江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因克隆和表達(dá)分析

洪森榮 鄧雨晴 張玲 張妮 張?chǎng)R 張新語(yǔ) 趙若雅 鄭潘鴦 鄭紫娟 周融冰

摘要：對(duì)江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，以期為解析江西鉛山紅芽芋的抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為江西鉛山紅芽芋的遺傳改良提供候選基因。通過(guò)江西鉛山紅芽芋試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的核心片段，利用RT-PCR技術(shù)克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行序列分析和器官表達(dá)分析。結(jié)果表明，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因cDNA總長(zhǎng)度為264 bp，G+C含量為46.59%;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個(gè)氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點(diǎn)為6.42，為親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（23.68%）、β-片層（14.77%）、無(wú)規(guī)則卷曲（61.36%）構(gòu)成;三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白主要存在于葉綠體和細(xì)胞核中;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進(jìn)化上與芋（Colocasia esculenta）的親緣關(guān)系較近，尤其是與芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，抗病蛋白基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)存在器官特異性，在葉片和球莖膨大初期的表達(dá)量最高。綜合分析可知，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白具有典型的抗病蛋白結(jié)構(gòu)，在進(jìn)化上高度保守。

關(guān)鍵詞：江西鉛山紅芽芋;抗病蛋白;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S632.301? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0021-06

江西鉛山紅芽芋（Colocasia esculenta L. Schoot var. cormosus‘Hongyayu）是江西省知名名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品和國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品[1]，屬天南星科本草植物，藥食兼優(yōu)[2-3]。自然界的各種微生物會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成一定的威脅，在與病原菌的長(zhǎng)期共進(jìn)化過(guò)程中，植物為免受病原微生物侵害形成了一套保護(hù)自身的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制[4]。病原微生物分泌的效應(yīng)蛋白可被抗病蛋白特異識(shí)別，從而觸發(fā)免疫響應(yīng)，產(chǎn)生或激活能夠特異識(shí)別效應(yīng)因子的抗性蛋白，從而減少病原微生物對(duì)植物的侵?jǐn)_[5]。抗病蛋白可分為跨膜受體蛋白、蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、毒素還原酶、核苷酸結(jié)合富含亮氨酸重復(fù)序列（nucleotide binding-leucine rich repeat，NB-LRR）抗病蛋白等5種;目前克隆到的抗病蛋白編碼基因大多屬于NB-LRR類，同屬于NB-LRR類抗病蛋白對(duì)應(yīng)的編碼基因還有TNL（TIR-NB-LRR）和CNL（CC-NB-LRR）2類[6]。因此，克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白編碼基因并檢測(cè)其組織表達(dá)特異性，對(duì)了解江西鉛山紅芽芋抗病品種選育具有重要意義。目前關(guān)于抗病蛋白（disease resistance protein）編碼基因的研究尚少見(jiàn)。Pit是一種對(duì)稻瘟病具有抗性的NLR蛋白，水稻GTPase OsRac1直接與Pit相互作用，Pit的活性形式誘導(dǎo)了質(zhì)膜上OsRac1的激活，OsRac1參與了Pit介導(dǎo)的活性氧（ROS）產(chǎn)生和過(guò)敏反應(yīng)（HR）過(guò)程，是水稻Pit介導(dǎo)的抗病性所必需的[7]。煙草花葉病毒抗性N基因是煙草花葉病毒復(fù)制酶中識(shí)別解旋酶結(jié)構(gòu)域的Toll白細(xì)胞介素受體（TIR）-NBS-LRR類植物抗病基因的成員，N蛋白在誘導(dǎo)子的作用下發(fā)生寡聚，但P-環(huán)基序突變可消除寡聚作用。RNBS-A基序和TIR結(jié)構(gòu)域的功能缺失突變保留了寡聚的能力，寡聚是N介導(dǎo)抗煙草花葉病毒（TMV）的一個(gè)早期事件[8]。植物免疫系統(tǒng)對(duì)病原菌的識(shí)別受抗病基因結(jié)構(gòu)相關(guān)的多態(tài)產(chǎn)物控制。RAR1和/或SGT1b介導(dǎo)許多R蛋白的功能，RAR1通過(guò)一種未知的機(jī)制控制前激活R蛋白的積累;擬南芥SGT1b在植物免疫系統(tǒng)中具有2種不同的、在遺傳上可分離的功能：SGT1b拮抗RAR1，在感染前負(fù)調(diào)控R蛋白的積累;SGT1b具有RAR1獨(dú)立的功能，在感染過(guò)程中能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性死亡;RAR1和SGT1的平衡活性與胞漿HSP90共同調(diào)節(jié)活化前R蛋白的積累和信號(hào)傳導(dǎo)能力[9]。擬南芥NPR1蛋白是調(diào)節(jié)水楊酸依賴性基因表達(dá)的關(guān)鍵蛋白，NPR1與基本結(jié)構(gòu)域/亮氨酸（Leu）拉鏈轉(zhuǎn)錄因子TGACG基序結(jié)合因子（TGA）類成員有差異的相互作用，并調(diào)節(jié)其DNA的結(jié)合活性。TGA1基因中Cys-260和 Cys-266 的定點(diǎn)突變使其能與酵母、擬南芥中的NPR1相互作用，TGA1依賴于Cys殘基的氧化狀態(tài)來(lái)介導(dǎo)與NPR1的相互作用。TGA1的分子內(nèi)二硫鍵包括與NPR1的相互作用，NPR1只能刺激TGA1還原態(tài)的DNA結(jié)合活性。與動(dòng)物、酵母不同，TGA1的DNA結(jié)合活性不受氧化還原作用調(diào)節(jié)[10]。目前，對(duì)紅芽芋的研究主要集中在脫毒快繁[1]、微芋誘導(dǎo)[2]、下游加工[3]、成分分析[11]等方面，關(guān)于紅芽芋抗病蛋白方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因，并用生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行序列分析和組織表達(dá)分析，為揭示江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平選育江西鉛山紅芽芋抗病品種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

江西鉛山紅芽芋試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用TRIzol試劑提取江西鉛山紅芽芋試管苗的總RNA，提取步驟參照說(shuō)明書(shū)，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物采用Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

1.2.2 抗病蛋白基因的克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN15482_c0_g1），用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（F：5′-CGAGGATACACAGGTTCACGG-3′;R：5′-GAATTCTAACTTCTGGAGTTCTGGG-3′）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s，54.1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收，使pMD19-T載體與條帶（含有目的基因）連接，并用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（鑒定正確）中的質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 抗病蛋白基因的生物信息學(xué)分析 氨基酸序列用BioEdit軟件分析，酶的理化性質(zhì)用ProtParam預(yù)測(cè)，酶的疏/親水性用ProtScale預(yù)測(cè)。使用GOR I軟件在線預(yù)測(cè)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MOLD在線預(yù)測(cè)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用WoLF PSORT在線預(yù)測(cè)基因的表達(dá)部位。通過(guò)DNAMAN和BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.4 抗病蛋白基因的組織表達(dá)分析 分別取500 ng江西鉛山紅芽芋試管苗根、莖、葉、試管球莖（初期、中期和末期）的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR（qRT-PCR，SYBR Green Ⅰ）檢測(cè)的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)的引物序列如下：F，5′-TGTGTCTCCCTCCAGTGCTCA-3′;R，5′-TTTCTCGCCCCCCCTGTTCA-3′;目標(biāo)基因片段大小145 bp;變性溫度（T m）53.6 ℃。qRT-PCR檢測(cè)采用 20 μL 反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 10 min;95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 復(fù)性34 s，72 ℃延伸 15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔC T法計(jì)算基因表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)抗病蛋白基因組織表達(dá)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的cDNA序列

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因cDNA總長(zhǎng)度為264 bp，G+C含量為46.59%（圖1、圖2、圖3）。

2.2 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的氨基酸序列

用ProtParam預(yù)測(cè)的江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的氨基酸序列見(jiàn)圖4。江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個(gè)氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點(diǎn)為6.42，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例：丙氨酸（Ala，A）（5個(gè)，5.7%）、精氨酸（Arg，R）（7個(gè)，8.0%）、天冬氨酸（Asp，D）（3個(gè)，3.4%）、半胱氨酸（Cys，C）（4個(gè)，4.5%）、谷氨酰胺（Gln，Q）（6個(gè)，6.8%）、谷氨酸（Glu，E）（7個(gè)，8.0%）、甘氨酸（Gly，G）（6個(gè)，6.8%）、異亮氨酸（Ile，I）（4個(gè)，4.5%）、亮氨酸（Leu，L）（11個(gè)，12.5%）、賴氨酸（Lys，K）（3個(gè)，3.4%）、苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)）（8個(gè)，9.1%）、脯氨酸（Pro，P）（3個(gè)，3.4%）、絲氨酸（Ser，S）（9個(gè)，10.2%）、蘇氨酸（Thr，T）（5個(gè)，5.7%）、色氨酸（Trp，W）（1個(gè)，1.1%）、酪氨酸（Tyr，Y）（4個(gè)，4.5%）、纈氨酸（Val，V）（2個(gè)，2.3%）。帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為10個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為10個(gè)。失穩(wěn)指數(shù)（Ⅱ）計(jì)算為50.84，表明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.3 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的親疏水性分析

疏水區(qū)域用高峰值區(qū)域表示，其數(shù)值一般為正值;而親水區(qū)域用低谷區(qū)域表示，其數(shù)值一般為負(fù)值。從圖5可以看出，最大疏水值為2.00左右，說(shuō)明相應(yīng)位點(diǎn)的疏水性最強(qiáng);最大親水值為-2.5左右，說(shuō)明相應(yīng)位點(diǎn)的親水性最強(qiáng)。江西鉛山紅芽芋抗病蛋白表現(xiàn)出高度親水性，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。

2.4 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由圖6、圖7可見(jiàn)江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。GOR預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋（Hh，23.86%）、β-片層（Ee，14.77%）、無(wú)規(guī)則卷曲（Cc，61.36%）構(gòu)成。從分布位點(diǎn)上看，C端、N端主要含有α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和β-片層，且無(wú)規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個(gè)蛋白中。

2.5 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體，多由 α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.6 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的亞細(xì)胞定位

用WoLF POSRT在線軟件對(duì)江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，定位于葉綠體中的蛋白質(zhì)數(shù)量為9個(gè)，定位于細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)數(shù)量為3個(gè)，定位于線粒體中的蛋白質(zhì)數(shù)量為1個(gè)，定位于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)數(shù)量為1個(gè)，表明江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因主要存在于葉綠體和細(xì)胞核中（圖9）。

2.7 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

由構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可以看出，江西鉛山紅芽芋與芋（Colocasia esculenta）在一個(gè)大分支下，說(shuō)明江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進(jìn)化上與C. esculenta的親緣關(guān)系較近，尤其是與C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical? peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進(jìn)化上具有較高的親緣關(guān)系（圖10）。179323F0-4EAD-4CF4-A6AC-914F53E7F4B2

2.8 江西鉛山紅芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息

江西鉛山紅芽芋抗病蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息見(jiàn)圖11，其中※號(hào)區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。氨基酸同源性、保守區(qū)域及進(jìn)化關(guān)系顯示，芋抗病蛋白家族成員之間的氨基酸序列一致性較高，進(jìn)一步證實(shí)：江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進(jìn)化上與C. esculenta的親緣關(guān)系較近，尤其是與C. esculenta hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進(jìn)化上具有較高的親緣關(guān)系。

2.9 江西鉛山紅芽芋不同器官及球莖膨大不同時(shí)期抗病蛋白基因的表達(dá)分析

由圖12可以看出，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因在根、莖、葉中及在球莖膨大初期、中期、末期中均有表達(dá)，但在根、莖、葉中及球莖不同膨大期中的表達(dá)情況差異顯著，其中江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因在葉、球莖膨大初期的表達(dá)量最高。

3 結(jié)論與討論

為了應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變的環(huán)境，植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中構(gòu)建了不同層級(jí)（初級(jí)、次級(jí)）的免疫反應(yīng)。初級(jí)免疫反應(yīng)是指宿主細(xì)胞膜可以識(shí)別病原微生物的相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP），PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP triggered immunity，PTI）被激活[12-14]。次級(jí)免疫反應(yīng)是指微生物為了應(yīng)對(duì)植物的初級(jí)免疫反應(yīng)，注入一些毒性因子（即效應(yīng)因子）到植物細(xì)胞內(nèi)，抑制PAMP觸發(fā)的免疫反應(yīng);為了避免感病，植物進(jìn)化出抗病蛋白，抗病蛋白可特異性識(shí)別效應(yīng)因子，效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effectors triggered immunity，ETI）被激活[15-16]。ETI比PTI更強(qiáng)烈和迅速，引起植物局部的程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），導(dǎo)致植物發(fā)生超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），有效遏制病原菌進(jìn)一步擴(kuò)散[17]。本試驗(yàn)利用同源克隆技術(shù)成功克隆了江西鉛山紅芽芋的抗病蛋白基因序列，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的cDNA總長(zhǎng)度為264 bp，G+C含量為46.59%;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白由88個(gè)氨基酸組成，分子量為10 116.53 u，等電點(diǎn)為6.42，為親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（23.68%）、β-片層（14.77%）、無(wú)規(guī)則卷曲（61.36%） 構(gòu)成;三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白主要存在葉綠體和細(xì)胞核中;江西鉛山紅芽芋抗病蛋白在進(jìn)化上與芋的親緣關(guān)系較近，尤其是與芋的hypothetical peotein Taro_046555（MQM13626.1）、hypothetical peotein Taro_046554（MQM13625.1）和hypothetical peotein Taro_046553（MQM13630.1）在進(jìn)化上具有較高的親緣關(guān)系。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，抗病蛋白基因在江西鉛山紅芽芋中的表達(dá)存在器官特異性，在葉片、球莖膨大初期的表達(dá)量最高。由此可見(jiàn)，江西鉛山紅芽芋抗病蛋白基因的克隆和表達(dá)分析，可為解析江西鉛山紅芽芋的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為江西鉛山紅芽芋遺傳改良提供候選基因。

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