熟中性粒細胞通常呈現(xiàn)CD16brightCD62Lbright的表型，其細胞核呈分葉核形態(tài)；創(chuàng)傷早期可導致大量的不成熟中性粒細胞迅速進入外周血循環(huán)，其為CD16dimCD62Lbright表型，細胞核呈帶狀；幾天后CD16brightCD62Ldim中性粒細胞可以被檢測到，其細胞核呈現(xiàn)高度分葉狀態(tài)［28］。

在系統(tǒng)性炎癥中，CD16brightCD62Ldim中性粒細胞被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制表型。PILLAY等［29］的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激，健康人群外周血循環(huán)中CD16bright和CD16dim中性粒細胞都明顯升高，CD16bright和CD16dim中性粒細胞分別呈現(xiàn)分葉核和帶狀核形態(tài)，其中CD16dim中性粒細胞的抗菌功能減弱。進一步鑒定發(fā)現(xiàn)了一個新的具有免疫抑制活性的成熟亞群，其表面標記為CD16brightCD62Ldim，這群細胞能夠釋放活性氧化合物（reactive oxygen species，ROS）并抑制T細胞增殖［30］。也能通過ROS抑制漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞的功能。IFN-γ可刺激中性粒細胞表達程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制淋巴細胞增殖，參與SIRS［31］。在給予健康志愿者低劑量內(nèi)毒素誘導的人內(nèi)毒素血癥模型中，成熟的CD16brightCD62Ldim中性粒細胞同樣可以抑制T細胞增殖［30］。

多個研究報道，膿毒癥患者體內(nèi)的G-MDSC水平升高，G-MDSC由未成熟和成熟的粒細胞組成，以ROS和精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）依賴的方式抑制T細胞增殖和活化［32］。UHEL等［27］也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者外周血中CD14-CD15+低密度G-MDSC、Arg-1和S100A12的表達顯著升高，與膿毒癥患者增加的院內(nèi)感染風險相關(guān)。DEMARET等［33］也發(fā)現(xiàn)，在膿毒性休克的患者中，未成熟CD10dimCD16dim中性粒細胞比例升高，與死亡率增加有關(guān)。在膿毒癥中，分泌抑炎癥細胞因子IL-10的抑制性中性粒細胞亞群可以被誘導表達。

中性粒細胞亞群也可能只是中性粒細胞在病理狀態(tài)下的生物學表型改變的反映，因此，中性粒細胞是否具有異質(zhì)性還需要更仔細地評價。

3 膿毒癥時中性粒細胞移行異常

中性粒細胞的移行體現(xiàn)在中性粒細胞離開骨髓釋放入血，以及從血液向感染部位的趨化和募集。涉及中性粒細胞在血管內(nèi)皮細胞表面的滾動、黏附、細胞變形、跨內(nèi)皮細胞移行、釋放和募集等過程，受到趨化因子及其受體以及黏附分子表達的調(diào)控。中性粒細胞的移行對于感染清除和膿毒癥的發(fā)展進程和預后都十分重要。在膿毒癥早期，過多的遷移可導致炎癥加?。辉谙到y(tǒng)性炎癥期間，由于中性粒細胞被招募并遷移到外周組織中，因此越來越多未成熟的中性粒細胞從骨髓中釋放，以補充循環(huán)粒細胞池；在后期則遷移行為異?？蓪е戮植恐行粤＜毎麛?shù)量的減少和免疫功能抑制，使得感染不能控制，進而加劇膿毒癥的發(fā)展。

中性粒細胞具有活躍的變形運動能力。在血管內(nèi)遷移過程中，中性粒細胞通過滾動、黏附和爬行而黏附到血管內(nèi)皮細胞。中性粒細胞表達的黏附分子受體與內(nèi)皮細胞上相應配體的相互作用使得循環(huán)中性粒細胞牢固黏附于血管的管腔表面。在到達合適的外滲部位后，中性粒細胞通過侵入、血管周圍嵌入和爬行、突出等方式穿過內(nèi)皮細胞、周細胞和基底膜，之后，中性粒細胞開始間質(zhì)遷移［34］。中性粒細胞遷移是重癥膿毒癥病原體清除的關(guān)鍵。

3.1 黏附和滾動的改變和細胞僵化（rigid）中性粒細胞的起始黏附和滾動是中性粒細胞遷移至炎癥部位的始動階段，也是膿毒癥炎癥反應的一個關(guān)鍵步驟，在此過程中需要細胞變形。機體感染時，細菌來源的LPS等物質(zhì)可刺激機體產(chǎn)生炎癥因子TNF-α、IL-1β等，誘導炎癥部位血管內(nèi)皮細胞表達P-選擇素、E-選擇素，與中性粒細胞表面P-選擇素配體、E-選擇素配體和L-選擇素低親和力結(jié)合，介導起始黏附；在趨化因子及其受體的相互作用下，誘導滾動，并促進中性粒細胞的β2整合素淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（1ymphocyte function associated antigen 1，LFA-1）和巨噬細胞分化抗原1（macrophage-1 antigen，MAC-1）活化聚集，與炎癥誘導表達的內(nèi)皮細胞上的相應配體細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和ICAM-2結(jié)合，誘導中性粒細胞滾動停止和與內(nèi)皮細胞間的穩(wěn)定黏附。

膿毒癥引起的中性粒細胞和內(nèi)皮細胞黏附分子表達譜的改變進一步促進了中性粒細胞在血管系統(tǒng)中的牢固黏附。膿毒癥時，細菌產(chǎn)物和炎性因子刺激中性粒細胞的L-選擇素脫落，表達β-整合素，并促進肺微血管內(nèi)皮表面黏附分子ICAM-1、血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）暴露，二者結(jié)合，促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的高親和力結(jié)合，導致細胞起始黏附和滾動能力下降，并進一步誘導細胞變形能力下降和細胞僵化。

膿毒癥時，促炎因子和細菌產(chǎn)物可促進過氧化物酶體增殖體激活受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptorγ，PPARγ）激活，導致中性粒細胞膜下變形性相關(guān)的F-肌動蛋白的累積，中性粒細胞僵化，變形性降低，滾動減少，黏附性增強，從而導致中性粒細胞遷移的始動階段受阻礙。細胞僵化與膿毒癥的嚴重程度密切相關(guān)，導致中性粒細胞在毛細血管床中積聚，特別是積聚在肺和肝血竇的毛細血管，進而導致微血管閉塞，組織缺血繼而發(fā)生多器官衰竭［10］。膿毒癥可引起肺臟血管內(nèi)中性粒細胞增多和肺部損傷。

3.2 跨細胞遷移的改變中性粒細胞遷移過程包括其通過血管內(nèi)皮細胞間的緊密連接進入感染部位的過程。此過程需要趨化因子如甲酰-甲硫基-亮氨酰-苯丙氨（formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP）、白三烯B4、IL-8等與趨化因子受體結(jié)合。人和動物研究均表明，在重癥膿毒癥中，盡管感染局部有大量趨化因子存在，但中性粒細胞向感染部位的遷移仍然不充分。趨化因子受體CXCR2表達上調(diào)和CCR2表達下調(diào)以及PPARγ的上調(diào)都參與介導中性粒細胞遷移的異常［3］。

在重癥膿毒癥患者和動物模型中，均存在中性粒細胞趨化因子受體CXCR2表達下調(diào)，及其對趨化因子的應答能力下降。其機制涉及：①反復長期的趨化因子和配體刺激導致中性粒細胞的G-蛋白偶聯(lián)受體激活，并募集G-蛋白偶聯(lián)受體激酶（GPCR kinase，GRK）到細胞膜上，誘導G-蛋白偶聯(lián)受體磷酸化，導致趨化因子受體失去敏感性；②細菌的磷壁酸、LPS和非甲基化CpG寡核苷酸激活中性粒細胞的TLR 2、4、9通路，上調(diào)GRK2表達，誘導CXCR2內(nèi)化；③NO及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）與中性粒細胞遷移受損呈正相關(guān)。增強的中性粒細胞一氧化氮（nitric oxide，NO）反應啟動可溶性鳥苷基環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）激活，環(huán)化核苷酸形成和蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）磷酸化，誘導GRK2表達，促進CXCR2內(nèi)化；④磷酸肌醇三激酶γ（PI3Kγ）信號可負調(diào)節(jié)CXCR2的內(nèi)化。中性粒細胞內(nèi)PPARγ產(chǎn)生也可以NO和ERK1/2依賴的方式負調(diào)節(jié)中性粒細胞遷移［3］。

膿毒癥患者中性粒細胞中CCR2呈高表達，且CCL2趨化能力增高，CCR2的表達水平與病情嚴重程度呈正相關(guān)。病原體及其產(chǎn)物激活TLR2信號通路，通過MyD88/NF-κB途徑上調(diào)CCR2的表達，促進中性粒細胞遷移至非炎癥部位，引起器官損傷。CCR2敲除可以提高膿毒癥小鼠的存活率。

4 中性粒細胞的功能改變與膿毒癥

在膿毒癥中，中性粒細胞被系統(tǒng)性地激活，并迅速遷移到炎癥或損傷區(qū)域，通過許多不同的機制，包括趨化作用、吞噬作用、ROS釋放、顆粒酶和細胞因子的產(chǎn)生和釋放以及形成NET來接觸和殺死微生物，并通過與其他免疫細胞（如淋巴細胞和抗原呈遞細胞）相互作用調(diào)節(jié)免疫反應［35］。同時，中性粒細胞也是急性炎癥過程中導致組織損傷的重要效應細胞［36］。在嚴重膿毒癥患者中，不僅在功能衰竭的器官中發(fā)現(xiàn)大量的中性粒細胞，而且該中性粒細胞群的功能也發(fā)生了顯著改變，功能障礙程度與膿毒癥的嚴重程度呈正相關(guān)［37］。

4.1 中性粒細胞呼吸爆發(fā)及脫顆粒殺菌機制中性粒細胞是參與宿主抵抗的重要吞噬細胞，通過氧依賴和非氧依賴機制清除被吞噬的病原體。氧依賴機制主要是中性粒細胞受到刺激后，在吞噬體膜上組裝成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶復合體，產(chǎn)生大量的超氧陰離子和ROS，這些分子可以與細菌細胞膜、核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應，能夠有效殺傷入侵的病原體。此外，ROS可以通過上調(diào)細胞因子及黏附分子的表達水平，放大炎癥效應，參與形成細胞因子風暴。在該過程中，中性粒細胞耗氧量激增，達到正常消耗量的2～20倍，稱為呼吸爆發(fā)。非氧依賴機制主要是通過中性粒細胞內(nèi)胞漿顆粒介導。中性粒細胞有4種胞漿顆粒：嗜天青顆粒、特異性顆粒、三級顆粒和分泌小泡。這些胞漿顆粒含有豐富的酶類物質(zhì)和殺菌物質(zhì)，包括髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、絲氨酸蛋白酶（neutrophil serine protease，NSP）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和其他殺菌物質(zhì)等對病原體起到殺傷作用［24］。這些殺菌機制是抵御微生物入侵的有效手段，在炎癥過程中發(fā)揮了有效的作用。

膿毒癥中，過度激活的中性粒細胞浸潤聚集在重要器官中，通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的ROS，以及脫顆粒作用釋放殺菌物質(zhì)，直接或間接造成重要組織器官損傷。呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的大量氧自由基促使線粒體的跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)功能紊亂，最主要的是形成鈣超載。鈣離子（Ca2+）是體內(nèi)重要的第二信使，參與細胞的興奮-收縮耦聯(lián)。鈣超載破壞了細胞內(nèi)外Ca2+濃度的穩(wěn)態(tài)，致使線粒體內(nèi)Ca2+大量聚積，使細胞無法維持正常功能，從而導致線粒體、細胞、組織功能障礙。大量促炎癥性因子和宿主自身的抗炎因子釋放誘導產(chǎn)生ROS，導致體內(nèi)氧化-還原狀態(tài)失衡，引起氧化性應激反應，最終傷及組織器官。氧化應激損傷機制是病原體及其毒素激活的過度的炎癥反應和持續(xù)釋放大量的炎癥介質(zhì)，共同影響線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈的耦聯(lián)過程，造成ROS生成增多，從而損傷全身血管內(nèi)皮細胞功能，增加血管通透性，破壞線粒體功能，最終導致膿毒癥患者各器官和系統(tǒng)功能障礙。

4.2 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）中性粒細胞可以通過產(chǎn)生NET捕獲和清除未被吞噬的病原體。NET的形成過程被稱作中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)凋零（NETosis），是一種程序性死亡方式。NET又被稱為中性粒細胞胞外陷阱，是一種以DNA為骨架，鑲嵌了組蛋白胞漿顆粒來源的酶和抗微生物肽等的大分子的網(wǎng)狀物［38］。NET可被多種因素誘導形成，如PAMP、細胞因子IL-6、IL-8、自噬小體、抗原抗體復合物和血小板等。當中性粒細胞受刺激活化后，細胞變平坦并附著于基質(zhì)上，隨后細胞核染色質(zhì)逐漸去濃縮變得疏松，分葉核消失，核膜與胞漿內(nèi)的顆粒膜融合，顆粒內(nèi)蛋白與疏松的染色質(zhì)混合，最后激活消皮素D（gasdermin D，GSDMD）蛋白，介導細胞膜破裂，附著有顆粒源性蛋白的染色質(zhì)纖維釋放到細胞外，形成了NET。目前認為，NETosis有自殺性NETosis（suicidal NETosis）與存活的NETosis（vital NETosis）兩種主要形式。前者，細胞被裂解，解聚的染色質(zhì)構(gòu)成的NET被釋放到細胞外；后者則保持細胞完整性，線粒體DNA構(gòu)成的NET以出芽方式釋放［39］。NET在炎癥部位大量產(chǎn)生，其儲存了廣譜、大量、高效的抗菌物質(zhì)，捕獲并殺死各種病原體，防止擴散。

膿毒癥早期，NET可以形成物理屏障，利于病原體的捕獲和清除，阻止其擴散，從而抑制膿毒癥的進程。隨著病情進展，NET可能導致組織損傷、自身免疫加強以及血管血栓的形成。敗血癥患者常發(fā)生急性肺損傷，從患者血漿檢測出豐富的NET，提示其與膿毒癥嚴重程度及病死率相關(guān)。MPO-DNA復合物水平與器官功能障礙及28 d病死率也密切相關(guān)。膿毒癥患者及休克患者血漿中游離DNA含量增加，病死率提高。這可能是NET作為一種DAMP，通過活化TLR9受體啟動炎癥反應，促進炎癥細胞在組織器官中浸潤，加重組織臟器損傷［39］。組蛋白是NET的重要殺菌成分，抗菌的同時對內(nèi)皮細胞有細胞毒性，可以損傷內(nèi)皮細胞并且影響微血管灌注；并且可以通過促進凝血酶的生成、活化血小板和抑制抗凝血劑，促進DIC和血栓形成。中性粒細胞通過NET-血小板-凝血酶軸，促使NET大量增加，導致DIC及血栓形成，造成膿毒癥發(fā)病率及死亡率上升。慢性肺系疾病中，大量NETs和中性粒細胞浸潤會阻斷氣道，引起肺功能降低；還會引起肺纖維化、加重炎癥反應、延遲傷口愈合等。

4.3 自噬自噬是細胞通過形成自噬體對胞質(zhì)蛋白和細胞器進行降解的過程，對穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境具有十分重要的作用。自噬在細胞正常狀態(tài)下就存在；在細胞營養(yǎng)匱乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、氧化應激、低氧和特定化學物質(zhì)的暴露下被大量激活，以維持細胞生存。自噬由自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，Atg）調(diào)控，不同的Atg蛋白介導自噬體的起始、核化、延伸、成熟、融合、降解等過程［40］。自噬體成熟后，與溶酶體融合，溶酶體中的水解酶分解內(nèi)膜及內(nèi)容物使之變成小分子物質(zhì)，讓細胞再利用。中性粒細胞形成自噬體，一方面與溶酶體結(jié)合可以清除胞內(nèi)壞死物質(zhì)，維持中性粒細胞生存；另一方面，自噬體降解部分凋亡抑制產(chǎn)物，凋亡蛋白被激活，加速細胞凋亡，雙向調(diào)節(jié)中性粒細胞壽命。自噬體脫落進入再循環(huán)，可以遞呈抗原、調(diào)節(jié)適應性免疫。在中性粒細胞中，自噬可以促進細胞脫顆粒、殺菌和形成NET，還可以影響中性粒細胞的壽命，促進中性粒細胞的分化及成熟。

研究發(fā)現(xiàn)，在綠膿桿菌感染時自噬對骨髓中性粒細胞的黏附起促進作用，可以促進其殺菌功能。膿毒癥存活患者體內(nèi)中性粒細胞自噬增強，NET形成增加；死亡患者體內(nèi)自噬失調(diào)、NET形成不足［39］。中性粒細胞的自噬機制可以維持其固有免疫效應功能，促進NET形成，控制感染，提高膿毒癥患者存活率；NET還參與了血栓性組織因子（thrombogenic tissue factor，TF）的細胞外遞送，激活了凝血級聯(lián)反應，導致血栓形成［4］。自噬與膿毒癥息息相關(guān)，通過藥物增強中性粒細胞的自噬可以作為治療膿毒癥的新手段。

4.4 炎癥小體形成和焦亡炎癥小體主要是由模式識別受體、接頭蛋白ASC和半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）前體結(jié)合形成的多蛋白復合物，可以參與Caspase-1依賴的細胞焦亡。焦亡是一種Caspase-1或Caspase-4/5/11依賴的伴隨炎癥的細胞程序性死亡方式，可以通過Caspace-1依賴和非依賴途徑被激活，焦亡細胞膨大變形，胞膜破裂，并釋放大量炎癥因子。炎癥小體激活的Caspace-1可剪切IL-1β和IL-18前體，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，引起炎癥反應；還可酶解GSDMD，促其形成具有N-結(jié)構(gòu)域的肽段，并在胞膜上形成孔隙，誘導細胞破裂發(fā)生焦亡；大量炎癥因子在胞膜破裂時釋放出胞外，通過正反饋機制放大炎癥反應。

中性粒細胞可以通過誘導炎癥小體啟動焦亡，而發(fā)揮其生物學功能。在此過程中，分泌大量IL-1β和IL-18，細胞脹大溶解，向胞外釋放大量的免疫調(diào)節(jié)因子、趨化因子、髓過氧化物酶、CG等多種顆粒酶，促進NET形成，從而擴大炎癥反應、殺滅病原體、控制感染，產(chǎn)生廣泛的調(diào)節(jié)作用。發(fā)生焦亡的中性粒細胞胞膜溶解后，細胞器和細胞骨架并未簡單散開，而是在細胞尸體內(nèi)仍保持聯(lián)系，形成一種陷阱樣的結(jié)構(gòu)，并將仍然存活的病原體困在其中，這種結(jié)構(gòu)被稱為孔誘導的胞內(nèi)陷阱（pore induced intracellular trap，PIT），隨后，其中的病原體會被ROS殺死或者被吞噬細胞二次吞噬后消滅，有利于胞內(nèi)病原體的清除［41］。

膿毒癥時，炎癥小體的過度激活以Caspase-1依賴的經(jīng)典焦亡途徑誘導細胞焦亡，使IL-1β和IL-18大量釋放，中性粒細胞大量浸潤在肝腎等非特異性器官炎癥介質(zhì)經(jīng)受損細胞膜釋放，從而放大炎癥反應、加快膿毒癥進程，造成嚴重的組織損傷及器官功能障礙［42］。在LPS或盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）誘導的膿毒癥小鼠模型中，缺乏Caspase-11或GSDMD的小鼠死亡率降低，說明通過拮抗中性粒細胞的焦亡，有助于提高膿毒癥的生存率，可能是由于減輕了中性粒細胞通過焦亡導致的過度的炎癥反應。

5 膿毒癥中，中性粒細胞與其他免疫細胞的關(guān)系

中性粒細胞不僅參與殺死胞外病原體，也可通過與其他細胞間的復雜交互作用參與對胞內(nèi)病原體的清除，還可通過膜分子或分泌細胞因子對DC、淋巴細胞和NK細胞等細胞進行調(diào)節(jié)，這些發(fā)現(xiàn)將顛覆我們以往對中性粒細胞的認識，從僅僅是終末分化的效應細胞到參與整個免疫應答活動的轉(zhuǎn)錄的和功能性活化的調(diào)節(jié)細胞。膿毒癥后期，中性粒細胞通過對淋巴細胞的接觸性與非接觸性抑制作用，導致免疫微環(huán)境中淋巴細胞失衡，并呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，致使膿毒癥復發(fā)或者繼發(fā)感染。

5.1 中性粒細胞的潛在抗原提呈功能研究表明，N2型中性粒細胞具有很強的抗原遞呈能力，可表達MHCⅡ類分子、CD80、CD86等相關(guān)抗原遞呈分子，通過直接接觸CD4+T細胞呈遞抗原［43］。膿毒癥小鼠，中性粒細胞MHCⅡ、CD80、CD86、CD40等分子的表達水平顯著升高。故在膿毒癥中，中性粒細胞可能具有抗原提呈能力，促進T淋巴細胞活化［44］。還有研究還發(fā)現(xiàn)中性粒細胞在真皮組織捕獲病毒抗原后，可歸巢于骨髓，在骨髓內(nèi)激活CD8+T細胞，發(fā)揮抗原提呈功能，但其機制還不清楚［45］。

5.2 中性粒細胞對淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用PD-L1和程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）是具有負向調(diào)節(jié)免疫功能的免疫檢查點蛋白。PD-L1可結(jié)合PD-1，抑制了T細胞增殖和細胞因子分泌；還可與CD80結(jié)合，競爭性抑制CD80與配體結(jié)合，從而抑制T細胞激活通路。膿毒癥時，IFN-γ可誘導中性粒細胞高表達PD-L1，通過PD-L1信號通路，負向調(diào)控淋巴細胞，抑制其增殖、活化及炎癥性細胞因子的釋放，促使淋巴細胞凋亡。PD-L1的水平與膿毒癥病情及預后息息相關(guān)［46-47］。

膿毒癥中，中性粒細胞還可通過分泌精氨酸酶1，分解L-精氨酸，影響T細胞正常細胞周期，使T細胞停留于G0～G1周期，導致T細胞功能障礙。系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)時，CD11cbrightCD11bbrightCD16brightCD62Ldim中性粒細胞亞群也可以通過Mac-1，接觸性抑制T細胞的增殖，抑制IFN-γ分泌，抑制T細胞功能。

炎癥疾病中，輔助型T細胞（Th）分化為促炎Th1細胞與抗炎Th2細胞，兩者的平衡在維持免疫穩(wěn)態(tài)中有重要作用。中性粒細胞分泌IL-12與IL-4分別誘導初始性CD4+T細胞分化為Th1、Th2亞型。膿毒癥時，Th2來源的IL-4數(shù)量增多，Th1與Th2失衡，呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)［48］。

5.3 對其他免疫細胞的調(diào)節(jié)中性粒細胞可與DC直接結(jié)合，促進DC成熟，增強其抗原提呈能力；還可調(diào)節(jié)NK細胞的成熟，可通過分泌IL-8調(diào)節(jié)NK細胞表達IFN-γ。中性粒細胞-巨噬細胞相互作用對于炎癥的啟動和消退都很重要。中性粒細胞的一級顆?？纱龠M吞噬細胞的吞噬作用和細胞因子分泌能力，增強其抗微生物效力。在嚴重的炎癥狀態(tài)下，中性粒細胞可誘導內(nèi)皮細胞和上皮細胞信號改變，導致細胞間隙產(chǎn)生，利于血漿蛋白通過上皮屏障，形成水腫。中性粒細胞含有的中性粒細胞來源的肝素結(jié)合蛋白（neutrophil-derived heparin-binding protein，HBP）的釋放可引起內(nèi)皮細胞屏障的顯著改變。在體內(nèi)外失活HBP可阻止中性粒細胞從內(nèi)皮細胞的高滲出。在肺水腫和重癥膿毒癥和休克患者中，血清內(nèi)HBP水平已經(jīng)被用來作為預測臨床預后的指標［49］。

6 以中性粒細胞為治療靶點的研究和臨床應用現(xiàn)狀

在膿毒癥中，中性粒細胞參與抗感染、炎癥誘導和免疫調(diào)節(jié)，其水平和功能狀態(tài)與疾病發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)。使之成為臨床治療的潛在靶點和判斷病程和預后的潛在指征。

6.1 膿毒癥的免疫治療現(xiàn)狀膿毒癥早期表現(xiàn)為免疫紊亂和系統(tǒng)性炎癥反應，晚期則表現(xiàn)為免疫抑制。對于膿毒癥不同階段應采取不同的免疫治療策略，故在早期的抗炎治療和晚期的免疫增強療法，可能更有利于膿毒癥臨床癥狀改善和預后。在膿毒癥發(fā)生的最早的幾個小時應用抗炎治療可以有效減少重癥膿毒癥患者的死亡風險。在72 h后，如果存在免疫抑制，則需要聯(lián)合使用免疫激活劑治療。免疫激活治療可以降低膿毒癥后期再次感染的風險，提高存活率。目前已經(jīng)開展了針對眾多免疫佐劑的治療效果的研究和評價，IFN-γ、GM-CSF、IL-7和抗PD-1/PD-L1抗體這四種免疫激活劑研究最為深入。

國際專家認為因為膿毒癥患者存在異質(zhì)性，這些異質(zhì)性體現(xiàn)在感染類型、易感性和感染部位的差異，也體現(xiàn)在患者的年齡、并發(fā)癥和遺傳背景、免疫功能狀態(tài)的差異，這些差異都會導致臨床試驗的失敗。錯誤地使用免疫治療策略可導致患者發(fā)生更嚴重的感染，加重病情。故用生物標志物對患者進行分層是免疫治療的先決條件。在多個臨床試驗中，淋巴細胞絕對數(shù)量和單核細胞HLA-DR水平是對患者分層的最常用指標。另外，可溶性PD1和MDSC水平也是潛在的生物標志物。

6.2 以中性粒細胞為靶點的診治和臨床應用現(xiàn)狀

6.2.1 促進中性粒細胞生成和成熟 膿毒癥中不成熟中性粒細胞和MDSC水平上調(diào)，可以導致免疫抑制狀態(tài)?；颊哐褐懈弑壤腉-MDSC與病情惡化和院內(nèi)感染的發(fā)生率和病死率相關(guān)。抑制MDSC介導的免疫抑制狀態(tài)、促進骨髓生成正常化細胞或誘導MDSC分化為成熟的髓細胞，有利于疾病恢復［50］。臨床可使用GM-CSF和TLR激動劑促進中性粒細胞和MDSC成熟，來拮抗其免疫抑制表型。如前所述，GM-CSF可以加速中性粒細胞、單核巨噬細胞的產(chǎn)生，且促進單核細胞表達HLA-DR，恢復TNF表達能力。

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是調(diào)節(jié)中性粒細胞功能成熟、增殖和分化的主要粒細胞生長因子，在急性炎癥中起到調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)釋放的作用，被廣泛應用于中性粒細胞減少的膿毒癥患者［51］。在醫(yī)院獲得性肺炎和社區(qū)獲得性肺炎引發(fā)的膿毒癥患者中，G-CSF可以增加中性粒細胞的數(shù)量和功能；對于接受放療和化療的中性粒細胞數(shù)量減少的患者，使用G-CSF有利于減少膿毒癥發(fā)病風險。盡管在膿毒癥患者中，中性粒細胞水平通常是升高的，研究者推測G-CSF進一步增加中性粒細胞數(shù)量可以促進對病原體的殺傷。

6.2.2 改善中性粒細胞異常遷移膿毒癥時，中性粒細胞的移行異常會加劇病情的發(fā)展，明確這些改變可以有助于尋找新的治療靶點，提高生存率［3］。ICAM-1是血管內(nèi)皮細胞表達的黏附分子，與中性粒細胞表面誘導表達的β2整合素結(jié)合，是介導中性粒細胞滾動黏附的關(guān)鍵分子。膿毒癥中，ICAM-1與β2整合素親和力增強，導致細胞僵化，誘導血管阻塞和組織缺氧損傷，是器官衰竭的重要因素。ICAM-l在非特異性器官內(nèi)皮細胞的過度表達，也可能是導致膿毒癥引起的器官組織損傷和功能紊亂的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1特異性抗體可使中性粒細胞向肺臟、胸腺、脾臟等非炎癥性器官遷移減少，肺臟內(nèi)數(shù)量減少，腹腔內(nèi)數(shù)量顯著增加，明顯減輕肺損傷，促進機體清除細菌的能力增加，膿毒癥的死亡率下降。故調(diào)節(jié)ICAM-1的表達水平也成為臨床治療的潛在靶點［52］。

CXCR2水平下降也是膿毒癥個體中性粒細胞遷移異常的重要機制，也成為臨床研究的重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪甲苷通過上調(diào)中性粒細胞趨化因子CXCR2表達，減少臟器細菌荷載量，增加CLP誘導的膿毒癥小鼠存活率［53］。

膿毒癥時，整合素表達異常可導致中性粒細胞遷移功能異常。人和小鼠的中性粒細胞β1/CD29表達上調(diào)，并介導淋巴細胞在血管周細胞外基質(zhì)中黏附和運動，主要與富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列（arginyl-glycyl-aspartic acid，RGD）結(jié)合。條件性敲除β1后，可降低膿毒癥的病死率。給膿毒癥患者使用環(huán)形RGD類似物治療可以減少中性粒細胞的滲出和遷移，提高生存率；也可以減少肺部中性粒細胞和巨噬細胞的遷移和聚集，從而減輕肺臟的炎癥損傷［54］。

6.2.3 改善中性粒細胞功能NETs是以DNA為骨架與多種殺菌物質(zhì)構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其參與膿毒癥炎癥反應、免疫及凝血，并可預測膿毒癥患者的預后［55］。其與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有研究通過藥物分解游離DNA，可以有效改善膿毒癥的癥狀與預后。

LIU等［56］認為調(diào)節(jié)中性粒細胞焦亡是極具潛力的膿毒癥治療策略。中性粒細胞是膿毒癥中最豐富的免疫細胞，也是IL-1β和IL-18的主要來源，因中性粒細胞具有壽命短和不能增殖的特點，促進中性粒細胞焦亡可以阻斷Caspase-1/11和IL-1β/IL-18導致的連鎖反應。

6.2.4 可用于病情評價的生物標志物外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil and lymphocyte ratio，NLR）是一個方便實用的檢測指標，其代表淋巴細胞與中性粒細胞之間的平衡，可以準確評估膿毒癥患者的病情和預后。在膿毒癥中，細菌與各種毒素誘導的免疫激活會促進成熟和非成熟的淋巴細胞凋亡，導致中性粒細胞數(shù)量的增加和淋巴細胞數(shù)量的減少，NLR則升高［57］。LEE等［58］回顧分析了1 468例菌血癥或膿毒癥患者，根據(jù)血清降鈣原水平判定當NLR＜5時可以排除膿毒癥。ICU患者的初始NLR可以作為評估膿毒性休克患者28 d預后的指標。崔久慶等［59］分析了151例膿毒性休克的患者發(fā)現(xiàn)，當NLR≤17.01時，患者28 d的生存率可達到80%，而當NLR＞17.01時，生存率只有20%。

早期識別膿毒癥及評估膿毒癥患者的病情和預后非常重要。膿毒癥小鼠和患者的中性粒細胞通過PD-L1的表達，以細胞接觸的方式誘導淋巴細胞凋亡，從而促進免疫抑制。中性粒細胞PD-L1水平與受試的膿毒癥患者的疾病嚴重程度呈正相關(guān)，提示中性粒細胞PD-L1可作為膿毒癥患者預后的生物標志物［44］。PD-L1抗體通過阻斷PD-L1/PD-1信號通路，可以恢復中性粒細胞導致的淋巴細胞免疫抑制。

7 總結(jié)與展望

中性粒細胞是人類外周血中含量最高的白細胞，是感染時率先被募集至炎癥部位的固有免疫效應細胞，也是急性炎癥過程中導致組織損傷的重要效應細胞，參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。具有清除病原體、介導炎癥和免疫調(diào)節(jié)等功效。評估膿毒癥如何影響中性粒細胞的功能，可能有助于開發(fā)新的有前景的膿毒癥治療策略。

當機體發(fā)生急性炎癥時，活化的中性粒細胞會釋放細胞因子、ROS、顆粒酶、NETs等殺菌物質(zhì)，也可以誘導產(chǎn)生自噬體，互相協(xié)同發(fā)揮抗感染的作用，從而保護機體免受病原體的損害。在膿毒癥早期，大量中性粒細胞被動員入血，且存在凋亡受阻、半衰期延長，導致中性粒細胞數(shù)量增多。過度活化的中性粒細胞，大量的殺菌物質(zhì)產(chǎn)生，多種復雜生理機制協(xié)同，在抗感染的同時也導致免疫紊亂和系統(tǒng)性炎癥反應，并進一步誘發(fā)凝血功能異常和組織損傷。在膿毒癥晚期，中性粒細胞耗竭、中性粒細胞出現(xiàn)的移行和功能異常，使得中性粒細胞遷移受阻，無法到達感染部位控制感染，反而聚集在重要的器官造成嚴重損害。細胞自噬和焦亡功能異常，也可以促進NET形成，促進中性粒細胞膜損傷和大量炎性細胞因子釋放，并進一步擴大炎癥反應。未成熟中性粒細胞的釋放入血以及抑制性功能亞群的誘導產(chǎn)生，不但不能有效清除感染，反而可以抑制淋巴細胞等其他免疫細胞的活化和功能，促進晚期免疫抑制狀態(tài)的形成。這些復雜因素共同作用，導致多器官衰竭，加重膿毒癥，甚至引起死亡。

在膿毒癥治療中，可以通過調(diào)節(jié)中性粒細胞的移行異常和過度的激活狀態(tài)及恢復其功能來促進感染清除、減輕組織損傷程度，從而改善膿毒癥的病情和預后。因此，探究中性粒細胞在膿毒癥時的異常狀態(tài)，可以尋找到膿毒癥診斷治療的新靶點。目前，以中性粒細胞作為臨床診斷和治療靶點的實驗和臨床應用研究已經(jīng)開展，GM-CSF、C-CSF和抗PD-1/PD-L1抗體等治療手段，在治療膿毒癥中都已經(jīng)取得了很好的效果。