細菌分選酶A抑制劑抗革蘭陽性超級細菌感染的作用及其應(yīng)用前景

王琦，艾常虹，商慶輝

（1.呼倫貝爾市人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)呼倫貝爾醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

多重耐藥菌是指同時對≥3 種抗菌藥物耐藥的細菌，常被稱為超級細菌，其中引起廣泛關(guān)注的有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐多藥肺炎鏈球菌、耐萬古霉素腸球菌、多重耐藥性結(jié)核桿菌、多重耐藥鮑曼不動桿菌以及最新發(fā)現(xiàn)的攜帶有新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶1(New Delhi metallo-beta-lactamase-1，NDM-1）基因的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌等，它們導(dǎo)致的感染性疾病的發(fā)病率和死亡率逐年升高，給人類健康帶來了嚴重威脅［1］。據(jù)估計，當(dāng)前抗菌藥物耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）每年在全球造成約70萬人死亡，到2050年死亡人數(shù)可能增加到每年1000 萬人；另外，到2050 年AMR 感染所消耗的全球醫(yī)療成本累計將達到100 萬億美元［2］。因此，AMR 將成為人類在21 世紀面臨的最大挑戰(zhàn)之一。

目前，抗菌藥物仍是治療細菌感染的主要方法。傳統(tǒng)抗菌藥物一般為小分子，通過與細菌DNA、RNA、蛋白質(zhì)或細胞壁的相互作用發(fā)揮殺菌或抑菌作用［3］。隨著AMR 的加劇，傳統(tǒng)抗菌藥物的療效明顯降低［4］，為此人們采取各種方法來應(yīng)對AMR，包括持續(xù)改進抗菌藥物管理、使用百里酚和沒食子酸等細菌細胞膜通透劑提高抗菌效果、開發(fā)新的抗菌藥物或疫苗及采取抗毒力療法等［5～6］。其中，抗毒力療法是以毒力因子為作用靶點的治療方式。毒力因子是促進宿主內(nèi)感染和細菌繁殖的細菌衍生分子［7］，借助這些毒力因子，細菌可以克服宿主防御系統(tǒng)和抗菌藥物的攻擊，使細菌適應(yīng)和定植于目標(biāo)靶點［8］。針對毒力因子進行靶向治療雖無法消滅病原體，但可削弱或完全阻斷病原體入侵宿主的能力，并且不會對細菌施加選擇壓力，從而可降低細菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險。此外，由于大多數(shù)毒力因子被限制在少數(shù)相關(guān)菌種，所以耐藥的決定因素通過水平基因轉(zhuǎn)移的傳播風(fēng)險是降低的。因此，抗毒力療法可能成為一種更安全的抗感染策略，并可有效克服抗菌藥物治療時存在的耐藥風(fēng)險［5］。

細菌分選酶A（sortase A，SrtA）是一種細菌細胞膜酶，可將表面蛋白附著在細菌的細胞壁上，是革蘭陽性致病菌（如金黃色葡萄球菌）的關(guān)鍵毒力因子，其在細胞膜上的定位也是靶向治療的重要靶點。因此，SrtA 對于抗毒力療法的研究具有重要價值，在應(yīng)對AMR 方面也具有重要意義［9］。本文簡要介紹AMR 的流行病學(xué)及其耐藥機制，著重闡述SrtA 的結(jié)構(gòu)、作用機制及抑制劑的研究進展，以期為革蘭陽性超級細菌感染尋找新的治療方案。

1 抗菌藥物的耐藥性

1.1 流行病學(xué)

多重耐藥的腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌等“超級細菌”導(dǎo)致的感染相關(guān)發(fā)病率和死亡率逐漸升高［10］。在美國，每年至少有280萬株耐藥菌感染發(fā)生，導(dǎo)致3.5萬人死亡［11］；在歐洲，每年約有2.5萬人死于耐藥細菌感染［12］。近年來，全球各地相繼報道了多種耐藥菌，如美國發(fā)現(xiàn)了耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae）［13］，印度和巴基斯坦發(fā)現(xiàn)了blaNDM-1基因介導(dǎo)的耐碳青霉烯大腸埃希菌（carbapenem resistanceE.coli）和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌［14］，中國發(fā)現(xiàn)了含有黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸桿菌［15］。在澳大利亞，常見革蘭陰性菌（如大腸桿菌）的耐藥性不斷增加，養(yǎng)老院和醫(yī)院中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）以及耐萬古霉素屎腸球菌的流行率不斷升高［16］，可見全球范圍內(nèi)的抗菌藥物耐藥形勢都十分嚴峻。

1.2 耐藥機制

研究表明，AMR 的產(chǎn)生主要是源于抗菌藥物對微生物施加的選擇壓力［17］。AMR 大體分為2 類，一類是固有耐藥性，即引起AMR 的基因在細菌中代代相傳，使得細菌對抗菌藥物產(chǎn)生天然耐藥性［18］；另一類是獲得性耐藥性，即細菌由于基因突變或獲得外來耐藥性基因，或兩者兼而有之，從而獲得了抵抗抗菌藥物活性的能力［19］。

如圖1所示，目前研究較充分的AMR 機制主要有4 種，即酶促藥物降解、藥物靶點突變、藥物外排泵的激活和膜通透性的降低［4］。此外，其他因素也可導(dǎo)致AMR。據(jù)統(tǒng)計，80%細菌感染與細菌生物膜（簡稱生物膜）形成相關(guān)，生物膜中的細菌形態(tài)和生理作用均與游離菌不同，對抗菌藥物的耐受性可提高10～1000 倍，且對宿主免疫防御的抗性很強，是造成細菌耐藥性的主要原因［20～21］。當(dāng)細菌暴露于較低濃度抗菌藥物時，一旦形成生物膜就會產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥，進而導(dǎo)致耐藥性的發(fā)展。研究表明，生物膜的形成可受毒力因子、溫度、糖濃度和pH 值等因素的影響，而AMR 與毒力因子之間可能也存在著很強的關(guān)聯(lián)性［22］。毒力因子是細菌產(chǎn)生的一種使細菌能附著在宿主細胞上的分子，常見的包括菌體表面的黏附結(jié)構(gòu)，如菌毛、莢膜及類莢膜，還包括一些具有侵襲能力的水解酶，細菌代謝產(chǎn)生的部分脂多糖和蛋白質(zhì)也屬于毒力因子的范疇。一方面，毒力因子可使病原菌在機體內(nèi)定殖、突破機體的防御屏障、內(nèi)化、繁殖和擴散，這種能力被稱為侵襲力；另一方面，毒力因子也具有一定毒素的性質(zhì)，病原菌之所以能感染宿主并在宿主環(huán)境中繁殖，通常就是依靠一系列毒力因子相互協(xié)調(diào)作用實現(xiàn)的。人在感染有毒細菌并出現(xiàn)疾病癥狀后開始抗菌藥物治療，進而導(dǎo)致AMR 的出現(xiàn)，可見毒力因子和AMR之間存在著直接關(guān)系［22］。

2 細菌分選酶A

近年來，使用抗毒力療法治療細菌感染受到越來越多的關(guān)注。與傳統(tǒng)抗菌藥物限制細菌生長或直接殺死細菌相比，抗毒力療法降低了細菌的毒性，增加了病原體對宿主免疫系統(tǒng)的敏感性，因此，細菌毒力因子可能是研發(fā)新型抗菌藥物的全新方向［23］。在眾多已知的毒力因子中，存在于大多數(shù)革蘭陽性菌中的Srt 受到了特別的關(guān)注。Srt 可分為8類，分別是A，B，C，D1，D2，E，F(xiàn)和“Marine”，每類均有自己的底物識別基序和功能。SrtA 是一類膜結(jié)合的巰基轉(zhuǎn)肽酶，其功能是將包括毒性因子在內(nèi)的表面蛋白連接到細菌細胞壁上，而這些表面蛋白作為多種毒力因子之一，在革蘭陽性菌對宿主的入侵中起著重要作用［24］。SrtA 在革蘭陽性菌的發(fā)病機制中是不可或缺的，但對其生長或生存能力卻并不是必需的。因此，SrtA 是研發(fā)新型抗感染藥物的非常有價值的靶點，這些新型抗感染藥物可抑制生物膜形成等關(guān)鍵的細菌毒力機制，且不會引起耐藥性［25］。此外，SrtA 做為一種細菌細胞膜酶，與細胞內(nèi)靶點相比具有更好的靶向性［26］。

2.1 細菌分選酶A的結(jié)構(gòu)

SrtA 是一種管家蛋白，可將帶有LPXTG 基序的蛋白共價結(jié)合到細菌細胞壁上［27］。金黃色葡萄球菌SrtA N 端第1～59 氨基酸殘基中包含一個將其定位到細胞膜上的信號肽和一個螺旋膜錨。第60～206氨基酸殘基代表核心催化域，該催化域具有8股β 桶狀褶皺結(jié)構(gòu)，即Srt 褶皺，其中由β7 和β8 鏈形成SrtA的活性中心，而His120，Cys184和Arg197是活性中心不可缺少的3 個氨基酸，尤其是位于SrtA 特征基序LXTC上的Cys184具有催化活性［28］。此外，β3 和β4 環(huán)形成鈣結(jié)合位點，鈣離子可與β6/β7 環(huán)中的殘基相互協(xié)作，這種鈣離子的結(jié)合效應(yīng)減緩了SrtA的運動，使得底物與酶結(jié)合，導(dǎo)致酶活性增加8倍［29］。

2.2 細菌分選酶A的作用機制

SrtA 通過微生物表面成分識別黏附基質(zhì)分子（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）中的LPXTG基序發(fā)起黏附過程。在完成識別過程之后，SrtA 接連催化硫酯化反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽化反應(yīng)。SrtA 的催化性半胱氨酸殘基Cys184 首先在蘇氨酸殘基和甘氨酸殘基之間裂解LPXTG 基序，并產(chǎn)生?；蝓ッ钢虚g體。在此過程中，首先需要組氨酸殘基His120的咪唑環(huán)形成硫酸鹽從而激活Cys184；同時，精氨酸殘基Arg197 通過提供穩(wěn)定的四面體氧陰離子過渡態(tài)和激活反應(yīng)所需的能量，可助Cys184 進行裂解反應(yīng)［30-31］。隨后，該硫酯被細菌肽聚糖中五甘氨酸（penta-Gly，Gly5）序列的N端氨解。這種轉(zhuǎn)肽化反應(yīng)導(dǎo)致MSCRAMM 的C 端蘇氨酸和肽聚糖Gly5序列之間形成酰胺連接，該連接將蛋白質(zhì)共價連接到細菌細胞壁上［30-31］（圖2）。SrtA 通過識別、硫酯化和轉(zhuǎn)肽化將MSCRAMM 錨定在細菌肽聚糖上，因此抑制上述步驟中的任何一個，均可導(dǎo)致細菌不能附著在特定的組織和（或）器官上，使細菌無法攻擊宿主細胞，同時無法逃避宿主的免疫反應(yīng)［32］。

3 細菌分選酶A抑制劑

目前，研究人員已篩選出多種類型的SrtA 抑制劑（SrtA inhibitor，SrtAi），包括合成小分子、多肽和其他天然產(chǎn)物等，這些SrtAi對金黃色葡萄球菌以及MRSA 都具有一定的抑制作用，而且不會產(chǎn)生傳統(tǒng)抗菌藥物常見的相關(guān)不良反應(yīng)［33］。

3.1 合成小分子

目前，研究人員通過分子對接與分子動力學(xué)模擬篩選出了小分子藥物數(shù)據(jù)庫，用以識別能結(jié)合SrtA 活性位點的化合物，并對部分化合物的抑制作用進行了生物評價。如研究人員對綠原酸（chlorogenic acid，CHA）及其類似物進行了熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析，以確定CHA對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及對SrtA 活性的半數(shù)最大抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）。結(jié)果顯示，CHA對金黃色葡萄球菌的MIC＞1024 μg·mL-1，對SrtA 活性的IC50為34 μg·mL-1，表明CHA與SrtA活性位點的結(jié)合阻止了SrtA 與MSCRAMM 中LPXTG 基序的結(jié)合，從而使SrtA 失去了生物活性［34］，但對金黃色葡萄球菌無明顯抑菌作用。

研究人員利用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法，對具有SrtA 生物活性抑制作用的合成小分子進行了優(yōu)化，并通過高通量篩選技術(shù)證實吡嗪酮類分子是有效的SrtA 抑制劑。Chan 等［35］合成了一系列高可溶性吡嗪酮基小分子，并推測它們可能與Cys184形成二硫鍵，因而可共價修飾SrtA 的活性半胱氨酸硫醇基團。此外，這些小分子也部分模仿天然SrtA底物，可引起酶活性部位的構(gòu)象變化。其中，化合物2-（3-氟苯）-4-（3-羥丙氧）-5-巰吡啶嗪-3（2H）-酮展現(xiàn)出理想的SrtA 抑制作用，IC50為（21±14）nmol·L-1，具有更低的細胞毒性，且可有效破壞金黃色葡萄球菌表面蛋白。

3.2 多肽

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）為傳統(tǒng)抗菌藥物治療耐藥菌感染帶來了一種替代或補充方案。它們是一種陽離子多肽，可與帶負電荷的分子（如革蘭陽性菌的重要表面抗原脂磷壁酸）發(fā)生靜電作用，從而進入細胞質(zhì)膜與脂質(zhì)雙分子層相互作用形成跨膜孔，進而導(dǎo)致細胞膜的生物作用呈劑量依賴性減弱［36］。AMP 由15～50 個氨基酸組成，可折疊成不同二級結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、環(huán)和擴展螺旋，它們可通過非特異性作用機制抑制細菌，從而導(dǎo)致細菌細胞破壞。由于AMP的作用模式通常不是通過特定的生化途徑實現(xiàn)，因此未觀察到細菌對這類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性［37］。

人類β-防御素是存在于動植物體內(nèi)的一種具有廣譜抗微生物作用的陽離子多肽［38］，它們可與入侵的革蘭陰性和陽性微生物的細胞膜相互作用，一些細菌雖已對它們產(chǎn)生了耐藥性，但這些肽經(jīng)過修改和重新設(shè)計可克服這一問題。如D-IK8（MIC：16 μmol·L-1）和WR12（MIC：4 μmol·L-1）等新型合成短肽對MRSA 表現(xiàn)出顯著抑制活性。WR12（RWWRWWRRWWRR）是一種完全由色氨酸（Trp）和精氨酸（Arg）組成的12 位氨基酸肽，D-IK8（D-IRIKIRIK-NH2）是一種八殘基β-片狀肽，兩者均可通過破壞細菌細胞膜抑制細菌，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物泄漏，從而導(dǎo)致細菌死亡［39］。研究表明，D-IK8 和WR12 可破壞在體外定植的穩(wěn)定生長階段的MRSA。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，將D-IK8和WR12 應(yīng)用于MRSA 皮膚感染的小鼠模型時，兩者均可顯著降低開放傷口內(nèi)MRSA USA300 的計數(shù)，表明D-IK8和WR12在減少MRSA 皮膚損傷的細菌負荷方面非常有效。此外，與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，D-IK8和WR12 在阻斷表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌生物膜方面更加有效［39］。

AMP 克服AMR 的能力使其展現(xiàn)出替代傳統(tǒng)抗菌藥物的潛力。然而，AMP 做為多肽類藥物也存在明顯局限性，其有限的生物利用度和較弱的蛋白水解穩(wěn)定性限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用［40］。為解決這些問題，研究人員以天然AMP為基礎(chǔ)進行了優(yōu)化修飾，以便開發(fā)出模擬AMP 特性的合成類似物，修飾的重點是AMP的膜活性及其物理化學(xué)性質(zhì)，如兩親性活性和正電荷。樹狀多肽是一類新的抗菌藥物，是由附著在中心核上的一個功能肽單元的多個副本組成的支化分子，它們表現(xiàn)出抗菌作用［40］。如樹狀分子RW 4D 通過一種獨特的膜溶解作用選擇性地消除革蘭陰性細菌而非革蘭陽性細菌［41］；類似地，樹狀分子SB056（MIC：3.125 mmol·L-1）對革蘭陰性微生物非常有效。研究表明，這些化合物的抗菌活性與多黏菌素B 和黏菌素相當(dāng)。總之，樹狀多肽與單體肽相比具有更高的活性，這可能是因為樹狀多肽具有多價性，所以對蛋白酶和肽酶的蛋白水解活性敏感度降低［40］。

3.3 天然產(chǎn)物

由于傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥形勢愈發(fā)嚴峻，研究人員轉(zhuǎn)而對天然抗菌劑產(chǎn)生了濃厚的興趣。野生植物中感染性疾病的發(fā)生率極低，表明這些物種成功地形成了防御機制。研究發(fā)現(xiàn)，植物能產(chǎn)生多種小分子（相對分子質(zhì)量＜500）抗菌劑［42］。此外，自20世紀初以來，天然化合物在治療微生物引起的感染方面發(fā)揮了重要作用，其抗菌特性被多方研究報道［43-44］。

Zhang 等［45］發(fā)現(xiàn)來源于唇形科植物Hyptis atrorubensPoit 的粗蕨素是一種強效SrtA 抑制劑，IC50為24.17 μmol·L-1。利用定點誘變技術(shù)得到金黃色葡萄球菌SrtA 的2 種突變形式，即Val166Ala和Val168Ala，并評價了粗蕨素對這2 種突變體的抑制活性。結(jié)果表明，經(jīng)粗蕨素抑制后兩者活性較天然SrtA 明顯降低，較天然SrtA 分別降低了67%和99%?？梢姶洲厥且环N可通過靶向SrtA 抑制金黃色葡萄球菌感染的潛在的新型抗菌藥物。在Cho 等［46］的相關(guān)研究中，對20 種黃酮類化合物的SrtA 抑制性能進行了測試，其中芒柄花素和7-羥-6-甲氧黃酮對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，IC50分別為74.9 和96.1 μmol·L-1。Kim 等［47］的另一項研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖甾醇的一種分離物，β-谷甾醇-3-氧-吡喃葡萄糖苷，具有SrtA 抑制作用，IC50為18.3 μg·mL-1。此外，其對金黃色葡萄球菌也具有一定抗菌活性（MIC：200 μg·mL-1），表明該化合物是一種潛在的SrtAi 候選物。該研究還發(fā)現(xiàn)，谷甾醇對SrtA 活性和金黃色葡萄球菌均無抑制作用，推斷β-谷甾醇-3-氧-吡喃葡萄糖苷的抑制作用取決于吡喃葡萄糖苷側(cè)鏈部分。

植物產(chǎn)生的小分子抗菌劑大多為弱效抗菌劑，然而不同植物產(chǎn)生的抗菌劑之間可能發(fā)生協(xié)同作用，合用時抗菌效力有所增強［42］。小檗堿和5-甲氧大風(fēng)子素的聯(lián)合作用就是一個典型例子。小檗堿是一種DNA嵌入劑，由于其易被病原菌多藥耐藥泵排出，因此作為抗菌藥物是無效的。而藍莓的次級代謝產(chǎn)物5-甲氧大風(fēng)子素是一種多藥耐藥泵的阻斷劑，二者聯(lián)合作用展現(xiàn)出較強的抗菌作用［42］。

很多種情況下天然化合物和抗菌藥物之間同樣存在協(xié)同作用［48］。mecA基因是編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白2a（penicillin binding proteins 2a，PBP2a）的結(jié)構(gòu)基因，由轉(zhuǎn)座子攜帶并整合至葡萄球菌染色體的mec片段。mec片段是葡萄球菌染色體上獲得的外來片段，該片段只存在于耐甲氧西林葡萄球菌中［49-50］。Mun 等［48］通過分析PBP2a 的表達來評估桑色素與β 內(nèi)酰胺抗菌藥物對MRSA 的聯(lián)合作用。結(jié)果顯示，單用桑色素的MIC 值為125～500 μg·mL-1，而桑色素與苯唑西林聯(lián)用的MIC 為0.97～259 μg·mL-1，說明二者之間存在協(xié)同作用。桑色素與苯唑西林聯(lián)用治療MRSA 時，PBP2a 蛋白水平明顯下降，提示該聯(lián)用方案對MRSA 有出色的臨床療效。根據(jù)該研究推測，桑色素聯(lián)合β-內(nèi)酰胺抗菌藥物展現(xiàn)的殺傷特性可能是通過對抗PBP2a介導(dǎo)的耐藥性實現(xiàn)的。Ekambaram等［51］采用瓊脂孔擴散法評價迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）對金黃色葡萄球菌和MRSA的抗菌作用。結(jié)果表明，RA對金黃色葡萄球菌（MIC：0.8 mg·mL-1）和MRSA（MIC：10 mg·mL-1）均有抑制作用；此外，RA 還與阿莫西林、萬古霉素和氧氟沙星對金黃色葡萄球菌有協(xié)同抗菌作用，但對于MRSA 的臨床分離物，RA僅與萬古霉素聯(lián)用時展現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用。RA 與這些抗菌藥物雖有協(xié)同作用，但MIC值仍然較高［51］，臨床應(yīng)用前需進行優(yōu)化以克服該問題。

4 結(jié)語

鑒于超級細菌感染在全球引起的公共衛(wèi)生危機，人們需要進一步明確細菌生存所需的關(guān)鍵因素和感染進展所需的毒力決定因素，從而有針對性地研發(fā)出新型抗菌藥物以應(yīng)對細菌耐藥的嚴峻形勢?，F(xiàn)有研究表明，針對毒力因子的藥物設(shè)計是研發(fā)新型抗菌治療的新路線，SrtA 是一種將表面蛋白共價連接到細菌細胞壁的毒力因子，是治療革蘭陽性菌感染的候選靶點。研究人員迄今已篩選出多種具有抗金黃色葡萄球菌活性的SrtAi，如合成小分子、多肽和天然產(chǎn)物，這為攻克革蘭陽性超級細菌感染帶來了新希望。然而，SrtAi成功應(yīng)用于臨床還面臨一些急需解決的難題：①SrtAi 的療效仍然需要在膿毒癥或形成膿腫的體內(nèi)感染模型中進一步仔細評估；②需要進一步研究SrtAi與其他抗菌劑（如抗菌藥物和抗真菌藥物）或其他成分的合用，以提高其水溶性或生物利用度，從而降低最終配方中所需化合物的濃度；③SrtAi 應(yīng)具有良好的成本效益，從而有利于其最終在臨床廣泛應(yīng)用；④SrtAi 應(yīng)在不影響人體內(nèi)正常微生物菌群恢復(fù)下削弱細菌致病性，從而防止超級病菌的發(fā)展。綜上所述，SrtAi 對金黃色葡萄球菌甚至MRSA 感染展現(xiàn)出一定的臨床療效，盡管仍需優(yōu)化解決一些問題才能應(yīng)用于臨床，但其為克服AMR 的發(fā)展提供了新的研究方向。隨著研究的深入推進，SrtAi在未來十分有可能應(yīng)用于治療革蘭陽性超級細菌感染。