牙髓干細(xì)胞來(lái)源胞外囊泡通過(guò)調(diào)節(jié)miR-100-5p抑制γ射線所致小鼠骨髓細(xì)胞FDC-P1凋亡

易靜，陶寧，呂琳，劉超，張愉寧，段晗，王華

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230032；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510630）

不同劑量的電離輻射可導(dǎo)致不同程度損傷［1］造血系統(tǒng)、胃腸道、腎、免疫系統(tǒng)、皮膚和肺等。與胃腸道系統(tǒng)等相比，骨髓造血細(xì)胞對(duì)輻射更為敏感，更易發(fā)生輻射損傷。亞致死劑量的電離輻射可引起骨髓抑制，造成患者血細(xì)胞功能和數(shù)量異常而產(chǎn)生免疫抑制；高劑量的電離輻射將導(dǎo)致骨髓衰竭，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡［2］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）可改善輻射對(duì)骨髓和其他組織的損傷［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自MSC 的條件培養(yǎng)液或胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）在逆轉(zhuǎn)組織損傷方面具有與MSC 類似的作用，如MSC 來(lái)源的EV 可修復(fù)輻射對(duì)骨髓造血細(xì)胞的損傷［4］。EV 是細(xì)胞釋放出來(lái)的球形雙層膜顆粒，能夠選擇性富集其親本細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 和RNA 等物質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)移其內(nèi)容物至特定靶細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能，是新發(fā)現(xiàn)的一種高效的細(xì)胞間信號(hào)交流方式［5］。

牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSC）是一種牙髓組織來(lái)源的MSC，能沿典型的中胚層細(xì)胞譜系分化（如軟骨、脂肪和成骨），可從脫落的智齒和乳牙、多生牙及阻生牙中獲得，對(duì)供體幾乎無(wú)損害［6-7］。與臍帶來(lái)源的MSC 相比，DPSC 在成骨分化、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡和抗衰老方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，DPSC 來(lái)源的EV（DPSC-EV）具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究通過(guò)60Co γ 射線單次照射小鼠骨髓FDC-P1 細(xì)胞，并在照射后給予DPSC-EV 干預(yù)，探討γ 射線照射對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響及DPSC-EV對(duì)造血細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

小鼠骨髓細(xì)胞FDC-P1 和DPSC，購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)基和α-MEM 培養(yǎng)基，美國(guó)Gbico 公司；胎牛血清，美國(guó)Sigma公司；白細(xì)胞介素3（interlukin-3，IL-3），美國(guó)PeproTech公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物公司；RIPA 裂解液，上海碧云天公司；BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Thermo 公司；兔抗小鼠胱天蛋白酶3（含胱天蛋白酶原和活化胱天蛋白酶）多抗和兔抗小鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（含活化PARP）多抗，美國(guó)CST 公司；兔抗人CD9 和CD73多抗（一抗），美國(guó)Abcam 公司；兔抗人β肌動(dòng)蛋白（β-actin）多抗（一抗），美國(guó)Proteintech 公司；兔抗人β 微管蛋白（β-tubulin）多抗（一抗），武漢賽維爾公司；RNA 快速提取試劑盒，上海奕杉生物科技公司；微RNA（microRNA，miRNA）第一鏈cDNA合成（加尾法）和miRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time-quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）試劑盒（染料法）、小鼠miR-100-5p（mmumiR-100-5p）引物（上游：5'-CCCTAACCCGTAGATCCGAA-3'；下游：5'-GAGGAGGAAGAAGAGGAGGA-3'）、mmu-miR-100-5p 抑制劑（RNA oligo干粉）（5'-3'序列：（mC）（mA）（mC）（mA）（mA）（mG）（mU）（mU）（mC）（mG）（mG）（mA）（mU）（mC）（mU）（mA）（mC）（mG）（mG）（mG）（mU）（mU））和抑制劑對(duì)照（RNA oligo 干粉）（5'-3'序列：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA）、mmu -miR-100-5p 模擬物（RNA oligo 干粉）（正義鏈：5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'；反義鏈：5'-CAAGUUCGGAUCUACGGGUUUU-3'）和模擬物對(duì)照（RNA oligo 干粉）（正義鏈：5'- UUGUACUACACAAAAGUACUG -3'；反義鏈：5'- GUACUUUUGUGUAGUACAAUU -3'）和RNA 轉(zhuǎn)染試劑，上海生工生物工程公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 單抗（二抗），北京中杉金橋公司；ECL 發(fā)光液，北京莊盟公司。Varioskan Flash 光譜掃描多功能酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；PowerPac164-5050 電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Tanon5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀，上海天能公司；BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 公司；7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，美國(guó)ABI公司；超速離心機(jī)（XPN-80），美國(guó)Beckman公司；納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）儀，德國(guó)Particle Metrix公司。

1.2 細(xì)胞傳代和培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，并添加IL-3（終濃度0.5 μg·L-1）作為FDC-P1 細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，每2 d 傳代1 次。以含有10%胎牛血清α-MEM 為DPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)傳代。細(xì)胞置37℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 DPSC-EV提取

復(fù)蘇第3 代（P3 代）的DPSC，擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞密度至60%～70%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后收集細(xì)胞上清。將上清于300×g，4℃離心10 min，棄沉淀；上清再經(jīng)2000×g，4℃離心20 min，棄沉淀后將上清10 000×g，4℃再次離心30 min。之后將上清進(jìn)行超速離心，4℃，100 000×g，70 min。離心結(jié)束后，棄管中液體，用2～3 mL 冷的PBS 反復(fù)吹洗沖刷管壁管底，吸取液體移至新的超速離心管中，進(jìn)行第2次超速離心，4℃，100 000×g，70 min。離心結(jié)束后棄上清，用200 μL 冷的PBS反復(fù)吹洗沖刷管壁管底，充分重懸后將提取的EV分裝至小EP管中，即DPSC-EV，于-80℃保存。

1.4 DPSC-EV鑒定

1.4.1 Western印跡法檢測(cè)DPSC-EV表面CD9和CD73表達(dá)

用Western 印跡法檢測(cè)DPSC-EV 中EV 標(biāo)志CD9 和親本細(xì)胞標(biāo)志CD73 表達(dá)，β 微管蛋白作為內(nèi)參蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，在樣本中加入5×上樣緩沖液（4∶1）后混勻，于100℃金屬浴加熱10 min。將蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待蛋白條帶分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入快速封閉液封閉30 min。之后剪切條帶加入相應(yīng)一抗（抗CD9 抗體，1∶1000 稀釋；抗CD73 抗體，1∶1000 稀釋；抗β 微管蛋白抗體，1∶1000 稀釋），4℃搖床上孵育過(guò)夜。TBST 洗膜4 次，每次5 min。加入二抗（1∶5000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜4 次，每次5 min。在膜表面滴加發(fā)光液，曝光顯影，據(jù)蛋白條帶顯色對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行定性分析。

1.4.2 NTA法分析DPSC-EV粒徑

取凍存于-80℃的DPSC-EV，室溫融化后，置4℃保存，用PBS 進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋，使用NTA 儀初測(cè)顆粒密度；隨后調(diào)節(jié)顆粒密度至（5～10）×1010L-1，再次檢測(cè)DPSC-EV顆粒數(shù)目和粒徑大小分布。

1.5 miR-100-5p抑制劑和模擬物轉(zhuǎn)染FDC-P1細(xì)胞

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的FDC-P1細(xì)胞按合適的密度接種，使其24 h 內(nèi)生長(zhǎng)密度達(dá)到60%～80%。分別將mmu-miR-100-5p 抑制劑和抑制劑對(duì)照及mmumiR-100-5p 模擬物和模擬物對(duì)照RNA oligo 干粉用DEPC 水溶解后，配制為RNA oligo 20 μmol·L-1的母液。在無(wú)血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中分別加入RNA 轉(zhuǎn)染試劑和上述RNA oligo 母液，使RNA oligo 終濃度為10 nmol·L-1。兩管混勻后，室溫放置5～10 min，以形成miRNA/RNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，之后將復(fù)合物加入細(xì)胞中，在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育培養(yǎng)24 h。

1.6 FDC-P1細(xì)胞分組和處理

1.6.1 觀察輻射對(duì)細(xì)胞的損傷作用

設(shè)正常對(duì)照、2 和6 Gy 照射組，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的FDC-P1 細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，使用60Co γ 射線2 和6 Gy 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，之后立即更換新鮮的完全培養(yǎng)基。照射后24 和48 h 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和凋亡標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平。

1.6.2 觀察DPSC-EV對(duì)輻射損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

設(shè)正常對(duì)照、2和6 Gy照射組及2和6 Gy+DPSCEV 干預(yù)組，DPSC-EV 干預(yù)組照射后立即加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，隨后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、凋亡標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平和miR-100-5p 表達(dá)水平。

1.6.3 觀察miR-100-5p 在DPSC-EV 保護(hù)輻射損傷細(xì)胞中的作用

設(shè)miR-100-5p 抑制劑組和抑制劑對(duì)照組。在FDC-P1 細(xì)胞照射前24 h，轉(zhuǎn)染miR-100-5p抑制劑以敲低miR-100-5p，轉(zhuǎn)染抑制劑對(duì)照作為陰性對(duì)照。2組細(xì)胞經(jīng)2 Gy照射后，加入DPSC-EV 5×1011L-1孵育24 h，檢測(cè)細(xì)胞miR-100-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率。

1.6.4 觀察miR-100-5p對(duì)細(xì)胞輻射損傷的干預(yù)作用

設(shè)miR-100-5p 模擬物組和模擬物對(duì)照組。在FDC-P1 細(xì)胞照射前24 h，轉(zhuǎn)染miR-100-5p 模擬物以過(guò)表達(dá)miR-100-5p，轉(zhuǎn)染模擬物對(duì)照作為陰性對(duì)照。2 組細(xì)胞經(jīng)2 Gy 照射后更換新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后檢測(cè)細(xì)胞miR-100-5p 表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FDC-P1細(xì)胞凋亡率

收集1.6.1～1.6.4 處理的細(xì)胞懸液于流式管中，400×g離心5 min；PBS 洗2 次，300×g離心5 min；每管加入結(jié)合緩沖液500 μL，F(xiàn)ITC-Annexin-Ⅴ5 μL 和PI 5 μL，室溫避光孵育15 min；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western印跡法檢測(cè)FDC-P1細(xì)胞胱天蛋白酶3和PARP及其活化蛋白表達(dá)

收集1.6.1 和1.6.2 處理的細(xì)胞，加入RIPA 裂解細(xì)胞，在冰上置30 min 后12 000×g，4℃離心15 min，吸取上清。用Western 印跡法檢測(cè)FDCP1 細(xì)胞胱天蛋白酶3 和PARP 及其活化蛋白表達(dá)。以β 肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參對(duì)照。顯影曝光后使用Image J 軟件定量分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，用IA待測(cè)活化蛋白/IA待測(cè)蛋白比值表示待測(cè)蛋白相對(duì)活化水平。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)FDC-P1細(xì)胞miR-100-5p表達(dá)

收集1.6.2～1.6.4 處理的細(xì)胞懸液，離心后加入500 μL 裂解緩沖液，用力吹吸數(shù)次使細(xì)胞充分裂解；再加入500 μL無(wú)水乙醇充分混勻，將液體加入離心柱，12 000×g離心1 min；加入500 μL洗液洗滌。之后向RNA 柱膜中心部位加入25 μL 洗脫液以洗脫RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。配制20 μL cDNA 合成反應(yīng)體系：miRNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液10 μL，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物2 μL，總RNA 2 μg，無(wú)RNA 酶水補(bǔ)至20 μL，反應(yīng)混合物于37℃溫浴60 min，然后85℃加熱5 min 使酶失活，4℃保存。將獲得的cDNA 反應(yīng)液稀釋50 倍后作為模板。配制20 μL miRNA RT-PCR 反應(yīng)體系：miRNA RT-PCR 反應(yīng)混合液10 μL，上游引物和下游引物0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL，ROX 染料1 μL，無(wú)RNA 酶水補(bǔ)至20 μL，在ABI Prism7500 Fast 儀器上設(shè)置反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃30 s，變性95℃5 s；退火、延伸各60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，據(jù)儀器設(shè)置熔解曲線程序。miR-100-5p表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 γ射線照射導(dǎo)致FDC-P1細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，2 和6 Gy 照射組在照射后24 和48 h，細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.01），且6 Gy照射組均顯著高于2 Gy 照射組（P＜0.01），表明FDC-P1 細(xì)胞對(duì)γ射線敏感，γ射線照射可導(dǎo)致FDC-P1細(xì)胞凋亡。

2.2 γ射線照射上調(diào)FDC-P1 細(xì)胞胱天蛋白酶3 和PARP蛋白活化水平

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，照射后24 h，2 和6 Gy 照射組FDC-P1 細(xì)胞胱天蛋白酶3和PARP 蛋白活化水平與細(xì)胞對(duì)照組相比均顯著升高（P＜0.01），且6 Gy 照射組明顯高于2 Gy 照射組（P＜0.05，P＜0.01）；照射后48 h，與細(xì)胞對(duì)照組相比，2 Gy 照射組PARP 蛋白活化水平顯著升高（P＜0.01），6 Gy 照射組胱天蛋白酶3 和PARP 蛋白活化水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且PARP蛋白活化水平高于2 Gy照射組（P＜0.05）。

2.3 DPSC-EV抑制γ射線導(dǎo)致的FDC-P1細(xì)胞凋亡

Western印跡法和NTA結(jié)果（圖3）顯示，提取的DPSC-EV表達(dá)EV特異分子CD9和DPSC表面標(biāo)志CD73，其粒徑大小均值為156.7 nm。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，經(jīng)γ 射線照射后24 h，2和6 Gy照射組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV干預(yù)后，與相同劑量照射組相比，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。由此表明，DPSC-EV對(duì)γ射線所致FDC-P1細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

2.4 DPSC-EV 抑制γ 射線照射FDC-P1 細(xì)胞胱天蛋白酶3和PARP蛋白活化水平

圖5A 顯示，與正常對(duì)照組相比，2 和6 Gy 照射組FDC-P1 細(xì)胞胱天蛋白酶3 活化水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；加入DPSC-EV 后，與相同劑量照射組比較，胱天蛋白酶3 活化水平未明顯變化。圖5B 顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，2 和6 Gy 照射組PARP 蛋白活化水平顯著升高（P＜0.01）；加入DPSC-EV 可顯著降低PARP 蛋白活化水平（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 DPSC-EV 增強(qiáng)γ 射線照射FDC-P1 細(xì)胞miR-100-5p表達(dá)水平

圖6 顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，經(jīng)γ 射線2 Gy照射后24 h，F(xiàn)DC-P1細(xì)胞miR-100-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；加入DPSC-EV 干預(yù)后，細(xì)胞miR-100-5p表達(dá)水平，明顯高于2 Gy照射組（P＜0.01）。

2.6 miR-100-5p抑制劑減弱DPSC-EV對(duì)FDC-P1細(xì)胞凋亡的抑制作用

圖7顯示，F(xiàn)DC-P1細(xì)胞經(jīng)2 Gy γ射線照射后24 h，與抑制劑對(duì)照組相比，mmu-miR-100-5p抑制劑處理組FDC-P1 細(xì)胞miR-100-5p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），且細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），提示敲低miR-100-5p 表達(dá)可減弱DPSC-EV 對(duì)FDC-P1細(xì)胞凋亡的抑制作用。

2.7 miR-100-5p模擬物抑制γ射線照射所致FDC-P1細(xì)胞凋亡

RT-qPCR 結(jié)果（圖8A）顯示，經(jīng)2 Gy γ 射線照射后24 h，mmu-miR-100-5p模擬物處理組FDC-P1細(xì)胞miR-100-5p 表達(dá)水平明顯高于模擬物對(duì)照組（P＜0.01）。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果（圖8B）表明，與模擬物對(duì)照組相比，mmu-miR-100-5p 模擬物處理組FDC-P1 細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。提示上調(diào)miR-100-5p表達(dá)可降低γ射線誘導(dǎo)的FDC-P1細(xì)胞凋亡。

3 討論

越來(lái)越多的研究認(rèn)為，MSC 對(duì)輻射損傷的干預(yù)作用可能并不主要依賴于細(xì)胞在損傷部位的定植和分化，如靜脈注射MSC 后，損傷區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到的MSC 數(shù)量很少，但組織造血功能顯著恢復(fù)［8-9］。據(jù)報(bào)道，MSC對(duì)輻射等損傷的修復(fù)作用主要依賴于其旁分泌功能，即通過(guò)分泌EV 并釋放多種細(xì)胞因子作用于局部微環(huán)境［4］。

人體幾乎所有類型的細(xì)胞均能分泌EV。根據(jù)其來(lái)源、釋放途徑和顆粒大小，EV 可分為不同的亞型。MSC分泌的EV主要包括外泌體和微囊泡。多囊體與細(xì)胞膜融合，釋放其內(nèi)容小泡至細(xì)胞外所形成的直徑30～150 nm 的囊泡為外泌體［10］；細(xì)胞直接出芽、脫落形成的直徑150～1000 nm的囊泡稱為微囊泡［11］。它們可通過(guò)內(nèi)吞作用或直接與細(xì)胞膜融合，或通過(guò)受體配體相互作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，將生物信息傳遞給靶細(xì)胞，發(fā)揮生物功能，調(diào)節(jié)異常微環(huán)境［12］。MSC 分泌的EV 已被提出作為干細(xì)胞治療的替代方案，用于一些受損器官再生［13］。DPSC是一種理想的干細(xì)胞來(lái)源，其提取過(guò)程簡(jiǎn)便且易于量產(chǎn)，不涉及倫理問(wèn)題，還可用于基因工程［14］。DPSC-EV 具有低免疫原性特點(diǎn)和促組織再生等功能，已在多種疾病和損傷修復(fù)中廣泛應(yīng)用［15］。

本研究收集DPSC 細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用超速離心法分離提取DPSC-EV。Western 印跡法及粒徑分析的鑒定結(jié)果顯示，提取的DPSC-EV 表達(dá)EV 特異性CD9 和DPSC 特異性表面標(biāo)志CD73，其顆粒直徑均值為156.7 nm。本研究結(jié)果表明，DPSCEV 可有效抑制γ 射線照射所導(dǎo)致的小鼠骨髓細(xì)胞FDC-P1發(fā)生凋亡，且抑制PARP 的激活，具有良好的抗凋亡作用。但本研究未區(qū)分外泌體和微囊泡的作用。

EV 可在細(xì)胞間傳遞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，從而影響受體和親本細(xì)胞的各種生理和病理功能［16］，它可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA 對(duì)受體細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用［17］。miRNA是重要的表觀遺傳調(diào)控因子，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化、遷移和代謝均有影響［18］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，DPSC-EV 在體外對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用；還發(fā)現(xiàn)EV 中的miRNA 可能在減輕輻射損傷中發(fā)揮重要作用［15］。miR-100-5p 是miRNA 家族的重要成員，與多種疾病和病理過(guò)程相關(guān)聯(lián)［19-20］。例如，轉(zhuǎn)染miR-100-5p 模擬物可增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制腎癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其遷移和侵襲［21］；MSC-EV 中的miR-100-5p 可抑制環(huán)狀菌株誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡［22］。本研究結(jié)果表明，輻射后的FDC-P1 細(xì)胞miR-100-5p 表達(dá)水平顯著降低，給予DPSC-EV 處理后其表達(dá)水平又明顯恢復(fù)，同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡率降低；用miR-100-5p 抑制劑處理FDC-P1 細(xì)胞會(huì)減弱DPSC-EV 對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。另外還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-100-5p 模擬物對(duì)γ 射線導(dǎo)致的FDC-P1細(xì)胞凋亡也同樣具有改善作用。上述結(jié)果提示，DPSC-EV 可通過(guò)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞miRNA 的表達(dá)發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，DPSC-EV 可通過(guò)調(diào)控照射后FDC-P1細(xì)胞miR-100-5p表達(dá)水平、抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)輻射細(xì)胞的保護(hù)作用。該研究結(jié)果將為抗輻射損傷提供潛在靶點(diǎn)。

本研究還存在許多不足和局限性。例如，本研究以小鼠骨髓細(xì)胞系作為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需在人造血細(xì)胞系、原代細(xì)胞以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；FDC-P1 細(xì)胞miR-100-5p 水平的改變?nèi)绾斡绊懠?xì)胞凋亡及其下游靶蛋白和信號(hào)分子仍待闡明。另外，在照射后的FDC-P1 細(xì)胞中，除miR-100-5p外，本研究還檢測(cè)到了其他表達(dá)水平顯著改變的miRNA，如miR-23a-5p，miR-92a-2-5p 等（待發(fā)表），這些相關(guān)的miRNA 可能在細(xì)胞的輻射損傷中發(fā)揮了其他重要作用，如影響細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等，提示DPSC-EV 對(duì)靶細(xì)胞的調(diào)控信號(hào)復(fù)雜多樣，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)一步闡明DPSC-EV 在輻射損傷及修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。