過表達(dá)TBX2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響

劉小江 管 誠(chéng) 李 軍 管義祥

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，病死率呈逐年增加趨勢(shì)[1，2]。盡管在過去的幾十年中，膠質(zhì)瘤的診治取得了重大進(jìn)展，但其臨床結(jié)局仍然不理想，中位生存期約為14個(gè)月[3]。目前，膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)輔助替莫唑胺治療和放療[4]，但是5年總生存率不超過35%[5]。因此，研究者開始逐步開發(fā)分子靶向療法、免疫療法、基因療法和新型藥物遞送技術(shù)。相比于其他腫瘤，目前仍缺乏對(duì)膠質(zhì)瘤診療的有效分子靶標(biāo)[6，7]。因此，探討膠質(zhì)瘤腫瘤診斷和治療的分子靶標(biāo)和其分子機(jī)制具有重要意義。

TBX2 是保守化轉(zhuǎn)錄因子T-box 家族的成員之一[8，9]。研究發(fā)現(xiàn)TBX2在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，在腫瘤演變的過程中發(fā)揮作用[10～13]。本文探討TBX2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，及其過表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，從而為膠質(zhì)瘤的診治、預(yù)后評(píng)估等提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源 收集2017 年7 月～2019 年6 月手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的膠質(zhì)瘤樣本以及對(duì)應(yīng)的瘤旁組織（術(shù)前靜脈注射熒光素鈉，術(shù)中使用熒光顯微鏡觀察腫瘤的顏色跟質(zhì)地以判斷腫瘤的邊界，距腫瘤組織1 cm 以上認(rèn)為是瘤旁組織）各53 例，其中男30 例，女23 例；年齡35～71 歲。WHO 分1～2 級(jí)24例，3～4 級(jí)29 例。所有病人術(shù)前均未行放療或化療。本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87、SHG-44（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）使用含10%胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司）的DMEM（美國(guó)Invitrogen 公司）培養(yǎng)，人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800；中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）使用RPMI 1640（美國(guó)Invitrogen 公司）培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建過表達(dá)TBX2（TBX2-OE）及干擾TBX2（TBX2-sh）質(zhì)粒，分別用空載體（negative control，NC）-OE 和NC-sh 作為對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，用LipofectamineTM 2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)mRAN 使用Trizol 試劑（上海通蔚生物有限公司）提取組織以及細(xì)胞總mRNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（上海雙贏生物科技有限公司）將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green 熒光試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）擴(kuò)增目的基因，采用2-ΔΔCt法量化，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列：TBX2 正義鏈5′-CACTCGCTTGACCGAACCC-3′，反義鏈5′-CGCACTGTCTGTCTGCACCA- 3′；GAPDH 正 義 鏈5′- CTGCCCAGAACATCATCCCT-3′，反 義 鏈5′-TGAAGTCGCAGGAGACAACC-3′。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌組織及細(xì)胞3 次，用RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 g 離心20 min 留取上層蛋白清液。使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。使用封閉液室溫封閉1 h。4 ℃條件下與一抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）孵育過夜，用TBST洗滌PVDF膜3次，加入對(duì)應(yīng)二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）在室溫下孵育1 h。使用ECL發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）顯像。β-actin用作內(nèi)參，用Image J測(cè)定蛋白條帶灰度。

1.6 細(xì)胞增殖的測(cè)定及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，根據(jù)試劑盒說明，0、24、48、72、96和120 h進(jìn)行WST-1分析（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。棄除培養(yǎng)基后使用PBS 沖洗細(xì)胞3 次，向各孔中加入含10 μL WST-1 及90 μl 正常培養(yǎng)基溶液的混合培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 細(xì)胞侵襲的測(cè)定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于涂有基質(zhì)膠的Transwell 聚碳酸酯濾膜上，加入200 μl無血清的培養(yǎng)基；下層小室加入含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在室溫下，依次用3.7%甲醛固定細(xì)胞15 min，用含有0.1%結(jié)晶紫10%乙醇溶液染色30 min。除去多余染液，在光學(xué)顯微鏡下觀察，400 倍視野下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件分析；定量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織TBX2 表達(dá)變化 相比于瘤旁組織，膠質(zhì)瘤組織TBX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05）；并且，高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織TBX2 mRNA和蛋白水平均顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（P＜0.05）。見圖1。

圖1 膠質(zhì)瘤組織TBX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TBX2的表達(dá)變化 相比于人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87、SHG-44細(xì)胞TBX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05）。此外，U251 細(xì)胞TBX2 表達(dá)水平顯著高于U87 和SHG-44 細(xì)胞（P＜0.05），因此使用U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的有效性驗(yàn)證 相比于NC-OE組，TBX2-OE 組U251 細(xì)胞TBX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）。與NC-sh組比較，TBX2-sh組U251細(xì)胞TBX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TBX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.4 TBX2 表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖及侵襲的關(guān)系 過表達(dá)TBX2 顯著增加U251 細(xì)胞增殖和侵襲能力（P＜0.05）；低表達(dá)TBX2 顯著抑制U251 細(xì)胞增殖和侵襲能力（P＜0.05）。見圖3

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的有效性驗(yàn)證

3 討論

圖4 TBX2表達(dá)與膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)系

本文結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織TBX2 的表達(dá)水平顯著增加，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤。這提示TBX2可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Pan 等[14]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TBX2表達(dá)上調(diào)，明顯降低E-鈣粘蛋白的表達(dá)、增加波形蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力。本文結(jié)果顯示TBX2 過表達(dá)明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲。目前，TBX2發(fā)揮促腫瘤作用的信號(hào)通路尚不清楚。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)TBX2可通過ERK信號(hào)通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力。另外，TGFβ1信號(hào)通路可能與TBX2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)[16]。

總之，膠質(zhì)瘤TBX2 表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)TBX2 可顯著增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力。