傘枝犁頭霉純菌與強化發(fā)酵普洱茶研究

劉琨毅，王利妍，安江珊，王興華，5，羅慧，陳立佼，馬燕*，趙明，2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點實驗室，西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230036；5.普洱市茶葉科學(xué)研究所，云南 普洱 665000）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品（fermented foods）是一類依靠微生物的作用將原料中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解與轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物的一類食品。該類食品有制作成本低、風(fēng)味獨特及具有較高的營養(yǎng)價值等優(yōu)點，在世界范圍分布廣泛[1-2]。發(fā)酵工藝已有上千年的歷史，有保藏食品、豐富食品種類和有益于身體健康的作用[3]。但在傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過程中往往存在微生物來源復(fù)雜、不可控等問題，從而導(dǎo)致其質(zhì)量不穩(wěn)定[4-5]。因此，亟需對傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵工藝進(jìn)行改進(jìn)。強化發(fā)酵是將一種或多種外源微生物接入到未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵，以期提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的方法[6]。例如，乳酸菌和酵母菌強化發(fā)酵四川泡菜可以明顯提高總酸、總酯含量，從而改善產(chǎn)品風(fēng)味[7]；接種黑曲霉發(fā)酵普洱茶可改善其感官品質(zhì)[8]。因而，強化發(fā)酵可作為一種改進(jìn)發(fā)酵食品工藝的方法。

普洱茶是我國特有的名茶[9]，具有抗高脂血癥、抗氧化、抗腫瘤和預(yù)防糖尿病等多種保健功能[10-11]。其發(fā)酵過程主要依靠適宜在茶葉原料中生長繁殖的微生物[12-13]，在發(fā)酵過程中微生物會產(chǎn)生多種酶類，這些酶類對普洱茶的品質(zhì)有一定的影響[14]。由于普洱茶生產(chǎn)過程處于開放的環(huán)境中，其會存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象[15]。國內(nèi)已有關(guān)于接菌強化發(fā)酵普洱茶的研究，研究表明，強化發(fā)酵可縮短加工時間、降低成本、提高茶葉感官品質(zhì)[16-17]。綜上，強化發(fā)酵是提高普洱茶品質(zhì)的有效途徑之一，但適宜普洱茶強化發(fā)酵的微生物還需要進(jìn)一步研究。

傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）是一種能產(chǎn)淀粉酶和酯化酶的真菌，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如食醋[18]、白酒[19]、普洱茶[20]的生產(chǎn)過程中均有一定應(yīng)用。其在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生α-酮戊二酸，由此參與糖類、蛋白質(zhì)的代謝[21]。作為一種在普洱茶發(fā)酵中存在的微生物，傘枝犁頭霉進(jìn)行的普洱茶強化發(fā)酵是否能夠影響發(fā)酵過程中的微生物群落，進(jìn)而改善普洱茶的品質(zhì)特征，需要進(jìn)一步研究。本文將從普洱茶中分離鑒定得到的傘枝犁頭霉A1接種于滅菌或未滅菌的曬青茶中，對普洱茶進(jìn)行純菌發(fā)酵和強化發(fā)酵，分析發(fā)酵樣品的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)，以期評估該菌用于普洱茶強化接菌發(fā)酵的可行性，為提高普洱茶品質(zhì)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青茶（一芽三葉）原料（raw material，RM）：云南省普洱市茶葉科學(xué)研究所；兒茶素[（+）-catechin，C]、沒食子酸（gallic acid，GA）、表兒茶素[（-）-epicatechin，EC]、表沒食子兒茶素[（-）-epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[（-）-epicatechin-3-gallate，ECG]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、沒食子兒茶素[（-）-gallocatechin，GC]、兒茶素沒食子酸酯[（-）-catechin gallate，CG]、沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-gallocatechin gallate，GCG]、鞣花酸（ellagic acid，EA）、咖啡堿（caffeine，CA）、楊梅素（myricetin，MY）、槲皮素（quercetin，QU）、木犀草素（luteolin，LU）、山奈酚（kaempferol，KA）標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒：上海生物工程有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）：南京諾唯贊生物科技公司；DNA Ladder Marker（DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)試劑）、5×Loading Buffer for Agarose gels（DNA染料）：上海捷瑞生物工程公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；茚三酮、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DNA引物：北京擎科生物科技有限公司昆明分公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠；756CRT型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；CP214型電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；CT15RE型離心機：日本日立公司；SW-CJ-1B型超級工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRHS-250-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；1200型高速液相色譜：配有TSKgel ODS-80TM色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫公司；Trident 960型基因擴增儀：上海力新儀器有限公司；DW-86L626型醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；YS6060型色差儀：深圳市三恩時科技有限公司；XB.K.25型血球計數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定

對從普洱茶中分離純化得到的菌株A1進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列進(jìn)行DNA測序分析[22]，并利用ITS的DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，明確菌株A1的系統(tǒng)分類學(xué)地位。

1.3.2 傘枝犁頭霉A1菌懸液的制備

將傘枝犁頭霉A1，接種于PDA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d。用無菌生理鹽水沖洗收集其孢子并計數(shù)后，將1%的1×107的孢子接種到茶葉培養(yǎng)基中，25℃振蕩培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)速120 r/min。其中，茶葉培養(yǎng)基是用蒸餾水（2 L）在 100℃條件下提取曬青茶（100 g）30 min，四層紗布過濾，然后121℃滅菌20 min制成。

1.3.3 傘枝犁頭霉A1純菌發(fā)酵（pure fermentation，PF）普洱茶試驗

稱取100 g曬青茶置于500 mL三角瓶中，加入40 mL蒸餾水，濕熱滅菌（121℃，20 min），冷卻后待用。分別將1 mL1×107的傘枝犁頭霉A1的孢子的菌懸液接種于滅菌茶樣中，28℃、相對濕度60%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵20 d后取出，-80°C貯藏待用，樣品命名為PF；將滅菌茶樣不接菌進(jìn)行相同操作為對照樣品（control check，CK）。每組樣品進(jìn)行3個重復(fù)。

1.3.4 傘枝犁頭霉A1強化發(fā)酵（enhanced fermentation，EF）普洱茶試驗

強化發(fā)酵普洱茶試驗：在25 kg曬青茶中加入10 L蒸餾水，再加入250 mL傘枝犁頭霉A1的菌懸液拌和混勻后裝入發(fā)酵筐（50 cm×40 cm×60 cm），進(jìn)行靜置發(fā)酵；每隔5 d將茶葉取出翻堆一次后再裝入發(fā)酵筐，25 d后發(fā)酵完成。在每次翻堆前，采用五點取樣法取樣，-80°C貯藏待用，其中每一翻樣品命名為EF1～EF5；將每一翻自然發(fā)酵（normal fermentation，NF）的樣品（未接入傘枝犁頭霉A1）命名為NF1～5。每組樣品進(jìn)行3個重復(fù)。

1.3.5 茶葉化學(xué)成分測定及感官審評

參考Zhao等[12]分析茶葉特征成分的方法，分別采用恒重法、酒石酸亞鐵法、茚三酮比色法、蒽酮法測定茶葉樣品水浸出物（water extracts，WE）、茶多酚總量（tea polyphenols，TP）、游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）、可溶性糖（soluble sugars，SS）的含量；應(yīng)用萃取比色法[23]檢測茶紅素（thearubigins，TR）、茶黃素（theaflavins，TF）及茶褐素（theabrownins，TB）含量；采用實驗課題組建立的高效液相色譜法[13]（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析茶葉樣品 中 GA、CA、EA、QU、LU、KA、MY、C、EC、EGC、ECG、EGCG、GC、GCG和CG的含量。9位評茶員根據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[24]對茶葉樣品的感官品質(zhì)進(jìn)行審評；其中，采用定量描述分析法[25]對茶湯滋味特征進(jìn)行評價，包括苦味、澀味、酸味、甜味和厚重感5個屬性，分?jǐn)?shù)從0（無）到9（非常強烈）。同時用色差儀對茶湯的顏色進(jìn)行測定，其中a*為紅綠色，b*為黃藍(lán)色，L*為明暗度。

1.3.6 基于高通量測序進(jìn)行微生物多樣性分析

采用真菌DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒分別提取接種發(fā)酵普洱茶樣品的真菌和細(xì)菌DNA，應(yīng)用 DNA 聚合酶（2×Rapid Taq Master Mix）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。其中，利用引物338F和806R擴增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)；以引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴增真菌ITS1的V2區(qū)。委托深圳微生態(tài)公司，應(yīng)用Illumina MiSeq測序平臺對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序[15]。通過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列，選擇序列比對工具對獲得的序列按97%的相似度進(jìn)行聚類和OTU劃分，繪制稀疏曲線，計算Alpha多樣性指數(shù)，評估每個樣本的多樣性水平[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM spss statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SIMCA14.1軟件進(jìn)行主成分分析；基因測序結(jié)果已上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因數(shù)據(jù)庫，編號為 MZ570265 和PRJNA691718。

2 結(jié)果與分析

2.1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定

將菌株A1接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，將菌株A1測序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選擇模式物種進(jìn)行建樹，傘枝犁頭霉A1的分離鑒定結(jié)果如圖1所示。

圖1 傘枝犁頭霉A1的分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of Absidia corymbifera A1

結(jié)果表明，菌株A1菌絲呈毛狀、無匍匐菌絲，菌絲無隔膜、頂端膨大形成圓形的孢子囊（圖1A和圖1B）；A1與AY944895.1-A.corymbifera聚為一支（圖1C），故將A1命名為傘枝犁頭霉A1（A.corymbifera A1）。

2.2 傘枝犁頭霉A1純菌發(fā)酵對茶葉品質(zhì)的影響

對傘枝犁頭霉A1純菌發(fā)酵普洱茶樣品與對照樣品（CK）進(jìn)行感官審評，PF的茶湯呈橙紅色、滋味醇厚，CK的茶湯為黃綠色、澀味較為突出。表明傘枝犁頭霉A1純菌發(fā)酵能改變曬青茶的感官特征，并與傳統(tǒng)普洱茶的感官品質(zhì)（茶湯呈紅褐色、滋味醇厚回甘）相似[27]。采用高效液相色譜法和分光光度法測定22種茶葉特征成分的含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同茶葉樣品中22種茶葉特征成分Fig.2 22 tea characteristic components in different tea samples

由圖2可知，與CK相比，PF中茶多酚（TP）和5種兒茶素（C、EGC、EGCG、ECG、CG）含量顯著降低（P＜0.05），因此PF茶湯苦澀度降低；而因茶褐素（TB）和茶紅素（TR）含量顯著增加（P＜0.05），使得茶湯由黃綠色變?yōu)榧t褐色。這些茶葉特征成分的變化也與傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化相似[28]，故傘枝犁頭霉A1對普洱茶的發(fā)酵起到積極作用。

2.3 傘枝犁頭霉A1強化發(fā)酵對茶葉品質(zhì)的影響

對自然發(fā)酵及強化發(fā)酵樣品進(jìn)行感官審評，結(jié)果見表1和圖3。

表1 NF與EF感官審評結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of normal fermentation（NF）and enhanced fermentation（EF）

圖3 NF和EF干茶、茶湯、茶底的感官特征Fig.3 Sensory characteristics of dry tea，tea infusion and wet tea leaf in normal fermentation（NF）and enhanced fermentation（EF）

由表1和圖3可知，經(jīng)NF和EF處理后，茶湯均呈紅褐色、滋味回甘、香氣純正，但EF茶湯顏色更深、滋味更加醇厚、香氣略帶怡人的陳香。經(jīng)色差儀測定兩者茶湯顏色時，發(fā)現(xiàn)EF的a*值（27.55±0.44）和b*值（77.59±1.12）較高，而 L*值（67.53±0.98）較低。9位評茶員審評茶湯后得出，EF的甜味（4.78±0.83）和厚重感（6.89±0.93）分值較高，而苦味（3.67±0.78）、澀味（1.11±0.50）和酸味（0.22±0.44）分值較低，進(jìn)一步說明了EF具有更深的紅褐色和更好的風(fēng)味。

由茶葉特征成分含量可知，EF中TB和SS含量顯著高于NF（P＜0.05），與感官審評EF具有更深的紅褐色和更顯著的甜味的結(jié)果相符；而C、CG、EC、GCG、EGCG、ECG 和 EGC 含量顯著低于 NF（P＜0.05），驗證了EF的苦澀度較NF更低。因此，傘枝犁頭霉A1強化發(fā)酵提高了普洱茶的感官品質(zhì)。

2.4 傘枝犁頭霉A1強化發(fā)酵對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

NF和EF的茶葉樣品微生物群落的豐富度與α多樣性指數(shù)，如表2所示。

表2 茶葉樣品微生物群落的豐富度與α多樣性指數(shù)Table 2 Richness of microbial communities and alpha diversity indices in tea samples

由表2可知，經(jīng)過QIIME軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列后，得到54 330～103 310個序列，歸類為503個～833個真菌OTUs、482個～1978個細(xì)菌OTUs。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，EF中真菌及細(xì)菌的豐富度和多樣性增加，但在發(fā)酵后期（EF4～EF5）均有所下降，與NF細(xì)菌的豐富度和多樣性在發(fā)酵后期（NF4～NF5）整體上呈繼續(xù)上升趨勢形成差異。

茶葉樣品中真菌種水平和細(xì)菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 茶葉樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structure in tea samples

由圖4可知，在發(fā)酵過程中EF和NF的微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，且在各個階段差異顯著（圖4A和圖4B）。主要原因是發(fā)酵過程中化學(xué)成分的不斷變化以及微生物之間的相互作用（如共生和拮抗作用）[29]。如圖4C所示，在原料（RM）中優(yōu)勢真菌為Brunneoclavispora bambusae（41.50%），黑曲霉（21.18%）和馬克斯克魯維酵母（17.27%）。在強化發(fā)酵樣品中，B.bambusae（31.98%）是發(fā)酵初期（EF1）的優(yōu)勢真菌，隨著發(fā)酵進(jìn)行，微小根毛霉（38.76%～70.60%）迅速生長繁殖，在發(fā)酵中期（EF2～EF3）成為優(yōu)勢真菌，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（40.13%）在發(fā)酵后期（EF5）成為優(yōu)勢真菌；另外黑曲霉（6.38%～13.93%）在整個發(fā)酵階段均為優(yōu)勢真菌（圖4C）。作為對比，在傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中黑曲霉始終是優(yōu)勢真菌（26.64%～37.40%），此外在發(fā)酵初期（NF1）的優(yōu)勢真菌還包括馬克斯克魯維酵母（31.28%），隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微小根毛霉（37.48%～61.22%）迅速繁殖，與黑曲霉共同組成發(fā)酵中后期（NF2～NF5）的優(yōu)勢真菌。雖然在發(fā)酵初期將傘枝犁頭霉A1接種到未經(jīng)滅菌的曬青茶中進(jìn)行強化發(fā)酵，但是整個發(fā)酵過程處于開放狀態(tài)，環(huán)境中的微生物也會進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)。因此，一些適合在茶葉上生長的微生物會在這種發(fā)酵體系中生長并大量繁殖。

如圖4D所示，RM的優(yōu)勢細(xì)菌主要是腸桿菌（20.94%）、金黃桿菌（16.65%）和假單胞菌（6.90%）。在強化發(fā)酵過程中，假單胞菌（16.42%～61.70%）、擬桿菌（9.66%～19.42%）和芽孢桿菌（8.54%～20.65%）是發(fā)酵中前期（EF1～EF2）的優(yōu)勢細(xì)菌，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，短狀桿菌（14.27%～19.90%）、考克氏菌（13.02%～24.04%）和葡萄球菌（33.97%～48.71%）共同成為發(fā)酵中后期（EF3～EF5）的優(yōu)勢細(xì)菌（圖4D）。在傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期（NF1）的優(yōu)勢細(xì)菌主要是大腸埃希-志賀菌（32.41%）、克雷白氏菌（27.41%）和假單胞菌（24.54%）；芽孢桿菌（37.07%）在發(fā)酵中期（EF3）成為優(yōu)勢細(xì)菌；而在發(fā)酵后期（EF5），大腸埃希-志賀菌（16.46%）再次成為優(yōu)勢細(xì)菌。

綜上，盡管在強化發(fā)酵過程中傘枝犁頭霉A1沒有成為優(yōu)勢真菌，但相對于NF顯著改變了其它微生物的相對豐度，例如增加了B.bambusae、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、微小根毛霉、葡萄球菌、假單胞菌和芽孢桿菌的相對豐度，降低了黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、大腸埃希-志賀菌和克雷白氏菌的相對豐度。微生物相對豐度的這些變化解釋了強化發(fā)酵樣品的茶葉特征成分和感官特征的變化。

3 結(jié)論

將傘枝犁頭霉A1接種于滅菌或未經(jīng)滅菌的曬青茶中，分別進(jìn)行純菌發(fā)酵與強化發(fā)酵。經(jīng)純菌發(fā)酵后茶葉中茶多酚和 5 種兒茶素（C、EGC、EGCG、ECG、CG）含量顯著降低（P＜0.05），茶褐素和茶紅素含量顯著增加（P＜0.05）。經(jīng)強化發(fā)酵后茶褐素和可溶性糖含量顯著高于傳統(tǒng)自然發(fā)酵（P＜0.05），而 C、CG、EC、GCG、EGCG、ECG 和 EGC 含量顯著降低（P＜0.05）；茶湯的感官特征隨之發(fā)生變化，例如，a*、b*、甜味和厚重感的數(shù)值增加，L*、苦味、澀味和酸味數(shù)值降低。雖然傘枝犁頭霉A1在強化發(fā)酵過程中沒有成為優(yōu)勢真菌，但其促使了其他幾種主要微生物相對豐度的顯著變化，如增加了B.bambusae、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、微小根毛霉、葡萄球菌、假單胞菌和芽孢桿菌的相對豐度，降低了黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、大腸埃希-志賀菌和克雷白氏菌的相對豐度。因此，接種傘枝犁頭霉A1進(jìn)行的強化發(fā)酵通過與其它微生物的協(xié)同作用改變普洱茶中茶葉的特征成分，從而提高普洱茶的感官品質(zhì)。