基于16SrDNA序列的1株滅螺微生物的分子鑒定

崔國艷+程紅兵+何鑫

摘要：從湖南省汨羅市血吸蟲防治基地土壤中分離得到1株滅螺活性較強的微生物菌株B59，以B59菌株的總DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增并測其核酸序列，得到1條約1 500 bp的片段。通過Blast軟件在GenBank中進行同源性檢索，將其與同源性較高的菌株的ITS序列進行ClustalX序列差異和同源性分析，分別使用MEGA 6.0軟件中的鄰接法、Phylip軟件中的最大簡約法及最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，B59菌株與Bacillus cereus的親緣關(guān)系最近，聚為一支，相似度達100%。

關(guān)鍵詞：釘螺；微生物；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號： R383.2+4；S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0016-03

血吸蟲病是一種嚴重危害人類公共健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病，主要流行于非洲、東南亞等國家，每年有690萬～750萬人被感染[1]，雖然目前在我國得到了很好的控制，但是日本血吸蟲病仍然被政府認定為4種高度傳染病之一[2-3]，甚至在許多地區(qū)，服用大劑量吡喹酮后的人群再感染率仍大于20%[4]。湖北釘螺是日本血吸蟲唯一的中間宿主，是造成日本血吸蟲病流行的重要根源。據(jù)統(tǒng)計，截至2013年底血吸蟲病流行縣（市、區(qū)）比2012年新增2個，達到454個，總?cè)丝跒?.49億人，血吸蟲病的流行村有30 352個[5]。因此，控制釘螺以打破寄生蟲的生活史是目前全國控制血吸蟲病的比較重要和有效的措施[6]。但是由于復雜的經(jīng)濟、社會、環(huán)境和生物等因素的影響，目前仍不確定控制釘螺最經(jīng)濟有效的方法。目前控制釘螺的方法主要有3種，即物理滅螺、化學藥物滅螺和生物生態(tài)滅螺。微生物滅螺由于其穩(wěn)定、高效，對非靶生物無毒性，具有更多的生物多樣性、豐富的代謝途徑或產(chǎn)物，同時生長周期短，可誘導產(chǎn)物產(chǎn)生等優(yōu)勢[7-9]，是目前較有前景的滅螺方法，因此尋找理想的滅螺微生物的工作一直在進行。B59菌株是筆者實驗室從土壤中篩選到的1株滅螺活性較高的微生物[10]，準確地對其進行分類鑒定是后續(xù)工作的必要前提。細菌16S rDNA序列分析技術(shù)具有高效、方便、準確、快捷等特點，廣泛應用于各種細菌的遺傳特征和分子差異的研究。本研究對B59菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的序列進行測定，對所測序列進行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，以鑒定其分類地位，為進一步應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 B59菌株是從湖南省汨羅市血吸蟲病防治研究試驗基地的螺池土壤中分離純化得到，由筆者實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 2×Taq Master Mix、DNA marker（DL2000），均購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成；My CyclerTM thermal cycler PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，購自美國UVP公司；PowerPac Univarsal電泳儀，購自美國Bio-Rad公司；H1850R臺式高速低溫離心機，購自湖南湘儀動力測試儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 供試菌株在LB斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌基因組DNA的提取 參照DNA提取試劑盒的說明書提取B59菌株基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.3 16S rDNA的PCR擴增 采用細菌16S rDNA的通用引物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系（25 μL）為：2×PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物（50 μmol/L）各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證后，擴增產(chǎn)物送北京華大基因科技有限公司進行序列測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運用ContigExpress軟件進行序列拼接以得到B59菌株的16S rDNA基因全序列，將其提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫（ http：//www.ncbi. nlm.nih.gov），在NCBI上進行Blast在線檢索，搜索其相近序列，采用ClustalX進行多序列比對后，通過MEGA 6.0中的鄰接法（NJ）、Phylip 3695中的最大簡約法（MP）及最大似然法（ML）[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap穩(wěn)定性檢驗（1 000次）。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

以“1.2.2”節(jié)中的方法提取得到B59菌株的基因組DNA，電泳檢測到其條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，可直接用于PCR。菌株B59的16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1條約1 500 bp的特征性條帶（圖1），與預期的大小一致，擴增特異性較高。

2.2 目的基因16S rDNA序列分析

運用ContigExpress軟件對序列進行雜峰修正和正反序列拼接，結(jié)果表明B59菌株的16S rDNA長度為1 490 bp（圖2）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將B59菌株的16S rDNA序列在GenBank中進行在線Blast比對，以大腸埃希菌（Escherichia coli）為外群，選取同源性較近的9個序列與B59菌株建立比對模型，分別運用NJ、MP、ML法一起構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap生成1 000個自展數(shù)據(jù)集對進化樹進行可靠性分析（圖3、圖4、圖5）。

由圖3、圖4可知，NJ法和MP法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹得到基本一致的拓撲結(jié)構(gòu)，在系統(tǒng)樹上，E.coli作為外群單獨分為一支，其余分為2支，但兩序列經(jīng)Bootstrap驗證都有很高的支持率，說明其系統(tǒng)關(guān)系的可信度較高。NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，B59菌株（KP146144） 與蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）聚為同一分支，親緣關(guān)系最近，序列的相似性高達100%；MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，B59菌株與Bacillus cereus位于枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）和土壤芽胞桿菌（Solibacillus silvestris）分支上，其序列相似性達100%；而圖5中，由ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，B59菌株與Bacillus cereus也聚為同一分支，序列相似性達100%，但其位于大腸埃希菌分支上，序列的相似性同為100%。

3 討論

16S rDNA是原核生物在漫長的進化過程中十分保守的序列，在現(xiàn)代微生物的分類鑒定中扮演著重要的角色[12]，具有分子量大小適中、信息量大、易于分析、突變率小等優(yōu)點，是細菌分類學研究中最常用的分子鐘，素有細菌化石之稱[13]，是種屬鑒定的分子基礎，得到多個國際權(quán)威機構(gòu)FDA、NASA、TIGR等的認可[14]?；?6S rDNA序列可對物種之間的同源性進行分析，如果同源性小于98%，認為屬于不同種；同源性小于93%～95%，認為屬于不同屬[15]。

基于分子水平的系統(tǒng)發(fā)育推斷方法可分為2類，即基于字符序列的方法和基于距離的方法。基于字符序列的方法利用統(tǒng)計技術(shù)定義一個最優(yōu)化標準，對樹的優(yōu)劣進行評價，包括最大簡約法、最大似然法。最大簡約法希望用最小的改變來解釋所要研究的分類群體之間的差異，但這種方法在物種數(shù)量較大時，變得不實用，且沒有考慮樹中分支的長度，這樣無法反映出不同物種間進化距離的長短[16]；最大似然法具有良好的統(tǒng)計性質(zhì)，能夠更加有效地刻畫不同物種間的進化距離，但其計算量非常大，也是一個NP-難題[17]，在物種數(shù)量較大時是不適用的，且這種方法對模型的依賴性較高，導致其在很多情況下應用存在困難；基于距離的NJ法通常無法找到精確的最小進化樹，只能找到近似的，但其計算速度非?？欤覝蚀_率較高，因此常被用于系統(tǒng)發(fā)育分析[18]。

這3類建樹方法由于各自的局限性均有可能導致系統(tǒng)產(chǎn)生誤差，為了避免誤差的影響，本研究同時采用3種方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹以綜合分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明，3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，雖然由ML法構(gòu)建的發(fā)育樹中，Lysinibacillus sphaericus單獨作為外群與其他2種方法不同，但是B59菌株與Bacillus cereus都聚為一支，且置信度較高，均為100%，說明本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是可信的，與郭青云等的研究結(jié)果[19]一致。因此，將B59菌株歸為B. cereus，B. cereus能產(chǎn)生多種化合物如溶血素、脂肽類抗菌物質(zhì)、多烯類物質(zhì)及氨基糖苷等物質(zhì)，這些物質(zhì)對多數(shù)細菌、病毒、真菌及蟲體有毒性作用，這可能是釘螺致死的主要原因[ 20-22]。然而，目前有極少研究報道B. cereus具有滅螺活性，其具體的滅螺活性物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)、純化等有待進一步研究。

4 結(jié)論

采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增得到B59菌株的16S rDNA序列，運用ContigExpress軟件進行序列拼接，該序列長度為1 490 bp，運用NJ、MP及ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，B59菌株與Bacillus cereus的親緣關(guān)系最近，聚為一支，相似度達100%。

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