原子力顯微鏡在纖維素研究中的應(yīng)用

郭元龍， 郭 顧， 陳子祥， 張麗華， 謝海波*， 鄭 強

原子力顯微鏡在纖維素研究中的應(yīng)用

郭元龍1， 郭 顧1， 陳子祥1， 張麗華1， 謝海波1*， 鄭 強2

（1. 貴州大學(xué)材料與冶金學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 太原理工大學(xué)，山西 太原 030024）

綜述了原子力顯微鏡（AFM）的測試原理及在纖維素研究中的應(yīng)用進展，重點對纖維素的晶體結(jié)構(gòu)、微觀形貌、酶解過程及衍生物等方面的研究做了詳細論述，確定了AFM對以上研究內(nèi)容的重要性，并給出了不同AFM應(yīng)用的具體實施案例和操作方法。不僅如此還對AFM力學(xué)性能測試、探針修飾技術(shù)及與其他技術(shù)手段連用等新型測試方法做了概括性總結(jié)。最后展望了AFM高級成像技術(shù)在纖維素研究中的發(fā)展前景，對纖維素基新材料的研究提供新的思路和方法，具有一定參考價值。

原子力顯微鏡；探針修飾；定量納米機械力測試；纖維素；纖維素衍生物

1982年瑞士的科學(xué)家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer發(fā)明了掃描隧道顯微鏡（STM）[1]。該技術(shù)能夠簡單有效的揭示材料表面信息，主要利用探針和導(dǎo)電表面之間隨距離成指數(shù)變化的隧穿電流來進行成像，從而獲得原子尺度上立體成像。伴隨STM技術(shù)的問世，這兩位科學(xué)家獲得了1986年諾貝爾物理學(xué)獎。基于STM技術(shù)，1986年原子力顯微鏡（AFM）出現(xiàn)了[2]。不同于掃描隧道顯微鏡，AFM主要通過探針針尖與樣品表面間的作用力的變化情況來反映材料納米級信息。其工作環(huán)境可以是在真空、大氣甚至液相中，測試對象可以為導(dǎo)體、半導(dǎo)體和絕緣體，鑒于此，AFM在化學(xué)、材料和生物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在一定程度上彌補了STM只能對導(dǎo)電樣品的表面進行研究的不足。基于STM和AFM的應(yīng)用，近年又發(fā)展出了由探針在樣品表面網(wǎng)格狀逐點掃描技術(shù)來獲取樣品形貌的近場光學(xué)顯微鏡（SNOM）[3]、由導(dǎo)電探針掃描半導(dǎo)體表面測量樣品電容變化的掃描電容顯微鏡（SCM）[4]、通過磁性探針掃描磁性樣品，檢測探針和磁性樣品表面的相互作用以重構(gòu)樣品表面磁性結(jié)構(gòu)的磁力顯微鏡（MFM）[5]、基于微懸臂的扭轉(zhuǎn)彎曲程度隨表面摩擦特性變化而增減的橫向力顯微鏡（LFM）[6]、基于測量探針與樣品的靜電相互作用，來表征樣品表面靜電勢能，電荷分布以及電荷輸運的靜電力顯微鏡（EFM）[7]、可以繪制樣品的表面電勢或功函數(shù)的開爾文探針顯微鏡（KFM）[8]等；隨著對快速成像及納米力學(xué)性能的測試需求，又出現(xiàn)了高速掃描顯微鏡（HS-AFM）[9]和力學(xué)顯微鏡（PF-QNM）等。以上這些顯微鏡都是基于掃描探針成像機理，可統(tǒng)稱為掃描探針顯微鏡（SPM）。對于AFM而言其反饋的物理量參數(shù)決定其成像模式。迄今為止，AFM常用的成像模式有：輕敲模式（Tapping Mode）[10]，接觸模式（Contact Mode）[11]，非接觸模式（Noncontact Mode）[12]，扭轉(zhuǎn)共振模式（TR Mode）[13]和峰值力模式（Peak Force Tapping Mode）[14]，大部分掃描探針顯微技術(shù)都是從以上模式衍生而來。

1 AFM傳統(tǒng)成像技術(shù)

1.1 AFM在纖維素的晶體結(jié)構(gòu)表征上的應(yīng)用

纖維素是木質(zhì)纖維中的主要組成部分，其廣泛存在于植物、動物和菌類等體內(nèi)，具有生物降解、生物相容性、力學(xué)性能優(yōu)異等特性[15]，主要由β-(1-4)-D-葡萄糖重復(fù)單元鏈接而成，由于鏈的堆砌和排列方式的不同形成了不同晶型結(jié)構(gòu)的分子鏈。根據(jù)分子鏈極性的差異，纖維素晶型結(jié)構(gòu)可分為兩種：一種是平行鏈晶型，如纖維素Ⅰα、Ⅰβ、ⅢΙ、和ⅣI；另一種是反平行鏈晶型，如纖維素Ⅱ、ⅣII[16]。其中Ⅰ型是天然纖維素存在形式，通常含有三斜晶體結(jié)構(gòu)的Ⅰα和單斜晶體結(jié)構(gòu)的Ⅰβ。不同晶型纖維素之間可以相互轉(zhuǎn)變：纖維素Ⅰα經(jīng)熱處理可轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素Ⅰβ，它比Ⅰα更穩(wěn)定。對于纖維素的結(jié)構(gòu)表征手段主要有：X-射線衍射（XRD）、核磁共振（NMR）、紅外光譜（FT-IR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）及AFM等。Andrew A. Baker等[17]在1998年就使用AFM來研究源于泡狀海藻的天然微晶纖維素I型的表面結(jié)構(gòu)。AFM高分辨圖像提供了表面清晰的結(jié)構(gòu)，沿纖維素鏈的葡萄糖亞結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元約為0.52 nm，并且分子內(nèi)間距約為0.6 nm。來自于Valonia ventricosa的海藻纖維素，在同一種微纖維束中，同時存在三斜Iα和單斜Iβ晶型。這兩種晶型最主要的不同就在于在C軸四分之一周期處即0.26 nm形成了一個纖維素二糖單元對角偏移或者錯列排布，導(dǎo)致鄰近鏈產(chǎn)生了替換。此項工作最重要的部分是通過觀測纖維素分子上的大體積O6基團的形貌，確定了纖維素二糖重復(fù)單元。

Wan Li等[18]通過AFM研究了秸稈的細胞壁上的結(jié)晶纖維素。樣品先經(jīng)過DMSO處理再用AFM觀察，確定了結(jié)晶纖維素的兩個異構(gòu)體三斜Iα和單斜Iβ相（圖1）。圖1a、1b顯示了不同的形態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)，箭頭1表明了纖維素分子鏈的取向，對應(yīng)的曲線分別顯示了沿箭頭線1和沿非箭頭線2的截面分析。纖維素分子鏈上每個突出糖環(huán)的大的羧甲基基團顯示了AFM圖片上纖維素的形貌特征。Connolly算法認為1.04 nm間距的二糖的重復(fù)單元是纖維素分子鏈的基本結(jié)構(gòu)，而不是0.52 nm的單糖重復(fù)單元[19]。因此，對應(yīng)于圖1中纖維二糖的重復(fù)間距是1.1 nm。從圖1a可以看出，線2表面的是分子鏈上的突出物即羧甲基基團的取向，符合Ⅰα的晶體結(jié)構(gòu)特征。圖1b觀察到按矩形、單斜（110）晶型排布，即Ⅰβ晶型。圖1圖片的尺寸約為20 nm，可反映出秸稈的細胞壁的晶粒含有一種晶型的長程結(jié)構(gòu)，Ⅰα和Ⅰβ晶粒分別是按三斜（010）和單斜（110）晶型緊密的平行排列在細胞壁的表面，但是在整個結(jié)晶區(qū)域Ⅰβ晶粒多于Ⅰα晶粒。

圖1 秸稈細胞壁的纖維素AFM圖[18]

1.2 AFM在纖維素的微觀形貌上的應(yīng)用

除了研究其晶體結(jié)構(gòu)，也可用AFM研究纖維素微觀形貌特征，如木材[20]、稻草秸稈[21]、紙漿木漿[22]、植物細胞壁纖維[23]、細菌纖維素[24]等。Andrew R. Kirby等[25]早在1996年使用AFM來研究含水的植物細胞壁的結(jié)構(gòu)，AFM圖清晰地展示了荸薺、蘋果、胡蘿卜和土豆的細胞壁圖（見圖2）。其中，圖2A顯示的是荸薺細胞壁的高度圖：高度范圍由黑到黃是0～85 nm；圖2B蘋果細胞壁的高度圖：高度范圍由黑到黃是0～62 nm；圖2C蘋果細胞壁的誤差信號圖；圖2D胡蘿卜細胞壁的誤差信號圖：掃描范圍2.5×2.5 μm；圖2E胡蘿卜細胞壁的誤差信號圖；圖2F土豆細胞壁的誤差信號圖。AFM圖片展示了植物細胞壁的分層結(jié)構(gòu)及獨立的纖維素束和包間連絲。

圖2 植物細胞壁的AFM圖，掃描范圍1×1 μm[25]

Tetard L等[20]用AFM表征了柳枝稷和楊樹兩種植物細胞的不同，并用基于tapping模式的，探針和樣品都受多重諧波驅(qū)動的多功能性模式（MSAFM）獲得了清晰的楊樹植物細胞壁結(jié)構(gòu)，并且可以區(qū)分不同的組織。如圖3所示MSAFM圖比普通的AFM圖可以獲得更多的信息，可以給出木質(zhì)纖維素樣品的結(jié)構(gòu)，以及不同區(qū)域或者結(jié)構(gòu)在力學(xué)性能上的差異。其中箭頭所指區(qū)域是植物細胞壁，屬于中間層（ML）。

圖3 楊樹木片的橫截面的AFM（a、c）和MSAFM（b、d）圖[20]

Song等[26]利用AFM對玉米的初生細胞壁和次細胞壁進行成像，通過分析不同的細胞壁，作者認為主細胞壁的微纖維尺寸是3.68±0.13 nm寬，2.25±0.10 nm高。通過疊加這些微纖維的多個AFM高度剖面，這些截面的疊加面積估計為5.6±0.4 nm2。作者還在初生細胞壁中發(fā)現(xiàn)，所有這些單獨的微纖維都可以追溯到更大區(qū)域的束，這表明纖維素在初生細胞壁中被合成為大束，然后在細胞擴張或伸長時分裂。在細胞停止生長的次細胞壁中，觀察到幾乎平行纏繞或單獨的微纖維被嵌入在基質(zhì)聚合物中，沒有分裂效應(yīng)，這表明了在初生細胞壁和次細胞壁中不同的纖維素生物合成機制。如圖4A所示，顯示了生長4周的玉米，箭頭所指的第三節(jié)間包含（圖4B～4F）所有的細胞層；圖4B薄的初生細胞壁；圖4C莖薄壁組織中增厚和膨大的初生細胞壁；圖4D表皮下外皮纖維中加厚和拉長的初生細胞壁；圖4E維管束中纖維的次生細胞壁；圖4F木質(zhì)部血管細胞中的次生細胞壁，圖中比例尺＝2 cm（圖4A），50mm（圖4B～4F）。

圖4 玉米組織的光學(xué)圖片（A）；及使用AFM對其進行成像（B～F）[26]

Anuj K Chandel等[27]研究了甘蔗渣（SB）經(jīng)草酸調(diào)制熱化學(xué)預(yù)處理（OAFEX）過后的超微結(jié)構(gòu)圖，以及經(jīng)休哈塔假絲酵母（）和啤酒酵母（）酵母菌發(fā)酵后乙醇的產(chǎn)量。作者認為經(jīng)OAFEX處理后，可以克服甘蔗渣的天然抗分解性，從而使纖維素酶更加容易的進入纖維素微纖維的內(nèi)部。OAFEX處理可以是半纖維溶解，并釋放出糖類，并使纖維木質(zhì)素以一種更容易被酶解的形式存在。通過酶解過程，纖維木質(zhì)素具有高的水解效率66.51%。用SEM、AFM（圖5）、Raman spectroscopy、FT-NIR、FT-IR和XRD表征了經(jīng)OAFEX處理以及酶解后甘蔗渣的超微結(jié)構(gòu)的變化情況。最終得出這樣的結(jié)論：OAFEX處理可以使半纖維素分解，提高纖維素酶在纖維木質(zhì)素上的通過能力，并且可以使經(jīng)預(yù)處理的底物釋放發(fā)酵糖。并且可以在分子尺度對經(jīng)各種處理過的甘蔗渣微纖維結(jié)構(gòu)進行表征。AFM圖展示了天然甘蔗渣表面上纖維素和半纖維素互相交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)草酸預(yù)處理后，不均勻表面上出現(xiàn)了木質(zhì)素的球狀沉積物。圖5a顯示了天然甘蔗渣，圖5b草酸預(yù)處理后的甘蔗渣和5c酶解后的甘蔗渣的AFM圖片。

圖5 各種不同甘蔗渣的Tapping模式的AFM振幅圖[27]

Simola J等[28]則比較了在經(jīng)氧化/堿的去木質(zhì)化處理之后松樹和樺樹紙漿纖維的表面變化情況?？梢杂^察到在去木質(zhì)化過程中，表面的顆粒狀結(jié)構(gòu)被纖維狀結(jié)構(gòu)所取代。AFM可以清楚的展現(xiàn)這些區(qū)域的變化情況，并且認為紙漿表面的木質(zhì)素呈現(xiàn)顆粒狀結(jié)構(gòu)，因為隨著紙漿kappa值的降低，相應(yīng)的顆粒狀相也減少了。并且在處理后期，樣品表面的木質(zhì)素濃度要遠高于塊狀木質(zhì)素的含量。在去木質(zhì)化過程即將完成時，兩種紙漿都可以觀察到單獨的纖維素微纖維（直徑約為0.01～0.03mm）。圖6a、6c是經(jīng)熱制和氧化脫木質(zhì)素處理后的纖維AFM的高度圖；圖6b、6d是對應(yīng)的相位；圖6a、6b掃描范圍2mm，是樺樹紙漿經(jīng)10 min熱制和氧化脫木素處理后的形貌；圖6c、6d圖掃描范圍1.5mm，是經(jīng)220 min熱制和氧化脫木素處理后的形貌。圖6a～6d在Z方向的尺度分別為300 nm、30o，500 nm和50o。

圖6 經(jīng)熱制和氧化脫木質(zhì)素處理后的纖維形貌圖[28]

Gilli等[29]用臭氧處理高卡帕值牛皮紙漿，并用FT-IR和AFM對其結(jié)構(gòu)進行表征。這兩種互補的測試手段對纖維上的反應(yīng)位點進行了詳細的分析，并對使用臭氧進行去木質(zhì)化的機理給出了解釋：首先，臭氧攻擊木質(zhì)素上可能的反應(yīng)位點如木質(zhì)素和纖維素的界面處；其次，臭氧對木質(zhì)素整個表面的攻擊是均勻地，表面較為粗糙的地方可以提供更多的反應(yīng)位點，較小的沉淀物分解的更快，而較大的沉淀物則較慢。氧化反應(yīng)和暴露在表面的纖維素面積成正比例關(guān)系，并且可以用FT-IR對去木質(zhì)化反應(yīng)進行定量表征。測試分析進一步表明，纖維素和半纖維素不會被臭氧氧化，主要是由于氧化木質(zhì)素芳香環(huán)所需要的活化能小于氧化纖維素和半纖維素羥基所需的活化能。圖7顯示了不同卡帕值к（從8～45）的紙漿經(jīng)氧化處理后表面的沉淀物AFM圖：к＝8（圖7a）；к＝30（圖7b）；к＝40（圖7c）；к＝45（圖7d）。

圖7 不同卡帕值к的紙漿經(jīng)氧化處理后表面的沉淀物AFM圖[29]

木醋桿菌是一種可以產(chǎn)生纖維素的細菌，它可以根據(jù)培養(yǎng)條件的不同產(chǎn)生兩種類型的纖維素（Ⅰ型和Ⅱ型）[24]。木醋桿菌形成的纖維素并不是細胞壁的一部分，而是通過細胞膜的纖維素噴嘴（cellulose export component）分泌到菌體外。纖維素合成酶合成纖維素分子鏈，它又通過細胞膜外層的纖維素噴嘴“噴絲”到培養(yǎng)基中。在“噴絲”的同時，纖維素分子鏈組裝成原細纖維，原細纖維進而成束聚合成“帶狀纖維素微纖絲”[30]。在“噴絲”過程中，一些無法穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部但能與纖維素分子鏈形成競爭氫鍵的物質(zhì)（如羧甲基纖維素、熒光增白劑等），使纖維素鏈的超分子結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大改變，形成無定形區(qū)，導(dǎo)致纖維素微纖絲結(jié)構(gòu)的變化，纖維素Ⅰ轉(zhuǎn)變成熱穩(wěn)定性更高的纖維素Ⅱ。Asako Hirai[31]用TEM和AFM表征由木醋桿菌產(chǎn)生的纖維素帶，帶狀纖維素片的散焦―對比TEM圖如圖8a所示；圖8b是對應(yīng)于8a方框內(nèi)區(qū)域的AFM圖；圖8c為8b中對應(yīng)的3條線的高度曲線。

圖8 帶狀纖維素片的散焦―對比TEM圖和相應(yīng)AFM圖[31]

除了以上研究，閻立峰等[32]使用經(jīng)甲苯/乙醇，過氧化氫，鹽酸和乙醇的處理后成功地萃取了小麥秸稈，得到了脫蠟后的樣品以及不可溶纖維素殘基，半纖維素和木質(zhì)素。AFM研究展示了秸稈細胞壁的主要結(jié)構(gòu)包含了纖維素微纖維束和半纖維素、木質(zhì)素。半纖維素的主要作用就是把纖維素交聯(lián)起來，形成一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而木質(zhì)素主要是聚集在其表面形成一個保護層。AFM結(jié)果和Vincent[33]的細胞壁理論模型相一致。除此之外他們還采用氫氧化鈉/硫脲水溶液來溶解纖維素[34]，使用的原料是微晶纖維素和從小麥秸稈分離出的纖維素。用噴涂工藝把纖維素溶液沉淀在聚丙烯酰胺（PAM）修飾過的基底上，再經(jīng)洗滌即制得了含有兩種纖維素的膜材料。并用AFM對其表面形貌、粗糙度和厚度進行表征。

Xiang Li等[35]通過原位形成的基于有機堿/CO2/DMSO的可逆離子液體混合有機電解質(zhì)來溶解預(yù)處理纖維素。通過FT-IR，XRD，SEM，AFM系統(tǒng)地研究了混合離子液體的組成，CO2壓力，預(yù)處理時間對纖維素物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，深入理解了預(yù)處理條件，纖維素微觀結(jié)構(gòu)和酶解糖化之間的關(guān)聯(lián)性。作者使用AFM表征了經(jīng)溶解體系預(yù)處理前后的纖維素的形貌和粗糙度變化情況，結(jié)果表明經(jīng)該體系預(yù)處理的纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排，表面變的非常粗糙，更有利于酶解糖化。

1.3 AFM在纖維素酶解研究中的應(yīng)用

除了以上使用化學(xué)試劑方法來處理纖維素外，許多學(xué)者也使用纖維素酶來處理纖維素，然后利用原位AFM或者高速AFM（HS-AFM）來進行表征。常使用的里氏木霉纖維素酶主要有三種成分：內(nèi)切纖維素酶（EG），外切纖維素酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）。EG主要是分解纖維素?zé)o定型區(qū)，使結(jié)晶區(qū)暴露出來，隨機水解纖維素鏈內(nèi)的β-1,4-糖苷鍵，并產(chǎn)生新的還原性末端，而EG的分解速度決定了整個水解反應(yīng)的速度[36]。而CBH由兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域組成，一是屬于糖類鍵合模塊家族1的小的纖維素鍵合區(qū)（CBD），主要是作用吸附在基底上；二是糖苷水解家族7的催化區(qū)（CD），主要作用是催化糖苷鍵的分裂?？偟膩碚f就是切斷纖維素鏈末端，釋放可溶的纖維素二糖和葡萄糖；BG降解纖維二糖稱為葡萄糖，消除二糖對CBH和EG的底物抑制作用。CBH還分為CBHI和CBHII，CBHII主要是解構(gòu)結(jié)晶纖維素，同時也有可能分解無定型纖維素，使結(jié)晶區(qū)更加明確的暴露出來并小幅分解結(jié)晶纖維素。CBHI主要是針對表面尺寸小于10 nm的結(jié)晶納米纖維束進行分解，如果結(jié)晶區(qū)表面被無定型區(qū)覆蓋，不能被分解。所以CBHI需要其他酶的輔助[37]。植物細胞壁中的多晶態(tài)纖維素由單個的多糖分子鏈緊密地連接在一起，形成納米結(jié)構(gòu)，通常就是指基本的原纖維。這些原纖維又聚集在一起形成更高階的超分子組裝，最終纖維素含有約70%的這種高結(jié)晶物質(zhì)[38]。

Hao Liu等[39]利用完整的纖維素酶：有帶纖維素結(jié)合域（CBD）的內(nèi)切纖維素酶（EGV）和突變體不含纖維素結(jié)合域的內(nèi)切纖維素酶（EGI），用于水解漂白的蘆葦牛皮紙漿樣品。用AFM Tapping相位成像來表征纖維素纖維表面的微纖維素的變化情況，圖9顯示了分別經(jīng)歷6～24 h纖維素孵化不同時間后的蘆葦漿的AFM圖。結(jié)果表明纖維素酶在水解過程中可以把微纖維素剝離成更小的束（在Y方向），或在垂直于纖維素束方向變短（在X方向），隨著水解時間的延長，纖維素束逐漸剝離，并且變成小棒狀和谷粒狀。經(jīng)過24小時的處理，纖維素纖維的表面上的微纖維素會降解成更小的片段。EGV和EGI兩種酶都會導(dǎo)致纖維素的剝離，但是纖維素束的長度不會有明顯的變化。

圖9 蘆葦漿經(jīng)纖維素酶N342孵化不同時間后的AFM相圖[39]

Kiyohiko Igarashi等[40]通過高速AFM（HS-AFM）實際觀察了里氏木霉（）纖維素二水解酶I（Cel7A）分子在結(jié)晶纖維素上的滑動。它們在結(jié)晶纖維素上滑動的平均速度是3.5 nm/s。沒有纖維素鍵合區(qū)的催化區(qū)的移動速度和完整的Cel7A酶的移動速度基本一樣。然而不活躍的催化酶（突變體E212Q，可以和結(jié)晶纖維素鍵合但是不能沿著分子鏈運動）或者缺乏色氨酸的突變體（突變體W40A，受CD和E212Q控制，只能在纖維素鏈上抬起一點點，并且是在反復(fù)的進行吸附和解吸附過程）也可以被檢測到。這說明，除了糖苷鍵的水解作用，在隧道型活性位點的纖維素鏈的負載過程對于酶解也是很重要的。

除此之外還可以觀察到Cel7A分子沿結(jié)晶纖維素Iα型表面單向滑動，但是在某一點處出現(xiàn)了集體的停止，類似交通堵塞的現(xiàn)象。作者使用超臨界氨處理纖維素，使其從Iα型轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素Ⅲ?型，可以顯著提高Cel7A的酶解作用[41]。這是由于Cel7A對纖維素Ⅲ?型的鍵和能力更強。在纖維素Iα上，酶只沿固定的線路滑動，而在纖維素Ⅲ?型上，酶基本布滿整個晶面。Lehti?和他的研究者認為Cel7A的CBD區(qū)域是鍵和在纖維素Iα的疏水晶面(1ī0)上的，并從(1ī0)那面開始降解纖維素[42]。而纖維素Iα的疏水面(1ī0)在親水面(100)和(010)中間，纖維素Ⅲ?有相似的疏水面(1ī0)，親水面(010)，但是它的(100)面卻是適度疏水的[43]。這就使得Cel7A不止沿(1ī0)面滑動，并且也會沿(100)面滑動。對比纖維素Ⅰα和Ⅲ?，增大Cel7A的活動區(qū)域，就會促進結(jié)晶纖維素的水解。但是在纖維素Ⅲ?的表面上，仍然可以觀察到當(dāng)一個酶分子在纖維素表面遇到障礙物停止時，后面的分子就會跟著停止，引起的交通堵塞情況。圖10顯示了HS-AFM觀察到Cel7A分子在纖維素Ⅲ?表面的運動情況：Cel7A從右移動到左邊，每張圖時間間隔是0.3 s（圖10A），在纖維素表面出現(xiàn)了擁擠情況；Cel7A在纖維素表面聚集后導(dǎo)致出現(xiàn)了原纖化過程（圖10B），每張圖的時間間隔是1.5 s；原纖化過程產(chǎn)生的機理示意圖（圖10C）。

圖10 HS-AFM觀察到TrCel7A分子在纖維素Ⅲ?表面的運動情況[44]

Thomas Ganner等[37]系統(tǒng)地研究了在纖維素水解過程中各種酶之間的協(xié)同作用。用原位AFM來表征多晶態(tài)纖維素基底的降解過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這是一個動態(tài)循環(huán)過程，并且纖維素是有選擇性的暴露和移除。鏈端―裂開的酶CBHI、CBHII和內(nèi)部鏈―裂開的酶EG分別扮演者不同的角色圖11顯示了通過AFM原位觀察單個酶運動情況解析了酶的協(xié)同作用：（A）CBHI分解小纖維（AFM相圖）；（B）CBHII通過移除無定型區(qū)來打磨大晶粒的表面（AFM相圖）；（C）EG通過去除無定型區(qū)使表面更加清晰（AFM振幅圖）；（D）CBH II的“簇”效應(yīng)；圖中標尺為100 nm。首先EG和CBHII通過移除基底上的無定型區(qū)域，使結(jié)晶的納米纖維素暴露出來，從而使CBHI更容易的進入到里面。然后這些納米纖維素就被CBHI所分解，分解后又重新露出無定型區(qū)，然后又被EG和CBHII所移除。如果前期沒有EG和CBHII的作用，那么CBHI就很難吸附在纖維素基底上。纖維素酶間的協(xié)同作用是具有形態(tài)依賴性的，通過無定型區(qū)和結(jié)晶區(qū)的分解，各種酶之間有合作關(guān)系。因此，結(jié)晶纖維素束的尺寸和堆積程度直接決定了酶的降解速度。

圖11 酶協(xié)同作用解析：AFM原位觀察單個酶運動情況[37]

為了進一步解開酶-纖維素的生物反應(yīng)的基本機理，選擇合適的纖維素基底是決定性因素。Thomas Ganner[45]又制備了一種半結(jié)晶的薄的纖維素膜（SCFTC）基底，這種基底可以滿足對理想纖維素基底的研究：通過改變無定型纖維素基底中尺寸均勻的纖維素納米晶的含量，來調(diào)解纖維素的多晶態(tài)結(jié)構(gòu)。研究用HS-AFM來對納米級的表面進行成像，圖12中白色箭頭指明了結(jié)晶區(qū)，而灰色箭頭指的是被覆蓋的結(jié)晶區(qū)，深入研究了材料的性質(zhì)：證實了該SCTFC基底適合酶解，并且通過復(fù)合或單獨使用Cel6A/Cel7A酶研究其協(xié)同作用對纖維素的降解情況。在圖12 A是由瘦長的針狀的纖維素納米晶構(gòu)成的結(jié)晶纖維素膜AFM高度圖，SEM圖，TEM圖，圖中標尺為200 nm；圖12B是SCTFC（半結(jié)晶-薄-膜-纖維素）層的AFM力學(xué)模式圖。內(nèi)部的三個小圖：高度圖（上面），剛度圖（中間）和形變量圖（左下），圖中標尺為1 μm。

Chengrong Qin等[46]通過研究里氏木霉和纖維素、木質(zhì)素之間的作用力不同來說明木質(zhì)素對纖維素酶有一定的粘合力，從而影響纖維素酶對纖維素的水解作用。首先，把里氏木霉固定在硅片上，然后分別用硫酸鹽木質(zhì)素和羥丙基纖維素來修飾AFM探針針尖，接著測量纖維素酶和木質(zhì)素以及纖維素酶和纖維素之間的力的變化。結(jié)果表明硫酸鹽木質(zhì)素和纖維素酶之間的吸引力比羥丙基纖維素和纖維素酶之間的吸引力大約45%。然后AFM探針針尖分別用疏水基團，-OH和-COOH來進行修飾，用來和纖維酶產(chǎn)生疏水，H鍵和電荷-電荷作用力。結(jié)果表明用疏水基團修飾過的針尖和纖維素酶之間的作用力要比使用-OH和-COOH基團的針尖的作用力強。該工作說明了一個重要的問題，即硫酸木質(zhì)素和纖維素酶之間的作用力要強于纖維素和纖維素酶之間的作用力，從而會影響酶解過程。并且纖維素酶對木質(zhì)素的主要作用力來自于疏水鍵合作用。

圖12 SCFTC基底的AFM，TEM及SEM圖（A），相對性的力學(xué)模式圖（B）[45]

1.4 AFM在纖維素衍生物研究中的應(yīng)用

除了以上基于纖維素結(jié)構(gòu)特征研究，許多學(xué)者還利用AFM對纖維素衍生物做了大量的研究工作：羧甲基纖維素（CMC）是一種多糖，可以廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙、粘合劑、涂料、制藥、化妝品和礦物加工等行業(yè)[47]。它是一種無毒無害可生物降解的天然有機高分子。到目前為止，仍然不清楚它和固體表面的作用機制。Wang等[48]通過吸附、電泳遷移率的測量、FT-IR、熒光光譜、AFM和分子模型研究了CMC在固體表面的吸附機理。而AFM在此研究中主要是用于確定pH值對吸附效果的影響，結(jié)果表明靜電力作用可以影響CMC在固體表面的吸附效果，并且同時測得吸附層的厚度約為1 nm，說明CMC的高分子鏈是平鋪在固體表面的。但是其他測試手段也表明CMC和固體表面也存在氫鍵作用，所以最終作者認為CMC主要是靠靜電力和氫鍵共同作用而吸附在其表面。

用于蛋白質(zhì)分離的高分子膜必須有一定的抗污能力，在使用過程中就可以減少膜和蛋白質(zhì)之間的相互作用[49]。Sahadevan Rajesh利用聚酰胺亞胺（PAI）作為改性劑，使用相轉(zhuǎn)移技術(shù)制備出具有卓越性能的醋酸纖維素（CA）膜。并分別用ATR-FTIR、SEM、AFM，分子量篩截和孔徑分析來研究PAI對復(fù)合膜性能的影響。SEM結(jié)果表明復(fù)合CA膜的表層更薄，亞層孔隙率更高。用牛血清蛋白作為模型蛋白質(zhì)，研究了此膜的抗污能力。在蛋白質(zhì)過濾中，利用一系列的模型分析，研究了其抗污特性。用AFM可以表征膜在吸附蛋白質(zhì)前后的變化情況，并且還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)優(yōu)先吸附在膜表面上的特殊位置，例如表面較粗糙和具有親水性的地方。被污染的膜可以輕易地用去離子水超聲清洗掉蛋白質(zhì)。因此，把PAI和CA基體相結(jié)合，可以制備出具有低污染、超濾性能的膜，用于蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域。圖13顯示了不同經(jīng)4 h蛋白質(zhì)后污染后的膜（/）的AFM 3D圖像：（a）100/0；（b）90/10；（c）80/20；（d）70/30。

圖13 過濾4 h蛋白質(zhì)后污染后的復(fù)合膜（w/w）的AFM 3D圖像[49]

Jayalakshmi[50]利用聚異酞酰胺（PIPA）接枝甲基丙烯酰胺（MAA），制備出共聚物PIPA-g-MAA，用于對醋酸纖維素表面修飾改性和提高其抗污性。接枝共聚可以提高PIPA在質(zhì)子惰性溶劑中的溶解，并使其應(yīng)用于醋酸纖維素膜的改性。改性后的復(fù)合膜只有一個玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，這說明醋酸纖維素和PIPA-g-MAA具有良好的相容性，并且復(fù)合膜的接觸角更低，表面親水性更好。通過與PIPA-g-MAA共混，膜的熱力學(xué)機械性能也得到了提升。通過AFM研究了膜對不同的商業(yè)通用蛋白質(zhì)的分離效果，同樣也發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜比醋酸纖維素膜有更優(yōu)異的分離性能和抗污性能。

聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、纖維素酯的微孔薄膜可以作為帶功能團的本征導(dǎo)電高分子（ICP）的基底膜，這種復(fù)合膜具有可控的選擇透過性[51]。為了制備一種有效的含有微孔結(jié)構(gòu)的非對稱的復(fù)合膜，控制ICP在基底膜上的沉淀過程是非常重要的。通過精確地ICP沉淀過程制備出的具有可控形態(tài)的膜，具有高度的透過性和可選擇性。Shehzad[52]用各種原位的溶液―相聚合和化學(xué)氣相沉淀技術(shù)把聚苯胺沉積在纖維素酯微孔膜上，詳細地研究了反應(yīng)物不同的接觸模式效果，比如在單體溶液中的浸泡時間和聚合時間。并分別用FT-IR、AFM和XRD研究了膜表面的聚苯胺沉積層和它的均勻性、結(jié)晶性。這篇論文系統(tǒng)地討論了聚苯胺在纖維素微孔膜上的沉積情況及各種影響因素，并認為膜的沉積程度、結(jié)晶度、表面粗糙度、導(dǎo)電性都受浸泡時間的影響較大。

2 AFM力學(xué)及探針修飾技術(shù)

在前面幾部分詳細討論了關(guān)于纖維素及其衍生物的結(jié)構(gòu)、性能及應(yīng)用，但是也有學(xué)者從AFM技術(shù)本身來研究材料的性能，比如基于AFM的力學(xué)―定量納米機械力測量（QNM）、單分子力譜、納米壓痕技術(shù)和探針修飾技術(shù)。

纖維素納米晶（CNCs）由于其卓越的力學(xué)性能和化學(xué)性能被認為是卓越的綠色納米材料，然而一致缺乏對于單根CNCs的性質(zhì)的研究。Roya R. Lahiji等[53]利用AFM詳細研究了在不同濕度和氣氛環(huán)境下木材衍生的CNCs的形貌，彈性和粘附力等性質(zhì)。通過3D有限元計算針尖在CNC上的壓入深度來獲得力曲線，從而可以通過一系列的模型和公式來計算CNC橫截面彈性模量（ET）。如圖14顯示了CNC-AFM壓痕的3D 四分之一對稱模型圖：（a）當(dāng)發(fā)生接觸或大形變時有約20 000元素和網(wǎng)格；虛線正方形表示b部分中顯示的放大區(qū)域；（b）在載壓時，CNC內(nèi)部的應(yīng)力分布情況。經(jīng)過計算，在0.1%相對濕度，氮氣環(huán)境下，一根單獨的CNC的ET在18～50 GPa。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管單根CNC的高度會有變化（3～8 nm），但CNC的力學(xué)性質(zhì)是沿著整個長度均勻分布的。同時作者還認為相對濕度的變化對CNC的形貌和性質(zhì)影響不大，從而也證實了纖維素納米晶具有一定的抗水性。

圖14 CNC-AFM壓痕的3D 四分之一對稱模型圖[53]

Peak Force QNM（PFQNM）是一種基于Bruker專利技術(shù)Peak Force Tapping的測量模式，它能在獲得樣品形貌的同時獲得材料的定量納米力學(xué)性質(zhì)。首先通過Peak Force Tapping技術(shù)獲得一系列力曲線，然后通過數(shù)學(xué)模型對力曲線進行擬合分析計算，從而獲得樣品的定量納米力學(xué)性質(zhì)[54]。Ivan Usov等[55]利用AFM及PFQNM、低溫SEM、TEM聯(lián)合表征三種不同來源和預(yù)處理的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）氧化木材纖維素納米纖維（W-CNF）、木材纖維素納米晶（W-CNC）和硫酸水解細菌纖維素納米晶（B-CNC）在單粒子水平上的高分子物理性能。圖15顯示了使用PFQNM模式對納米纖維素進行測試：（a）樣品的AFM高度圖；（b）相對應(yīng)的模量圖；（c～e）箭頭所指的樣品的模量分布圖；（f）紅藍黑三種顏色分別表示存在扭結(jié)的纖維及扭結(jié)處相對應(yīng)的模量分布（g）。

圖15 基于PFQNM模式的納米纖維素數(shù)據(jù)[55]

作者發(fā)現(xiàn)，所有類型的纖維素納米纖維和納米晶沿輪廓方向都存在可觀察的扭結(jié)，并且都是右手手性的。對于W-CNF，更是分別從纖維束和單纖維水平都發(fā)現(xiàn)了扭結(jié)的右手手性。對于扭結(jié)進行統(tǒng)計分析，扭結(jié)角度是非高斯分布的，這說明扭結(jié)并不是由于纖維素結(jié)構(gòu)上無定型區(qū)和結(jié)晶區(qū)交替分布導(dǎo)致的，這之前文獻報道的不同[56]。相反，它們可能源自用于不同的制備加工過程。PFQNM用于表征納米纖維素在橫向上的機械性質(zhì)，測試結(jié)果楊氏模量QNM為20～50 GPa。用持續(xù)長度方法計算，在縱向上的模量E為4.5～18.4 GPa，這個模量會受纖維上未被發(fā)現(xiàn)的小角度扭結(jié)的影響而被低估。最后作者認為W-CNF和W-CNC的單個纖維素高分子鏈的持續(xù)長度為63～65 nm。

Li等[57]利用AFM納米壓痕技術(shù)和光學(xué)顯微鏡連用，原位測試了溶劑蒸發(fā)過程中，溶脹的纖維素球的機械性能和尺寸變化。并且認為在纖維素球的溶脹過程中有3個影響因素：1）纖維素溶液的濃度；2）纖維素鏈之間的相互作用；3）纖維素球內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性。Longming Jin等[58]用γ-戊內(nèi)脂和離子液體的新混合體系來快速溶解預(yù)處理玉米秸稈，并通過XRD、SEM和AFM系統(tǒng)的分析了經(jīng)預(yù)處理后的玉米秸稈的成分組成，并闡述了玉米秸稈的物理化學(xué)特征對后續(xù)生物降解的天然頑固性的處理效果。經(jīng)過預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素會從I型轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀捉到獾睦w維素II型，并且其表面的木質(zhì)素也會明顯的減少和遷移。而作者就是利用木質(zhì)素和纖維素模量的差異，通過PFQNM模式來表征經(jīng)預(yù)處理前后的玉米秸稈的模量和形變量的不同來反映此過程。

在造紙業(yè)，單根紙漿纖維之間鍵和會受到纖維潤濕狀態(tài)時硬度的影響。Christian Ganser等[59]通過AFM-納米壓痕來研究相對濕度（RH）下紙漿纖維橫向的硬度和模量。除此之外，還研究了以纖維素、木聚糖/纖維素為模型的膜，分別在水中和CaCl2溶液中的溶脹和硬度的變化情況。紙漿纖維的硬度隨著RH的增大逐漸降低，相比于干燥狀態(tài)，在濕潤時纖維的硬度降低了100倍，這可能是由于在纖維表面形成氫鍵的緣故。而作為模型研究的纖維素膜的變化情況則表明相比于水溶液，CaCl2溶液會使純的纖維素膜會變硬，而表面含木聚糖的纖維素膜則會變軟。這是由于當(dāng)半纖維素膜浸入到鹽溶液中時，Ca2+離子會吸附在羧基上，增加整張膜的鹽濃度，最終會導(dǎo)致其溶脹增強，膜變軟，硬度降低。通過使用AFM對纖維素模型膜的硬度和模量的研究，提供了一個研究材料硬度的新方法。如果對纖維素材料進行物理和化學(xué)改性，那么與聚合度、交聯(lián)度以及結(jié)晶度等相關(guān)的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)也可以通過AFM來獲得。

Christian Ganser等[60]用AFM和力譜研究了木聚糖覆蓋的纖維素薄膜。作者通過多參數(shù)表面等離子體共振技術(shù)（MP-SPR）在動態(tài)條件下將樺樹木聚糖沉積到了纖維素膜上。把測試用的AFM探針針尖分別用親水基-OH和憎水基CH3進行修飾，然后對復(fù)合膜進行相位成像和力學(xué)成像，從而確認和識別木聚糖在膜表面的沉積位置。從粘附力圖上可以分辨出木聚糖和纖維素的不同。但是進一步研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖和纖維素對探針粘附力的不同只和樣品表面的高低起伏有關(guān)系，和木聚糖纖維素沒有關(guān)系。即樣品表面粗糙度的增大會導(dǎo)致粘附力增大。這是因為探針針尖單純只是在比較突出的位置受到的粘附力小，在比較凹陷的位置受到的粘附力大。由于粗糙度原因?qū)е碌恼掣搅Ψ秶? nN到50 nN，而針尖和纖維素/木聚糖的粘附力是8 nN，包含在這一范圍內(nèi)。所以作者認為用如果想用探針修飾法來檢測木聚糖和纖維素粘附力的不同是不行的，結(jié)果是不可信的。

Zhang等[61]認為木質(zhì)纖維素（主要是植物細胞壁）的酶解是一個產(chǎn)生生物石油的關(guān)鍵過程，但是天然復(fù)雜的植物細胞壁阻礙了這個過程，同時也大大影響了酶靠近纖維素的表面。所以經(jīng)過預(yù)處理后的植物細胞壁外表面的結(jié)構(gòu)和分子水平的組成變化情況就不明確，因此需要在單分子層面深刻的理解認識植物細胞壁在預(yù)處理前后表面纖維素的分布情況。作者使用單分子AFM系統(tǒng)地研究了白楊、柳枝稷和玉米秸稈的原始的、經(jīng)稀酸預(yù)處理過的和經(jīng)去木質(zhì)化的細胞壁的表面結(jié)晶纖維素的變化情況。具體實驗過程如下：首先用梭狀芽孢桿菌（CBM3a）修飾AFM探針，這種探針可以通過特殊的鍵來識別結(jié)晶纖維素。圖16顯示了AFM成像原理示意圖：（a）探針修飾和識別過程的示意圖；（b）壓電TREC控制器的形貌信號和識別信號；把兩種信號分開后可以形成纖維素形貌圖和纖維素識別圖。黃色條紋：結(jié)晶纖維素形貌示意圖（Topography image）；黑色條紋：在形貌圖上識別出結(jié)晶纖維素（Recognition image）。單分子層面的細胞壁表面結(jié)構(gòu)的變化則通過暴露的結(jié)晶纖維素的識別面積（RAP）來計算。結(jié)果表明，經(jīng)過在135℃，不同酸濃度處理后，表面結(jié)晶纖維素的覆蓋率從17%～20%增大到18%～40%，而經(jīng)過去木質(zhì)化后，可以達到40%～70%。經(jīng)0.5%的稀硫酸預(yù)處理后，白楊、柳枝稷和玉米秸稈的纖維素表面覆蓋率最大可以到達23%、28%和38%。相比于白楊和柳枝稷，玉米秸稈更容易預(yù)處理。所以作者認為經(jīng)過稀酸預(yù)處理后，可以使植物細胞壁上的纖維素更容易暴露出來。

圖16 AFM成像原理示意圖[61]

Zhu等[62]建立計算模型用實驗的方法研究了纖維素表面對金屬離子（以Ag(I)為例）的吸附作用。研究選取了三種纖維素微球（天然纖維素和它的硫酸鹽、磷酸鹽衍生物），然后把硅片浸入到AgNO3溶液中，用AFM膠體探針技術(shù)研究了微球和硅片表面的作用力。圖17顯示了不同的纖維素微球?qū)FM探針針尖的修飾細節(jié)：（a）為CM粒子；（b）為SCM粒子；（c）為PCM粒子。研究表明磷酸纖維素微球（PCM）和AgNO3溶液中的硅表面的粘附力，隨著PH值的升高，大幅度提高。而硫酸纖維素微球（SCM）和硅表面的粘附力隨PH的升高略微降低。若使用天然纖維素微球（CM），則觀察到明顯的粘附力。對于PCM系統(tǒng)來說，強烈的粘附力來自于Ag(Ⅰ)和負電的硅表面的靜電吸引力，這個力趨勢和zeta電位的測量結(jié)果相一致。SEM、XPS和ATR-FTIR分析結(jié)果表明，經(jīng)吸附后，纖維素表明的Ag(Ⅰ)被還原成Ag粒子。本研究認為PCM有大量的磷酸基團，所以它吸收Ag(Ⅰ)的能力比CM和SCM都要強，并且可以把Ag(Ⅰ)被還原成Ag粒子。用DFT理論進行數(shù)學(xué)計算也確認了磷酸基團的存在，以及磷酸基團吸附銀離子導(dǎo)致波數(shù)向P-OH振動偏移。這項數(shù)學(xué)計算和IR一樣確認了修飾了磷酸基團的纖維素表面可以吸附和收集Ag(Ⅰ)。

圖17 CM、SCM和PCM粒子在粘附在AFM V型硅探針的細節(jié)圖[62]

3 AFM技術(shù)與其他技術(shù)手段聯(lián)用

很多時候單獨使用AFM并不能完全表征一個材料的性能，所以需要和其他技術(shù)手段聯(lián)用，比如耗散型石英晶體微天平、和頻振動光譜、中子反射技術(shù)及近紅外技術(shù)等等來進行綜合研究。Niklas Nordgren[63]使用一種新的XET-技術(shù)，即自上而下把端基硫醇化（SH）的木聚糖（XG）吸附在QCM-D的金基底上，得到了一種像刷子一樣的硫醇鍵和木聚糖膜。整個接枝反應(yīng)都是在QCM-D上原位進行。然后同樣也是在QCM-D上通過定量的酶解過程來研究了其生物化學(xué)反應(yīng)，再用AFM膠體探針技術(shù)直接測量了其對纖維素的粘附力。這個研究利用這些特殊的膜來固定纖維素，為開展多糖特性的研究提供了新的思路。

Terhi Saarinen[64]用QCM-D和AFM研究了漆酶和阿魏酸在木質(zhì)素基底上的吸附情況。使用了兩種不同的制樣方法：1）先經(jīng)漆酶預(yù)處理后再加入阿魏酸；2）漆酶和阿魏酸共吸附在木質(zhì)素表面上。研究使用的漆酶是分別從和兩種菌屬分離提純出來的，并用于木質(zhì)素的活化。作者同時也用了塊狀材料和熱化學(xué)熱磨機械漿作為對比實驗，研究了QCM-D的測試結(jié)果：兩種漆酶對阿魏酸的吸附不同。在木質(zhì)素表面沒有觀察到漆酶的吸附，但是漆酶的吸附卻很明顯。但是這兩種酶仍然可以活化木質(zhì)素，經(jīng)漆酶活化后的木質(zhì)素對阿魏酸的吸附程度明顯高于沒有活化的木質(zhì)素。漆酶活化后用水沖洗會從基底上洗掉一些漆酶，進而會降低后續(xù)阿魏酸的吸附。只有漆酶會使阿魏酸在木質(zhì)素上持續(xù)附著。QCM-D和AFM結(jié)果糾正了以往注重阿魏酸對化學(xué)熱磨機械漿的鍵和作用的研究，因此這種方法對研究酶對木質(zhì)素的吸附行為是很有用的。

Tuomas Hanninen等[65]用TEMPO快速氧化纖維素，制備出可以高效利用的納米纖維狀的纖維素（NFC）材料。這個研究中利用TEMPO制備出氧化的纖維素膜，并用QCM-D來監(jiān)測分析膜性質(zhì)的變化情況。結(jié)果表明，pH值會影響氧化時間；無定型纖維素由于其表面更容易接觸，因此氧化更快速，而NFC則更穩(wěn)定，氧化速度較慢，AFM測試證明了這一點。圖18為經(jīng)TEMPO氧化過的纖維素材料的AFM形貌圖： （a）為納米纖維狀纖維素；（b）為無定型纖維素。本研究為纖維素材料功能化提供了一種更加可控的手段，可以在不對纖維素材料造成永久改變的基礎(chǔ)上，制備出理想的羧化纖維素。

圖18 TEMPO氧化過的纖維素材料的AFM形貌圖[65]

植物細胞壁上的纖維素微纖維會隨著細胞的膨脹和增長而變化。Kabindra Kafle[66]利用和頻振動光譜（SFG）和AFM研究了洋蔥表皮上纖維素微纖維的取向情況。AFM圖像顯示表皮軸外的纖維素微纖維是垂直于球莖軸取向的，并且越里面的洋蔥表皮上的纖維素分布越分散。纖維素的晶體結(jié)構(gòu)上有偏心對稱的功能團，因此它的二階非線性磁化系數(shù)不為零并產(chǎn)生了SFG信號。

Bruno Jean等[67]把纖維素納米棒和彈性聚烯丙胺鹽酸鹽通過層層自組裝技術(shù)制備出兩種物質(zhì)交替分布的多層薄膜，并用AFM與中子反射技術(shù)聯(lián)用對其表征。兩種技術(shù)手段都顯示這種光滑的膜的纖維素含量較高，具有良好的分布，并且隨著膜層數(shù)的增多，厚度線性增加，但是表面粗糙度卻逐漸降低。這種含有纖維素的，且具有良好排布規(guī)律的膜，可能應(yīng)用于模擬像木材等或活的有機體中纖維素微纖維的排布特性。除此之外，近年還有發(fā)展較為快速基于近紅外技術(shù)和原子力顯微鏡相融合的AFM-IR，該技術(shù)可以實現(xiàn)纖維素納米形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息的同時成像[68]。還有學(xué)者把AFM和亞穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)電子能譜（MIES）、紫外光電子能譜（UPS）和X-射線光電子能譜（XPS）技術(shù)相連用，研究了纖維素對銀的吸附作用，并且認為纖維素可以作為穩(wěn)定的銀納米粒子涂層使用[69]。

4 結(jié)論

本文系統(tǒng)地討論了近20年來原子力顯微鏡AFM在纖維素及其衍生物材料的應(yīng)用，從早期對纖維素的晶體結(jié)構(gòu)的研究，確認了結(jié)晶纖維素的兩個異構(gòu)體三斜Iα和單斜Iβ相以及纖維素鏈的基本結(jié)構(gòu)是重復(fù)間距為1.1 nm的纖維素二糖。對于纖維素微觀形貌的研究則確認了植物的細胞壁的結(jié)構(gòu)特征，木質(zhì)素和纖維素的分布情況，甚至還研究了細菌纖維素的形貌特征以及纖維素酶解過程和材料結(jié)構(gòu)間的構(gòu)效關(guān)系。而利用高速AFM，可以詳細探究不同的纖維素酶對纖維素結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的具體分解情況，深入揭示了各種酶的分解順序及它們之間的合作關(guān)系，并且還觀察到了纖維素酶在材料表面的聚集堵塞情況。對于纖維素衍生物的研究多集中在纖維素改性或者復(fù)合材料上，利用AFM研究了不同的改性和復(fù)合策略對最終材料性質(zhì)的影響，比如吸附效果、過濾分離效果、選擇透過性和導(dǎo)電性等?；谔结樅蜆悠分g相互作用力來成像這一AFM基本測試原理，AFM力學(xué)技術(shù)及探針修飾技術(shù)是近年來發(fā)展較為迅速的測試手段?；谄淞W(xué)技術(shù)，AFM力學(xué)模式能在獲得樣品形貌的同時獲得材料的定量納米力學(xué)性質(zhì)，包含模量、硬度、粘附力和形變量等數(shù)據(jù)，以對材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行更加準確和深入的表征。不僅如此，利用AFM和其他技術(shù)手段聯(lián)用，比如耗散型石英晶體微天平、頻振動光譜、中子反射技術(shù)及近紅外技術(shù)等等也可對材料進行綜合研究。而后續(xù)AFM在纖維素領(lǐng)域的應(yīng)用將集中在AFM高級成像技術(shù)，比如基于AFM力學(xué)模式的定量納米機械力測量、開爾文電勢顯微鏡等方面為材料的機械性能、電性能等提供新的表征方法。

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Application of Atomic Force Microscope in Cellulose Research

GUO Yuan-long1, GUO Gu1, CHEN Zi-xiang1,ZHANG Li-hua1, XIE Hai-bo1*, ZHENG Qiang2

（1. College of Materials and Metallurgy, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China）

This paper reviews the principle of atomic force microscopy (AFM) and its application progress in cellulose research which is focusing on the crystal structure, microscopic morphology, enzymatic hydrolysis process and derivatives of cellulose. The importance of AFM to the above research content is revealed, and specific implementation cases and operation methods of different AFM applications are given.Not only that, a general summary of new test methods such as AFM quantitative nanomechanical force testing, probe modification technology and combination with other technical methods are shown.Finally, the development prospect of AFM advanced imaging technology in cellulose research is prospected, and new methods are provided for the research of cellulose-based new materials, which has important reference value.

atomic force microscope; probe modification; quantitative nanomechanical force testing; cellulose; cellulose derivative

TB324

A

1004-8405(2022)02-0045-19

10.16561/j.cnki.xws.2022.02.03

2022-03-22

貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才[2019]5607）；貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才[2016]5652）；國家自然科學(xué)基金（22065007）。

郭元龍（1989～），女，博士研究生；研究方向：天然高分子衍生新材料。

通訊作者：謝海波（1978～），男，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：生物基合成高分子；天然高分子衍生新材料。hbxie@gzu.edu.cn