基于藥物相互作用研究麥冬皂苷D對(duì)麥冬皂苷D′急性和亞急性毒性的影響

徐煥華，江珍紅，姚泓，湯響林，王寧寧，孫宇婷，馬增春，高月1，

（江西中醫(yī)藥大學(xué) 1.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330004；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；4.江西省分子中心醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330006）

本研究集體前期在對(duì)麥冬中的活性成分麥冬皂苷D（ophiopogonin D，OPD）與OPD'進(jìn)行比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，互為同分異構(gòu)體的2 個(gè)分子在藥理活性方面存在明顯差異［1］。檢索目前與OPD 和OPD'相關(guān)的文獻(xiàn)，其中OPD 占87.7%，且藥理研究均表明OPD 具有心血管保護(hù)作用［2-6］。與此相反，其同分異構(gòu)體OPD' 2 μmol·L-1即對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率僅為41%［7］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明其具有顯著的心臟毒性。因此，應(yīng)當(dāng)重視OPD'存在的臨床風(fēng)險(xiǎn)。

本研究集體已研究表明，OPD'在體內(nèi)和體外均具有明顯的溶血作用，而OPD 僅在體內(nèi)發(fā)生溶血，且兩者在體外溶血方面存在藥物相互作用［8］。近來(lái)研究報(bào)道，OPD'具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，或許可應(yīng)用于治療某些癌癥［9-10］。但以實(shí)際情況看，OPD'抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用有可能是其細(xì)胞毒性，其成藥性值得商榷。為此，本研究基于藥物相互作用觀察OPD 對(duì)OPD'急性毒性和亞急性毒性的影響，為后續(xù)OPD'的藥理研究提供參考，也為臨床使用參脈注射液提供合理建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

SPF 級(jí)昆明小鼠150 只，雌雄各半，體重18～22 g；SPF級(jí)SD大鼠25只，雄性，體重180～220 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2018-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物保障中心，環(huán)境許可證號(hào)為SCXK-（軍）2002-003。室溫控制在18～28℃，濕度40%～80%，12 h循環(huán)照明-黑暗。動(dòng)物由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)并自由飲食飲水。倫理審查批號(hào)：IACUCDWZX-2020-684。

OPD 和OPD'（批號(hào)：F059758 和F581298），上海一飛生物科技有限公司；40%甲醛溶液（批號(hào)：1603062），西隴化工股份有限公司；甲醇，美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司。BS110S型十萬(wàn)分之一天平，德國(guó)Sartorius 公司；XH-89 型旋渦振蕩器，浙江樂(lè)成電器廠；ES-502HA型百分之一天平，中國(guó)湘平公司；DM3000型LEICA顯微成像系統(tǒng)，德國(guó)萊卡公司；XT-2000i型血細(xì)胞分析儀，日本Sysmex公司；Cobas c 311型生化分析儀，瑞士Roche公司。

1.2 急性毒性試驗(yàn)

將昆明小鼠隨機(jī)分為OPD'單用、OPD+OPD'（OPD 和OPD'提前混合）和OPD→OPD'（先注射OPD 間隔15 min 再注射OPD'）組。OPD'單用組OPD'5 個(gè)劑量分別為3.127，6.460，9.979，10.245和13.098 mg·kg-1；OPD+OPD'組OPD 和OPD'1∶1 混合，5 個(gè)劑量分別為5.711，6.129，7.626，8.712 和10.262 mg·kg-1；OPD→OPD'組OPD 固定為1.0 mg·kg-1，OPD' 5 個(gè)劑量分別為11.351，15.551，22.732，26.568 和30.137 mg·kg-1；共15組，每組10只，單次尾靜脈注射5 mL·kg-1。給藥后即刻觀察小鼠行為表征，并記錄死亡數(shù)。14 d 后計(jì)算LD50。對(duì)死亡小鼠剖檢，記錄大體觀察結(jié)果，部分有明顯病變的組織進(jìn)行組織病理分析。

1.3 亞急性毒性試驗(yàn)

據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，亞急性毒性試驗(yàn)主要考察OPD'和OPD 藥物之間的相互作用，因此未設(shè)梯度劑量。據(jù)急性毒性試驗(yàn)OPD'的LD50值及體外溶血試驗(yàn)測(cè)得的臨床允許溶血的限度值（5%）［8］，OPD'和OPD 均設(shè)為0.25 mg·kg-1。將SD 大鼠分為正常對(duì)照、OPD、OPD'、OPD+OPD'和OPD→OPD'組，每組5只。尾靜脈注射給藥（1 mL·kg-1），每天1 次，持續(xù)給藥30 d。每天觀察并記錄大鼠行為表征，間隔7 d 稱量1 次體重。末次給藥前12 h，禁食不禁水。待末次給藥結(jié)束后，記錄體重，二氧化碳麻醉處死，取材，記錄各臟器重量，并計(jì)算臟器指數(shù)（臟器重量/體重×100）。將心、肝、脾、肺和腎等組織置4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE 染色，觀察組織病理變化。收集血液，EDTA抗凝，制備血漿，分析血漿成分。另取部分血液，離心制備血清，測(cè)定血清生化指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

急性毒性試驗(yàn)采用Bliss 法計(jì)算不同給藥組小鼠的LD50，將各組得到的數(shù)據(jù)錄入GraphPad Prism 6軟件，經(jīng)計(jì)算得到LD50和95%可信限區(qū)間。小鼠體重以±s表示，采用SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件先進(jìn)行組間單因素方差分析，方差齊則采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPD′急性毒性

注射OPD'后，OPD'各劑量組小鼠死亡時(shí)間區(qū)間在4 min～1 h，多數(shù)小鼠在給藥后約15 min 死亡，但6.460 和9.979 mg·kg-1組在給藥后第7 天各只有1 只死亡。給藥14 d 時(shí)小鼠死亡數(shù)見表1。小鼠注射給藥后立即出現(xiàn)呼吸急促、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、痙攣、四肢和全身顫抖和震顫、心動(dòng)過(guò)速、心率增加和尿失禁等，推測(cè)小鼠死亡原因可能與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。死亡小鼠大體解剖均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理改變（圖略）。據(jù)各劑量組小鼠死亡數(shù)，計(jì)算得OPD'單用時(shí)LD50值為7.785 mg·kg-1，95%可信限為6.814～8.893 mg·kg-1。

OPD+OPD'各劑量組給藥后小鼠行為反應(yīng)和死亡時(shí)間分布與OPD'單用組相似，其中6.192 和8.172 mg·kg-1組在給藥后第4天分別有1只小鼠死亡。給藥14 d 時(shí)小鼠死亡數(shù)見表1。為便于比較，最終劑量以O(shè)PD'計(jì)，根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)，計(jì)算得LD50值為7.706 mg·kg-1，95%可信限為6.959～8.534 mg·kg-1。

OPD→OPD'各劑量組給藥后小鼠行為反應(yīng)和死亡時(shí)間分布與OPD'和OPD+OPD'組一致，其中26.568 和30.137 mg·kg-1組分別有1 只小鼠在第7 天死亡。給藥14 d 時(shí)小鼠死亡數(shù)見表1。劑量以O(shè)PD'計(jì)，計(jì)算得LD50值為22.820 mg·kg-1，95%可信限為19.86 ～26.22 mg·kg-1。

2.2 OPD′亞急性毒性

2.2.1 對(duì)體重和臟器系數(shù)的影響

由表2 可見，與正常對(duì)照組相比，OPD'，OPD，OPD+OPD'和OPD→OPD'組大鼠體重均下降（P＜0.05，P＜0.01），心、肝和腎指數(shù)無(wú)明顯變化，脾指數(shù)增大（P＜0.05，P＜0.01）；OPD'，OPD+OPD'和OPD→OPD'組肺指數(shù)增大（P＜0.05，P＜0.01）。OPD+OPD'和OPD→OPD'組與OPD 或OPD'組比較，體重和以上臟器指數(shù)均無(wú)顯著性差異。

Tab.1 Acute toxicity of ophiopogonin D′（OPD′）in mice

Tab.2 Effect of OPD and OPD′ on body mass and organ indices of rats in sub-acute toxicity test

2.2.2 對(duì)血常規(guī)指標(biāo)的影響

如表3 所示，OPD 組大鼠白細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），但尚在正常生理范圍；各組淋巴細(xì)胞百分比與正常對(duì)照組比較均降低（P＜0.05）。OPD+OPD'和OPD→OPD'組與OPD或OPD'比較，以上指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。紅細(xì)胞及溶血相關(guān)指標(biāo)另文發(fā)表［11］。

Tab.3 Effect of OPD and OPD′ on hematological parameters of rats in sub-acute toxicity test

2.2.3 對(duì)血生化指標(biāo)的影響

共檢測(cè)血生化指標(biāo)18項(xiàng)，其中白蛋白、間接膽紅素、堿性磷酸酶、總膽汁酸、肌酸肌酶、尿酸、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和血清膽堿酯酶等9項(xiàng)各給藥組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著改變（數(shù)據(jù)略）。如表4 所示，各給藥組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、總膽固醇、總膽紅素、尿素氮和肌酐與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，血清葡萄糖和甘油三酯水平均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。與OPD 或OPD'比較，OPD+OPD'和OPD→OPD'組以上指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。

2.2.4 對(duì)主要臟器組織病理變化的影響

與正常對(duì)照組比較，各給藥組肝和腎組織無(wú)明顯病理改變（圖略），心、肺和脾組織具有明顯病理改變。

2.2.4.1 對(duì)心臟組織病理變化的影響

如圖1所示，各組大鼠心肌中層結(jié)構(gòu)正常，中層纖維排列整齊、橫紋清楚，肌漿豐富，核圓形或卵圓形，染色質(zhì)清晰。各給藥組心內(nèi)膜均出現(xiàn)部分心肌細(xì)胞輕度水腫、核周間隙輕度增寬，灶性或小片狀心肌顆粒變性、肌漿凝聚、均質(zhì)化，間質(zhì)血管淤血。OPD+OPD'組病理改變程度最為明顯，其中1 例出現(xiàn)灶狀心肌細(xì)胞壞死、成纖維細(xì)胞增生和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2.4.2 對(duì)脾組織病理變化的影響

如圖2 所示，各組脾組織結(jié)構(gòu)基本正常，紅、白髓分界較清楚，脾小體及淋巴細(xì)胞等形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；各給藥組紅髓輕度淤血，其中OPD→OPD'組紅髓明顯淤血，較OPD，OPD'和OPD+OPD'組更為明顯。各給藥組均未見明顯出血。

2.2.4.3 對(duì)肺組織病理變化的影響

如圖3 所示，各組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。各給藥組部分肺泡上皮細(xì)胞輕度腫脹，核周間隙增寬，部分細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮深染，肺泡壁血管不同程度淤血，單核細(xì)胞稍增多，導(dǎo)致肺泡隔輕至中度增寬，其中OPD，OPD+OPD'和OPD→OPD'組病理改變較OPD'組較輕。

Tab.4 Effect of OPD and OPD′ on blood biochemical indexes of rats in sub-acute toxicity test

3 討論

因OPD'和OPD 均存在水溶性差的問(wèn)題，特別是OPD'，因此在藥液制備時(shí)加入不同比例的甲醇作為溶劑。急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，控制甲醇含量＜20%不會(huì)引起小鼠死亡。在亞急性毒性試驗(yàn)中，因給藥濃度小且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，藥液制備時(shí)可適當(dāng)添加乙醇促溶，但乙醇含量不得＞15%。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的評(píng)價(jià)要求，該含量在用于毒理學(xué)試驗(yàn)中是一個(gè)可被接受的溶劑劑量。

關(guān)于OPD'和OPD 之間的藥物相互作用，據(jù)本課題組研究結(jié)果，可從3 個(gè)方面互為印證。①本研究急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，與OPD'單用相比，當(dāng)OPD'和OPD 提前混合使用時(shí)LD50量效曲線無(wú)變化，而當(dāng)先注射OPD、間隔15 min 再注射OPD'時(shí)LD50量效曲線明顯右移。在亞急性毒性試驗(yàn)中未見該現(xiàn)象，可能與亞急性毒性的重復(fù)給藥密切相關(guān)。②體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8］與急性毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。與OPD'單用相比，當(dāng)OPD'和OPD 提前混合使用時(shí)，其發(fā)生溶血的劑量更低，程度更高；然而當(dāng)先注射OPD、間隔15 min 再注射OPD'時(shí)，溶血發(fā)生的劑量升高，程度降低，提示OPD 可減輕OPD'的溶血作用。③本課題組王佳等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OPD干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能減輕OPD'所致心肌細(xì)胞損傷。但不同的是，該研究中采取的是共處理模式，并未考察間隔給藥，且結(jié)果也提示兩者之間存在藥物相互作用。

一般來(lái)說(shuō)，藥物相互作用可能與兩者作用在同一個(gè)靶標(biāo)有關(guān)［13-14］。因此，本課題組利用分子模擬技術(shù)，以O(shè)PD'尋靶，再輔以O(shè)PD驗(yàn)證，找到了10個(gè)兩者共同的靶標(biāo)［11］，其中Q9NPD5可能與溶血存在一定的關(guān)聯(lián)性［15-16］。本研究結(jié)果表明，在急性毒性試驗(yàn)中，小鼠死亡集中在給藥后30 min 內(nèi)，大體解剖觀察未見臟器肉眼可見的變化。但在亞急性毒性試驗(yàn)中所呈現(xiàn)出來(lái)的異常結(jié)果，如體重降低、脾指數(shù)和肺指數(shù)增大、心肌細(xì)胞輕度水腫和間質(zhì)血管淤血、脾紅髓淤血、肺泡上皮細(xì)胞輕度腫脹及肺泡壁血管不同程度淤血等均與溶血相關(guān)。基于Q9NPD5 靶標(biāo)的深入研究或許可揭示兩者在溶血方面的相互作用機(jī)制［17-18］。但兩者之間的藥物相互作用應(yīng)不止于此，還有待更深入研究。

關(guān)于亞急性毒性試驗(yàn)劑量的設(shè)置，本課題組任思嘉等［19］在研究OPD'的心臟毒性時(shí)使用的劑量為0.5，1.0 和2.0 mg·kg-1，本研究設(shè)置的劑量為0.25 mg·kg-1。該劑量設(shè)置的依據(jù)主要是急性毒性試驗(yàn)結(jié)果的LD50值；其次是體外溶血試驗(yàn)測(cè)得的臨床允許溶血的限度值（5%），該限度值下，OPD'的濃度為5 mg·L-1［11］。根據(jù)動(dòng)物體重?fù)Q算，本研究亞急性毒性試驗(yàn)設(shè)置OPD'的劑量為0.25 mg·kg-1。

本研究亞急性毒性試驗(yàn)的血生化結(jié)果表明，各給藥組血糖和血脂與正常對(duì)照組比較均顯著降低，提示OPD'和OPD 均具有降低血糖和血脂的作用。OPD 用于代謝綜合征的治療已有報(bào)道［20］，表明OPD 能通過(guò)調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征，但關(guān)于OPD'的類似研究還未見報(bào)道。本課題組首次發(fā)現(xiàn)OPD'具有降低血糖和血脂的藥理活性，為后續(xù)研究OPD'藥理活性提供參考。

筆者前期對(duì)收集到的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)生產(chǎn)的每廠家各3 批次的參脈注射液進(jìn)行溶血作用檢測(cè)，結(jié)果均符合藥典規(guī)定，未發(fā)生溶血。但對(duì)收集樣品中OPD'含量的測(cè)定結(jié)果顯示，不同企業(yè)中OPD'含量差異巨大［21］，個(gè)別企業(yè)OPD'含量按臨床使用最大劑量計(jì)算，已觸及亞急性毒性試驗(yàn)中采用的臨床允許的溶血限度值（5 mg·L-1）。因此，基于本研究結(jié)果，建議明示制劑中OPD'的含量并予以控制，以在保證安全劑量范圍的前提下選擇臨床用藥劑量。