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    荷花MADS—box基因的克隆及表達(dá)分析

    2017-02-27 10:37王婧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)荷花

    王婧

    摘要:采用RT-PCR方法從微山紅蓮花苞中克隆獲得1個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因,命名為NeMADS1。該基因全長(zhǎng)729 bp,包含1個(gè)720 bp的開放閱讀框,編碼239個(gè)氨基酸,具有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,NeMADS1與E類家族AGL9/SEP-like3基因親緣關(guān)系較近。RT-PCR分析結(jié)果表明,NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)。

    關(guān)鍵詞:荷花;花發(fā)育;MADS-box;基因表達(dá);RT-PCR

    中圖分類號(hào): S682.320.1;Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0039-04

    花發(fā)育的分子機(jī)理一直是植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn),MADS-box基因家族作為轉(zhuǎn)錄因子,在花發(fā)育過程中起重要作用。MADS-box基因不僅參與花發(fā)育的調(diào)控,還在開花時(shí)間的控制、決定分生組織的分化[1]、促進(jìn)根的形成[2],以及種子和果實(shí)發(fā)育[3-4]等方面都起著重要的作用。

    前人在對(duì)雙子葉模式植物遺傳突變體的研究中,提出了花器官發(fā)育ABCDE模型[5-10]。典型雙子葉植物的花大多具有由外到內(nèi)4輪結(jié)構(gòu):萼片、花瓣、雄蕊和心皮。模型認(rèn)為控制花器官發(fā)育的基因按功能可以分成5類(A~E類功能基因),這些基因單獨(dú)或共同作用控制各輪花器官的發(fā)育[9]。隨著對(duì)擬南芥、矮牽牛、金魚草等模式植物的研究,已經(jīng)克隆到很多MADS-box基因,僅擬南芥中就有100多種MADS-box基因[11]。

    SEP(SEPALLATA)基因?qū)儆贛ADS-box E類基因[9],是花器官發(fā)育所必需的。擬南芥中有4個(gè)SEP基因:SEP1、SEP2、SEP3、SEP4(又稱AGL2、AGL4、AGL9、AGL3)[12-15],SEP1、SEP2、SEP4基因在擬南芥花發(fā)育的早期花分生組織中起始表達(dá);而SEP3主要在內(nèi)3輪花器官原基中表達(dá)。隨著花原基的進(jìn)一步發(fā)育,SEP1和SEP2在4輪花器官中均有表達(dá)[14],而SEP3僅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達(dá)[8],SEP4主要在萼片中表達(dá)[16]。目前為止,研究人員已從桃[17]、蘋果[18]、草莓[19]、春蘭[20]、文心蘭[21]等多種植物中分離克隆了SEP-like同源基因,并且對(duì)其表達(dá)模型及功能開展了相關(guān)研究。

    荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.),別稱蓮花,是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一,具有很高的觀賞價(jià)值。目前,有關(guān)荷花花器官發(fā)育MADS-box基因的研究報(bào)道較少,更未見AGL9/SEP-like基因的研究報(bào)道。本研究以微山紅蓮的花苞為試驗(yàn)材料,采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得1個(gè)荷花花器官發(fā)育 MADS-box家族E類相關(guān)基因NeMADS1的全長(zhǎng)序列,并分析其表達(dá)模式,為蓮科植物進(jìn)化研究提供依據(jù),同時(shí)為研究植物花發(fā)育模式以及荷花花器官發(fā)育的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 植物材料

    以吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院基地的微山紅蓮為試驗(yàn)材料,于2015年8月取雌蕊分化后期花苞進(jìn)行基因克隆。取盛花期花朵的萼片、花瓣、雄蕊、心皮進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析。所有材料采集后均立即用液氮處理,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 總RNA提取及cDNA合成

    以雌蕊分化后期花苞為材料,采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取其總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase, Invitrogen)合成cDNA,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.3 基因克隆與序列分析

    查找NCBI中EST序列信息及相關(guān)資料設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng),引物序列NeS1-F:5′-CTGAAATGGGGAGAGGTAGGGT-3′、NeS1-R:5′-CTGATCATGCCAGCCACCCAGGC-3′,以荷花花苞的cDNA為模板進(jìn)行基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL,反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的片段,連接到pMD-19T(TAKARA)載體上,轉(zhuǎn)化DH5α菌株,進(jìn)行克隆、測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

    采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接和分析,獲得的序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì),用MEGA 5.0和ClustalX軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.4 RT-PCR表達(dá)分析

    提取盛花期花萼、花瓣、雄蕊和心皮的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析。設(shè)計(jì)引物NeS1-F2:5′-AACAGGGCATTGAAACGG-3′,NeS1-R2:5′-AGCCACCCAGGCATATAAC-3′,定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit(TAKARA)。反應(yīng)體系為:10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)mix,0.8 μL forward primer,0.8 μL reverse primer,2 μL cDNA,0.4 μL Rox Reference Dye or Dye(50×),6.0 μL H2O。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以Actin為內(nèi)參(Actin-F:5′-TGCCTATGTGGCTCTTGACTAT-3′,Actin-R:5′-GATGGCTGGAATAGAACCTCA-3′)在Roche Lignt Cycler 2.0熒光定量PCR儀上反應(yīng),3次重復(fù),采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因克隆與序列分析

    以雌蕊分化后期的花苞總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分離出長(zhǎng)度為729 bp的片段,NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果表明該片段與多種植物的MADS-box基因有較高同源性,證明該片段為所需目的片段。通過DNAMAN軟件的序列拼接和分析,獲得基因全長(zhǎng)為720 bp,編碼239個(gè)氨基酸(圖1),命名為NeMADS1。

    蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,該蛋白是植物特有的MIKC型MADS-box基因,包含典型的MADS盒(實(shí)線部分)和K盒(雙線部分)。Blast同源序列分析該基因與其他植物AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性。

    2.2 NeMADS1氨基酸同源性比較

    利用NCBI的BlastX工具將NeMADS1基因核酸序列翻譯成氨基酸序列并進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果表明:NeMADS1與ABCDE模型中的E類蛋白有較高的同源性,其中與EpSEP3、PaAGL9、EcAGL9和PtSEP3的同源性分別是87%、84%、84%、83%。對(duì)NeMADS1基因氨基酸序列的多序列比對(duì)結(jié)果表明:SEP-like基因編碼氨基酸序列含有高度保守的5′端MADS結(jié)構(gòu)域和半保守的K結(jié)構(gòu)域,在差別較大3′端C-末端中發(fā)現(xiàn)了SEP-like蛋白特有的SEPⅠ和SEPⅡ基序結(jié)構(gòu)域(圖2)。

    2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

    系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明,NeMADS1編碼蛋白與 ABCDE 模型中的AGL9/SEP-like3(E類)基因編碼蛋白同源性較高,與領(lǐng)春木(Euptelea pleiosperma)的EpSEP3關(guān)系最近,說明NeMADS1應(yīng)屬于E類MADS-box基因(圖3)。

    A類和E類基因在進(jìn)化上屬于AP1/AGL9組,該組有3個(gè)進(jìn)化系:AGL9(SEP)、AP1和介于二者之間的AGL6進(jìn)化系[21-22]。為了確定NeMADS1的歸類及進(jìn)化關(guān)系,選取 AP1/AGL9 組MADS-box基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示,AP1/AGL9組氨基酸序列明顯分為3類:SEP、AP1和AGL6,其中AGL6與SEP分枝為姊妹關(guān)系,所有AGL9、SEP3聚在一起,然后又與SEP1/2/4聚在了一個(gè)大枝上(圖3)。

    2.4 RT-PCR表達(dá)分析

    RT-PCR分析結(jié)果表明,NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)量較高,尤其在花瓣中表達(dá)量最高,在花萼中表達(dá)量最低。NeMADS1基因的表達(dá)模式與擬南芥SEP3基因在各組織的表達(dá)模式一致,進(jìn)一步說明NeMADS1屬于E類基因(圖4)。

    3 討論與結(jié)論

    本試驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)克隆了與花發(fā)育相關(guān)的NeMADS1基因。同源性分析結(jié)果表明,NeMADS1基因與其他植物的AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性,其蛋白質(zhì)包含MADS區(qū)、K區(qū)、I區(qū)和C-末端等4個(gè)區(qū)域,屬于植物典型的MIKC類MADS-box基因。MADS-box蛋白的C-末端被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄激活、高階蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成、DNA特異性識(shí)別、亞細(xì)胞定位等有關(guān)[23]。SEP亞家族大部分成員的C端具有2個(gè)短的、相對(duì)保守的基序(SEPⅠ和SEPⅡ基序)[15]。NeMADS1基因具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序,是典型的SEP-like基因。

    通過對(duì)SEP-like基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)SEP亞家族發(fā)生過多次基因重復(fù)事件,其中在被子植物起源之前發(fā)生了1次基因重復(fù)事件,產(chǎn)生了SEP3進(jìn)化系和SEP1/2/4進(jìn)化系[15]。本研究對(duì)NeMADS1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,所有的AGL9/SEP-like3聚在了一起,其中與領(lǐng)春木、昆欄樹(Trochodendron aralioides)的關(guān)系較近, 而三者均屬于基部雙子葉植物,這個(gè)結(jié)果與APGⅢ分類系統(tǒng)一致,說明AGL9/SEP-like3基因在進(jìn)化上相對(duì)保守,同時(shí)也為蓮科在系統(tǒng)進(jìn)化中所屬的位置提供了證據(jù)。

    荷花SEP-like基因NeMADS1在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá),這與擬南芥SEP3基因、加州罌粟(Eschscholzia californica)EScaAGL9基因在表達(dá)模式上一致[15],而與草原龍膽(Eustoma grandiflorum)EgSEP3-1基因的表達(dá)模式有所差異[24]。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子(co-factor)在各輪花器官?zèng)Q定中發(fā)揮作用[8]。事實(shí)上,各進(jìn)化系的表達(dá)模式是存在差異的[25],雖然E類基因的表達(dá)模式在被子植物不同的物種中有差異,但該基因?qū)λ谢ㄆ鞴俚陌l(fā)育都是必需的,其功能是保守的。

    本試驗(yàn)中分離出1個(gè)MADS-box基因家族E類基因,并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析,有關(guān)其時(shí)空表達(dá)模式和深入功能分析工作也正在進(jìn)行中,以期為闡明荷花花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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