基因芯片在胃癌及腫瘤球細(xì)胞差異表達(dá)基因篩選中的應(yīng)用

許乙威+賈舉聞+簡鋒

【摘要】 目的 探討基因芯片在胃癌及腫瘤球細(xì)胞差異表達(dá)基因篩選中的應(yīng)用價(jià)值。方法 在無菌條件下， 對人胃癌細(xì)胞HGC-27及其腫瘤球細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)， 對兩種細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取， 并實(shí)施純化處理。對總RNA做雜交處理， 采用TreeViem及Cluster軟件分析及顯示所得熒光信號(hào)。結(jié)果 根據(jù)差異顯示性標(biāo)準(zhǔn)， 對照人胃癌細(xì)胞， 顯示腫瘤球細(xì)胞中， 有1746條差異表達(dá)基因。其中， 基因表達(dá)上調(diào)608個(gè)， 基因表達(dá)下調(diào)1138個(gè)， 且涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長等。結(jié)論 人胃癌細(xì)胞HGC-27及其腫瘤球細(xì)胞具有一定基因表達(dá)差異， 基因芯片篩選價(jià)值較高， 且腫瘤形成在腫瘤球細(xì)胞變化中發(fā)揮著重要的作用， 需引起高度關(guān)注。

【關(guān)鍵詞】 基因芯片；胃癌細(xì)胞；腫瘤球細(xì)胞；基因表達(dá)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.076

作為臨床上一種常見惡性腫瘤， 胃癌患病率較高。以往， 臨床上多采用手術(shù)、化療、放療、中藥等方法進(jìn)行治療， 但病死率仍較高[1]。近年來， 基因芯片技術(shù)在胃癌的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用， 能隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達(dá)模式， 可為治療胃癌提供新的思路[2]。本研究采用基因芯片技術(shù)， 對人胃癌細(xì)胞及其腫瘤球細(xì)胞的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選， 從而尋找新的治療胃癌的途徑， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 本研究所用材料包括購自中科院細(xì)胞庫的人胃癌細(xì)胞HGC-27；購自Gibco公司的胰蛋白酶；購自Sigma公司的hechst33342；購自Invitrogen公司的表皮生長因子、DMEM、DMEM/F12等。

1. 2 有血清培養(yǎng)液的培養(yǎng) 以100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、含%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液， 將HGC-27于5%二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 及時(shí)對培養(yǎng)液進(jìn)行更換， 消化傳代采用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行。

1. 3 無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng) 以無血清、含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、20 ng/ml表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)液， 將HGC-27接種到低吸附塑料6孔板中， 在5%二氧化碳、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 對腫瘤球形成情況進(jìn)行觀察， 每日增加200 μl新鮮培養(yǎng)液。

1. 4 提取總RNA 人胃癌細(xì)胞HGC-27及其腫瘤球細(xì)胞的總RNA提取采用Trizol試劑進(jìn)行， 并做純化處理， RNA質(zhì)量采用甲醛變性膠電泳進(jìn)行檢測。

1. 5 基因表達(dá)譜芯片雜交 采用GeneChip IVT Eepress Kit進(jìn)行， 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作， 從而合成每個(gè)樣品的cRNA。將基因芯片與標(biāo)記的cRNA進(jìn)行雜交。

1. 6 收集與分析芯片圖像 對基因芯片實(shí)施洗滌與染色處理， 微陣列掃描采用基因芯片掃描儀3000進(jìn)行， 對芯片圖像進(jìn)行收集， 對數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取。樣品間基因轉(zhuǎn)錄差異分析采用校正后的原始數(shù)據(jù)完成。

2 結(jié)果

2. 1 腫瘤球培養(yǎng)及總RNA提取 在SSM培養(yǎng)液中， 細(xì)胞呈現(xiàn)均勻貼壁生長狀態(tài)。在SFM培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d， 細(xì)胞呈現(xiàn)致密腫瘤球狀態(tài)。實(shí)施甲醛凝膠電泳， HGC-27及腫瘤球細(xì)胞的RNA電泳條帶清晰， 提示總RNA完整無降解， 可實(shí)施芯片實(shí)驗(yàn)。

2. 2 基因表達(dá)譜芯片雜交 將基因芯片與標(biāo)記的cRNA進(jìn)行雜交， 芯片上各位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度采用掃描儀3000進(jìn)行明確。而HGC-27細(xì)胞及腫瘤球細(xì)胞中各基因表達(dá)水平均能經(jīng)由芯片上各位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行反映。

2. 3 芯片圖像采集及數(shù)據(jù)分析 經(jīng)由計(jì)算機(jī)對雜交點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定性、定量處理， 根據(jù)差異顯示性標(biāo)準(zhǔn)對照人胃癌細(xì)胞， 腫瘤球細(xì)胞中， 有1746條差異表達(dá)基因。其中， 基因表達(dá)上調(diào)608個(gè)， 基因表達(dá)下調(diào)1138個(gè)。而腫瘤球細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)10倍以上的基因包括TDO2、GDF15、EGR1、DUSP6、ETV5、PHLDB2、MAFF、TRIB3、COL1A2、CREB5、TOX、EMP1、AKR1C3、ELK3、PROCR、LRRC4B、SHOX2等。腫瘤球細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)10倍以上的基因包括TMEFF2、SFRP4、GRIK3、CHODL、CNR1、CNTN1、IGFBP5、EDNRA、AMBN、SEPP1、KBTBD10、DCT等。而且， 基因表達(dá)的變化涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長等。

3 討論

現(xiàn)階段， 隨著人類基因組計(jì)劃的不斷深入， 研究重點(diǎn)逐步過渡到后基因組時(shí)代[3]。早在20世紀(jì)， 美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因芯片， 認(rèn)為芯片DNA與樣品cDNA結(jié)合被標(biāo)記， 能對細(xì)胞所有基因進(jìn)行描述， 且能對與某些生命現(xiàn)象相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行了解和掌握， 在基因調(diào)控研究中有著較高的應(yīng)用價(jià)值[4]。此外， 基因芯片技術(shù)還能對生物樣本所有基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測， 從而獲得基因組水平的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)[5]。經(jīng)由分析這些數(shù)據(jù)， 能對基因功能及基因之間的相互作用進(jìn)行了解和掌握[6]。

本研究采用基因芯片技術(shù)， 對人胃癌細(xì)胞及其腫瘤球細(xì)胞的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選， 從而尋找新的治療胃癌的途徑。結(jié)果顯示， 根據(jù)差異顯示性標(biāo)準(zhǔn)， 對照人胃癌細(xì)胞， 腫瘤球細(xì)胞中， 基因表達(dá)上調(diào)608個(gè)， 基因表達(dá)下調(diào)1138個(gè)， 且涉及方面較多， 包括腫瘤形成、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長等?？紤]到存在較多的差異基因， 故本研究僅重點(diǎn)對差異在10倍以上的基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， GDF15、ETV5等與腫瘤形成及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)明顯上調(diào)。同時(shí)， TMEFF2、IGFBP5等可抑制腫瘤形成的基因表達(dá)明顯下降。結(jié)果表明， 在腫瘤形成過程中， 腫瘤球細(xì)胞變化發(fā)揮著重要的作用。這都能為臨床研究胃癌發(fā)病機(jī)制提供一定的參考價(jià)值， 有利于深入分析胃癌分子診斷標(biāo)志、藥物作用靶標(biāo)等， 臨床價(jià)值較高。

綜上所述， 人胃癌細(xì)胞HGC-27及其腫瘤球細(xì)胞具有一定基因表達(dá)差異， 基因芯片篩選價(jià)值較高， 腫瘤形成在腫瘤球細(xì)胞變化中發(fā)揮著重要的作用， 需引起高度關(guān)注。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2016-10-20]