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    牦牛和犏牛睪丸中泛素結合酶基因Ube2n、泛素連接酶基因Trim36表達水平的比較

    2017-02-27 10:27:24尚秋萍黃林胡雨薇
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年1期
    關鍵詞:牦牛睪丸

    尚秋萍+黃林+胡雨薇

    摘要:為探討蛋白質泛素化與牦牛雜交后代睪丸精子發(fā)生異常的相關性,比較了參與泛素化的2種酶基因(泛素結合酶基因Ube2n、泛素連接酶基因Trim36)在成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中的mRNA水平。定量PCR分析顯示,牦牛(n=9)睪丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分別顯著、極顯著高于犏牛(n=7),其中Trim36 mRNA水平相差10倍以上。研究結果提示,犏牛睪丸蛋白質泛素化水平明顯下降,可能會影響精子發(fā)生過程中正常的蛋白質更新。

    關鍵詞:牦牛;雜交雄性不育;睪丸;蛋白質降解;泛素化

    中圖分類號: S823.82;Q786 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0019-03

    牦牛(Bos grunniens)主要分布在中國,數(shù)量3 000萬頭以上,是青藏高原特有的牛種和畜牧業(yè)主體。牦牛與普通牛(Bos taurus)的雜交后代稱為犏牛,具有明顯的雜種優(yōu)勢,產(chǎn)乳和產(chǎn)肉量顯著提高,但表現(xiàn)為回交三代內(nèi)雄性不育,無法產(chǎn)生正常精子[1],而雌性雜交后代生殖正常,其分子機制尚未明確。

    已有研究表明,犏牛睪丸中很多生殖相關基因的mRNA或蛋白質水平均顯著低于其親本牦牛和黃牛,如SYCP3、Boule、Dazl、Dmrt7、Dmc1等[2-5]。也存在少量蛋白質在犏牛睪丸中上調(diào)的情況[6]。也有研究表明,犏牛睪丸中細胞凋亡增加[7]。盡管目前犏牛雄性不育的分子機制尚不明確,但總體認為,犏牛雄性不育的機制可能涉及精子發(fā)生過程中復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡,并與睪丸中多種特異或非特異蛋白質的異常表達有關。然而,這些變化是否影響睪丸中蛋白質降解尚不明確。鑒于蛋白質泛素化在蛋白質降解中的重要作用,本研究比較牦牛與犏牛睪丸中與泛素化相關的泛素結合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N,Ube2n)、泛素連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36,Trim36)基因的mRNA水平,以探討泛素化與犏牛雄性不育是否具有相關性。

    1 材料與方法

    1.1 樣品的采集

    麥洼牦牛(Bosgrunniens)和犏牛(公黃牛與母麥洼牦牛的雜交F1代)的睪丸組織于秋季采自四川省成都市近郊某屠宰場。健康的成年公牦牛(n=9)和雄性不育公犏牛(n=7)在屠宰后立刻取其睪丸,切成適當大小后,與干冰一同帶回實驗室,于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。本研究對牦牛和犏牛睪丸均進行常規(guī)組織切片分析,證實犏牛睪丸中無精子。

    1.2 主要試劑和儀器

    RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司,Trizol Reagent購自美國Ambion公司,QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司,Super Taq DNA Polymerase購自美國GeneCopoeia公司。

    C1000 Thermal Cycler型梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler型熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品,CR21G型高速冷凍離心機為日本日立公司產(chǎn)品。

    1.3 總RNA的提取及反轉錄

    采用Trizol法并按照試劑盒說明書提取牦牛睪丸的總RNA,采用核酸蛋白檢測儀測定核酸濃度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg總RNA為模板,利用隨機引物進行反轉錄獲得cDNA。

    1.4 睪丸組織Ube2n和Trim36基因的定量PCR分析

    參照普通牛的Ube2n(NM_001076258)、Trim36(XM_005890859)、內(nèi)參基因GAPDH(NM_001034034)、18S RNA(NR_036642)序列,采用Primer Premier 5.0軟件分別設計定量PCR引物(表1)。分別對上述4個基因進行PCR擴增,產(chǎn)物純化后經(jīng)10倍梯度稀釋作為模板,進行熒光定量PCR擴增。利用定量PCR儀上的軟件繪制標準曲線。表1 引物序列

    目的基因引物(5′→3′) 產(chǎn)物長度(bp)Ube2nF:CCTTAGAGGGCATCAGATCCTCAG;R:AAGGTTCCAACCCACAGGTTAACA240Trim36F:TCTATGGCTCATTGGTAATAAGTAT;R:AAACCACCCAAGAAAGAGTATCT185GAPDHF:CGACTTCAACAGCGACACTCA;R:GGTCCAGGGACCTTACTCCTT16918S RNAF:CTGAGAAACGGCTACCACATC;R:CAGACTTGCCCTCCAATGG168

    以反轉錄的牦牛和犏牛睪丸組織cDNA為模板,采用實時熒光定量PCR方法檢測Ube2n、Trim36基因在睪丸中的相對表達量。25 μL PCR體系為:2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上游及下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR程序為:95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性15 s,64 ℃退火15 s(Ube2n)或54 ℃退火20 s(Trim36),72 ℃延伸15 s,共40個循環(huán)。于65~95 ℃下制作溶解曲線。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    采用2-ΔΔCT法計算目的基因在睪丸中的mRNA水平。采用雙內(nèi)參GAPDH和18S RNA的幾何平均數(shù)進行標準化,以牦牛睪丸的表達量為對照。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示,采用SPSS 18.0軟件對熒光定量數(shù)據(jù)進行t檢驗。

    2 結果與分析

    2.1 Ube2n和Trim36基因表達的熒光定量PCR分析方法

    本研究提取的睪丸RNA質量經(jīng)核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)的檢測分析,濃度和質量均符合要求。本試驗建立了牦牛Ube2n和Trim36基因mRNA的定量PCR檢測方法,采用雙內(nèi)參基因進行標準化。目的基因和內(nèi)參基因擴增的特異性高(圖1),擴增效率為98.6%~103.8%,標準曲線線性關系較好(R2約為0.99),符合所用儀器的定量及相應算法要求。

    2.2 牦牛和犏牛睪丸組織Ube2n、Trim36基因mRNA水平的比較

    對成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因mRNA水平的定量PCR檢測顯示,犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分別顯著、極顯著低于牦牛,其中Ube2n mRNA水平相差約2倍,而Trim36 mRNA水平相差10倍以上(圖2)。

    3 結論與討論

    蛋白質的泛素化是其在細胞中降解的關鍵,在調(diào)節(jié)各種細胞生物學過程(細胞周期、DNA損傷的修復、信號轉導等)中發(fā)揮重要作用,涉及3種酶的參與以及多種修飾模式[8-9]。本研究在mRNA水平證實,2種參與泛素化的酶基因(Ube2n、Trim36)在犏牛睪丸中的表達均顯著下降,提示犏牛睪丸中蛋白質的泛素化降解可能存在異常。牦牛和犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因mRNA的變化趨勢與其蛋白質水平的變化趨勢相同[6](部分為待發(fā)表資料),進一步驗證了參與泛素化的2種酶在犏牛睪丸中表達異常。

    犏牛的雜種優(yōu)勢具有重要的應用價值,但其雄性不育在很大程度上制約了犏牛的高效利用。犏牛睪丸組織中無精子[7],精子發(fā)生受阻很可能與減數(shù)分裂異常有關。犏牛睪丸中很多與生殖相關的基因表達下調(diào)[2-7],但與其雄性不育的因果關系尚未明確。犏牛睪丸組織泛素化水平降低與其精子發(fā)生異常是否存在關聯(lián),需要進一步研究證實。筆者推測,由于犏牛睪丸中多數(shù)蛋白質的表達水平可能下降[2-7],其泛素化水平的降低很可能是適應蛋白質水平改變的結果。Ube2n和Trim36 mRNA水平在犏牛睪丸中的顯著下降或許不是犏牛雄性不育的關鍵原因,但其機制可能涉及睪丸精子發(fā)生過程中復雜的網(wǎng)絡調(diào)控。精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂異常的原因很多,如生殖隔離中減數(shù)分裂前期DNA雙鏈斷裂(DSB)不能修復、染色體聯(lián)會或重組異常等[10]。這種DNA的修復或許直接導致蛋白質泛素化修飾相關酶的改變,已有研究表明,參與DNA雙鏈斷裂修復的蛋白質或DNA損傷可通過一些機制影響其他蛋白質的泛素化[11-12]。雄性不育犏牛睪丸組織Ube2n和Trim36 mRNA水平顯著下降, 是其精子發(fā)生異常所涉及的基因網(wǎng)絡調(diào)控的一部分。

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