重組畢赤酵母表達(dá)棘孢木霉幾丁質(zhì)酶gene02524的酶學(xué)性質(zhì)及抑菌活性

尹義旭 湯偉 咸洪泉

摘要：幾丁質(zhì)酶是催化降解幾丁質(zhì)的水解酶，在防治植物真菌病害與蟲害方面的應(yīng)用越來越廣泛，是一種重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株優(yōu)良的植物病害生防菌，幾丁質(zhì)酶在抑菌防病過程中發(fā)揮重要作用。為克隆表達(dá)棘孢木霉TD3104幾丁質(zhì)酶基因gene02514，明確酶學(xué)性質(zhì)和抑菌活性，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)，并通過SephadexG-100凝膠進(jìn)行純化，對(duì)序列進(jìn)行分析并研究其酶學(xué)性質(zhì)及進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。本研究成功地構(gòu)建了pPIC9K/gene02524重組載體，并且經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)其包含GH18家族的特征氨基酸序列，獲得了畢赤酵母轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因工程菌，表達(dá)的重組幾丁質(zhì)酶表觀分子量44.4 ku，K m=2.048 2 g/L，V max=0.635 5×103 μmol/（L·min），最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適pH值為5.0，在pH值為3.5時(shí)穩(wěn)定性最高;金屬離子Cu2+、Hg2+可強(qiáng)烈抑制酶活性;可抑制金黃殼囊孢菌等病原真菌的生長。研究結(jié)果為解析棘孢木霉幾丁質(zhì)酶在生防中的作用及功能奠定了基礎(chǔ)，并為植物病蟲害的防治提供了新的基因資源。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉;幾丁質(zhì)酶;基因表達(dá);畢赤酵母;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S188+.3 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0096-07

植物真菌病害被認(rèn)為是對(duì)作物產(chǎn)量影響最嚴(yán)重的因素[1]，會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前對(duì)植物真菌病害的防治普遍采用化學(xué)防治，這不僅會(huì)污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡，而且病原菌易產(chǎn)生抗藥性[3]，也可能會(huì)影響人的健康[4]。隨著人們環(huán)保意識(shí)以及個(gè)人保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，生物防治由于其低成本、環(huán)境友好等特點(diǎn)逐漸成為防治病害時(shí)首先考慮的方法。

用于植物病害防治的生物因子主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌，目前在生防真菌中木霉菌是應(yīng)用比較廣泛的一類生防菌[5]。木霉菌對(duì)多種植物病害均有防治效果，并且對(duì)土壤生態(tài)平衡的影響最小，不會(huì)損害有助于控制病原體的有益生物體，可以提高植物抗病性，促進(jìn)養(yǎng)分吸收和肥料利用，改善發(fā)育環(huán)境并提高產(chǎn)量[1]。幾丁質(zhì)酶在木霉菌防治植物病害過程中發(fā)揮著重要作用。

幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.3.2.14）是以幾丁質(zhì)為底物，通過催化降解β-1-4-糖苷鍵將幾丁質(zhì)（chitin）降解為N-乙酰氨基葡萄糖或寡聚N-乙酰氨基葡萄糖的水解酶[6-7]，在自然界中發(fā)揮著重要的作用。植物病原真菌的細(xì)胞壁主要由葡聚糖和幾丁質(zhì)等物質(zhì)組成[8]，生防木霉菌會(huì)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶及葡聚糖酶等細(xì)胞壁降解酶[8-9]，對(duì)病原菌的細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，從而達(dá)到抑制病原真菌的效果，并且?guī)锥≠|(zhì)酶在殺蟲劑的應(yīng)用中也有良好的前景[10-11]。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到生防菌株或植物中，可以使生防菌生防效果增強(qiáng)或提高植物對(duì)病原菌的抗病性[12-13]。

棘孢木霉（Trichoderma asperellum）TD3104是一株優(yōu)良的生防菌株，全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該菌株有數(shù)十種幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的基因，其中有15個(gè)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因。由于不同的幾丁質(zhì)酶在生物中發(fā)揮著不同的作用，為了之后可以更好地了解幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)在木霉中所發(fā)揮的作用，尤其是在抑制病原菌方面的作用，本研究以內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因gene02524為研究對(duì)象，利用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)、分離純化，分析其酶學(xué)性質(zhì)，檢測(cè)其對(duì)病原真菌生長的影響，為解析幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)中不同組分在生防中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2020—2021年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

棘孢木霉TD3104、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、畢赤酵母GS115、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）、金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma）、板栗疫病病原菌（Cryphonectria parasitica）均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

本試驗(yàn)所需的Trizol、G418 antibiotic均購自Invitrogen 公司;EcoRⅠ與NotⅠ、StuⅠ均購自賽默飛世爾科技公司;pMD18-T vector、T 4連接酶、DNA Marker、RT-PCR試劑盒均購自TaKaRa公司;幾丁質(zhì)、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。各類培養(yǎng)基參照Invitrogen 公司的畢赤酵母表達(dá)說明書配制。PCR引物合成與序列測(cè)序均由北京擎科生物科技有限公司完成，全基因組測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司于2020年2月完成。

1.2 目的序列的分析及重組載體的構(gòu)建

Trizol法提總RNA之后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫，根據(jù)全基因組測(cè)序和注釋分析得到gene02524序列（圖1），根據(jù)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增gene02524幾丁質(zhì)酶CDS的特異性引物02524S：5′-CCGAATTCTCTGAGGGCGGTTATCGCT-3′;02524A：5′-GGGCGGCCGCTTAGTTATTTGGGAATCCATTCTT-3′。以cDNA文庫為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物，與T載體連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選測(cè)序得陽性克隆，提取質(zhì)粒用EcoRⅠ和 NotⅠ? 酶切，將回收后的目的片段，與酶切后的酵母表達(dá)載體pPIC9K通過T 4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接得到重組載體pPIC9K/gene02524，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。將正確的質(zhì)粒通過StuⅠ線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。酵母感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化及篩選等操作參考Invitrogen 公司的酵母表達(dá)說明書進(jìn)行。DNAMAN（https：//www.lynnon.com/dnaman.html）和WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）用來進(jìn)行氨基酸的比對(duì)。

1.3 幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化及酶活力測(cè)定參照湯偉等對(duì)幾丁質(zhì)酶Tachi1酶學(xué)性質(zhì)研究的方法[14]。具體為：將重組表達(dá)gene02524工程株在 28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每天加入甲醇誘導(dǎo)，維持甲醇終濃度為0.5%，并每天通過DNS法對(duì)酶活性進(jìn)行檢測(cè)，3組重復(fù)。待酶活性穩(wěn)定之后取菌液上清，將上清液使用硫酸銨沉淀獲得蛋白，透析除鹽后通過SephadexG-100凝膠純化。

1.4 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.4.1 幾丁質(zhì)酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定 分別在30～80 ℃溫度條件下測(cè)定表達(dá)的幾丁質(zhì)酶gene02524的活性，將最高的酶活性定為100%，分別計(jì)算其余處理組的酶活性。并將純化后的酶液分別在35、40、45 ℃ 溫度下孵育一段時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min），以最高的酶活性為100%，檢測(cè)酶活性。

1.4.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性的測(cè)定 將表達(dá)的幾丁質(zhì)酶液在不同pH值（3.0～10.0）條件下反應(yīng)并測(cè)定其酶活性，將最高的酶活性定為100%，測(cè)定其余處理的酶活力。pH值穩(wěn)定性則是將酶液置于最適溫度下于pH值為3.0～10.0體系中孵育 1 h，以最高的酶活性為100%，檢測(cè)其余處理的酶活性。不同的pH值由表1緩沖體系提供。

1.4.3 幾丁質(zhì)酶gene02524米氏常數(shù)及酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的測(cè)定 酶促進(jìn)程曲線為在最適環(huán)境中進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用DNS法每隔10 min進(jìn)行取樣并測(cè)定還原糖產(chǎn)量。將底物稀釋至終濃度分別為25、20、10、5、2.5 mg/mL，在最適條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，計(jì)算各處理的反應(yīng)速度，做出Hans-Woolf曲線，得出米氏常數(shù)K m與V max。

1.4.4 測(cè)定反應(yīng)體系中金屬離子對(duì)酶活性的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入金屬離子（Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Hg2+、Zn2+、Ag+、K+、Na+、Mg2+、NH+ 4、Ba2+），使其終濃度為0.05 mol/L，測(cè)定不同處理組的幾丁質(zhì)酶gene02524活性。將加水處理組的酶活性定義為100%，計(jì)算其余處理的相對(duì)酶活性。

1.4.5 變性劑和蛋白抑制劑對(duì)酶活性的影響 在最適條件下，分別在體系中配入供試的變性劑和蛋白抑制劑，使尿素終濃度分別為0.5、3.0 mol/L，十二烷基硫酸鈉（SDS）終濃度分別為0.1%、1.0%，乙二胺四乙酸（EDTA）與β-巰基乙醇終濃度為1、10 mmol/L，甘油、異丙醇、甲醇、乙醇的終濃度則分別設(shè)置1%和10% 2個(gè)濃度處理，將加入水的處理組的酶活性定義為100%，測(cè)定其余酶活。

1.5 幾丁質(zhì)酶gene02524對(duì)病原真菌的抑制作用

將供試真菌接種于馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，待其長滿板后取菌塊于新的PDA平板中央，當(dāng)菌落生長至3～4 cm時(shí)，在距菌落中心5 cm處放置4個(gè)無菌濾紙片，分別加入不同量（3、5、7 μg）的酶，繼續(xù)培養(yǎng)。以加滅菌水的處理為對(duì)照，參考下式計(jì)算抑菌率：

病原菌生長抑制率=（對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 pPIC9K/gene02524重組質(zhì)粒構(gòu)建及序列分析

提取幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的棘孢木霉TD3104菌絲中的總RNA（圖2-a），以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA文庫為模板，02524S和02524A為引物，擴(kuò)增得到gene02524基因編碼序列全長1 190 bp（圖2-b），經(jīng)測(cè)序和序列比對(duì)，克隆的CDS序列正確。gene02524幾丁質(zhì)酶基因含有2個(gè)內(nèi)含子，大小分別為74、66 bp，編碼397個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)表達(dá)蛋白大小44.48 ku，理論等電點(diǎn)為5.67。將氨基酸序列與GH18家族的幾丁質(zhì)酶比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其包含GH18家族特征的序列SXGG及DXXDXDXE[15]（圖3-a、圖3-b）。構(gòu)建的克隆載體和酵母重組表達(dá)載體分別命名為pMD-18T/gene02524和pPIC9K/gene02524，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符（圖2-c、圖2-d）。將pPIC9K/gene02524通過StuⅠ 線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，經(jīng)篩選得到表達(dá)重組幾丁質(zhì)酶gene02524的酵母工程菌GS115/gene02524。

2.2 幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

誘導(dǎo)表達(dá)5 d之后酶活性趨于穩(wěn)定（圖4-a），粗酶液經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾層析純化，經(jīng) SDS-PAGE 可以發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白在44.4 ku大小處有一條帶（圖4-b），表觀分子量與預(yù)測(cè)大小一致。

2.3 幾丁質(zhì)酶gene02524的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定 在不同溫度下測(cè)定gene02524蛋白的酶活性，從圖5-a可以看出，該幾丁質(zhì)酶的最適溫度為50 ℃，80 ℃時(shí)仍有活性，30～55 ℃范圍內(nèi)具有50%以上活性，具有較寬的溫度適用性。將gene02524酶蛋白置于不同的溫度中孵育，并對(duì)其剩余酶活性進(jìn)行檢測(cè)，可以看到該幾丁質(zhì)酶在35 ℃以下活力基本沒有損失，保溫 60 min 后仍有超過80%的活力，在40 ℃與45 ℃下保溫 60 min 后仍然可剩30%左右的酶活力（圖5-b）。

2.3.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性 研究發(fā)現(xiàn)gene02524蛋白不僅具有非常廣泛的pH值適用范圍（圖6-a），還擁有非常高的pH值穩(wěn)定性（圖6-b）。

在pH值4.0～10.0范圍內(nèi)均有較高的催化活性（剩余酶活>50%），最適pH值為5.0。在pH值為3.5時(shí)酶的穩(wěn)定性最高，并且在pH值3.0～8.5范圍內(nèi)孵育60 min后仍均保有80%以上的酶活力。

2.3.3 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線及米氏常數(shù)的測(cè)定 gene02524重組幾丁質(zhì)酶的酶促反應(yīng)在0～10 min內(nèi)隨著反應(yīng)的進(jìn)行還原糖產(chǎn)量不斷增加，30 min后趨于穩(wěn)定（圖7-a）。取反應(yīng)時(shí)間0～10 min作酶動(dòng)力學(xué)Hans-Woolf曲線（圖7-b），當(dāng)膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，幾丁質(zhì)酶gene02524的K m=2.048 2 g/L，V max=0.635 5×103 μmol/（L·min）。

2.3.4 金屬離子對(duì)gene02524酶活性的影響 供試金屬離子對(duì)gene02524酶活性有不同程度的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)Cu2+與Hg2+對(duì)酶活性抑制作用最強(qiáng)，剩余酶活性均只剩30%左右;而K+、Na+與NH+ 4則抑制酶活性較小，剩余酶活性均在70%以上;其他金屬離子相對(duì)酶活性在40%～60%之間（表2）。

2.3.5 變性劑和蛋白抑制劑對(duì)酶活性的影響 gene02524重組幾丁質(zhì)酶對(duì)供試變性劑和蛋白抑制劑抵抗力較強(qiáng)，除SDS外其他試劑處理后酶活性均剩余50%以上;SDS對(duì)gene02524酶活性有明顯的抑制作用;1 mmol/L EDTA與10 mmol/L β-巰基乙醇對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用（表3）。

2.4 幾丁質(zhì)酶gene02524對(duì)病原真菌的抑制作用

純化后的幾丁質(zhì)酶gene02524對(duì)供試病原菌生長均有一定的抑制作用，并且存在一定的劑量效應(yīng)。相同用量gene02524蛋白對(duì)金黃殼囊孢菌生長抑制作用最強(qiáng)，5 μg gene02524抑制率便能超過55%;3 μg gene02524對(duì)新月彎孢菌的抑菌率為15.56%，當(dāng)酶量達(dá)到7 μg時(shí)，抑菌率增加到40.00%（表4）。

3 討論

微生物幾丁質(zhì)酶的分子量一般在20～90 ku之間，胡仕鳳等統(tǒng)計(jì)了8種木霉的39個(gè)幾丁質(zhì)酶，發(fā)現(xiàn)木霉幾丁質(zhì)酶多為內(nèi)切酶，并且大多數(shù)分子量為42 ku[16]。Lorito等研究發(fā)現(xiàn)，木霉幾丁質(zhì)酶是對(duì)植物病原真菌非常有效的幾丁質(zhì)酶，不僅能夠降解病原菌的菌絲，也對(duì)有幾丁質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁及菌核有降解作用[17-18]。畢赤酵母異源表達(dá)的gene02524與原核表達(dá)的幾丁質(zhì)酶Tachi2相比，熱穩(wěn)定性gene02524低于Tachi2;但是gene02524在pH值 3.0～8.5范圍內(nèi)相對(duì)酶活性在80%以上，具有更高的pH值穩(wěn)定性[19]。而gene02524與同為酵母異源表達(dá)的棘孢木霉幾丁質(zhì)酶Tachi1相比，在熱穩(wěn)定性上低于Tachi1，但是在pH值穩(wěn)定性上高于Tachi1，并且當(dāng)環(huán)境中存在金屬離子及變性劑和蛋白酶抑制劑時(shí)gene02524有更高的穩(wěn)定性[14]，說明gene02524與已報(bào)道的棘孢木霉幾丁質(zhì)酶相比具有一定的差異性。幾丁質(zhì)酶對(duì)很多病原菌都有抑制效果，Olivera等研究發(fā)現(xiàn)不同的幾丁質(zhì)酶作用方式不同[20]，所以不同的幾丁質(zhì)酶對(duì)不同的病原菌抑制效果不同。本研究表達(dá)的gene02524與已報(bào)道的棘孢木霉幾丁質(zhì)酶在酶學(xué)性質(zhì)上有很多差異，這種酶性質(zhì)的差異可能導(dǎo)致不同幾丁質(zhì)酶在木霉中執(zhí)行不同的生物學(xué)功能，有待于進(jìn)一步深入研究。本研究實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶gene02524的酵母表達(dá)，明確了gene02524的酶學(xué)性質(zhì)和抑菌活性，為植物病害的防治提供了新的基因資源，同時(shí)也為進(jìn)一步研究棘孢木霉中幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)及功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了幾丁質(zhì)酶gene02524，蛋白表觀分子量為44.4 ku，與理論分子量相符，gene02524基因編碼序列全長 1 190 bp，編碼397個(gè)氨基酸并包含GH18家族特征的序列SXGG及DXXDXDXE，理論等電點(diǎn)為5.67。最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在35 ℃下穩(wěn)定性最好;gene02524蛋白具有非常廣泛的pH值適用范圍，在pH值4.0～10.0范圍內(nèi)均有較高的催化活性（剩余酶活>50%），最適pH值為5.0，在pH值為3.5時(shí)穩(wěn)定性最高;金屬離子對(duì)gene02524活性有明顯影響，其中Cu2+、Hg2+強(qiáng)烈抑制酶活性;SDS強(qiáng)烈抑制酶活性，1 mmol/L EDTA與10 mmol/L β- 巰基乙醇對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用。gene02524對(duì)供試的病原菌均有不同程度的抑制效果，抑菌譜較廣。

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