• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于16SrDNA序列的1株滅螺微生物的分子鑒定

    2017-02-27 10:25:20崔國艷程紅兵何鑫
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年1期
    關(guān)鍵詞:釘螺血吸蟲病引物

    崔國艷+程紅兵+何鑫

    摘要:從湖南省汨羅市血吸蟲防治基地土壤中分離得到1株滅螺活性較強的微生物菌株B59,以B59菌株的總DNA為模板,采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增并測其核酸序列,得到1條約1 500 bp的片段。通過Blast軟件在GenBank中進行同源性檢索,將其與同源性較高的菌株的ITS序列進行ClustalX序列差異和同源性分析,分別使用MEGA 6.0軟件中的鄰接法、Phylip軟件中的最大簡約法及最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致,B59菌株與Bacillus cereus的親緣關(guān)系最近,聚為一支,相似度達100%。

    關(guān)鍵詞:釘螺;微生物;16S rDNA;系統(tǒng)發(fā)育樹

    中圖分類號: R383.2+4;S182 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0016-03

    血吸蟲病是一種嚴重危害人類公共健康和社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病,主要流行于非洲、東南亞等國家,每年有690萬~750萬人被感染[1],雖然目前在我國得到了很好的控制,但是日本血吸蟲病仍然被政府認定為4種高度傳染病之一[2-3],甚至在許多地區(qū),服用大劑量吡喹酮后的人群再感染率仍大于20%[4]。湖北釘螺是日本血吸蟲唯一的中間宿主,是造成日本血吸蟲病流行的重要根源。據(jù)統(tǒng)計,截至2013年底血吸蟲病流行縣(市、區(qū))比2012年新增2個,達到454個,總?cè)丝跒?.49億人,血吸蟲病的流行村有30 352個[5]。因此,控制釘螺以打破寄生蟲的生活史是目前全國控制血吸蟲病的比較重要和有效的措施[6]。但是由于復雜的經(jīng)濟、社會、環(huán)境和生物等因素的影響,目前仍不確定控制釘螺最經(jīng)濟有效的方法。目前控制釘螺的方法主要有3種,即物理滅螺、化學藥物滅螺和生物生態(tài)滅螺。微生物滅螺由于其穩(wěn)定、高效,對非靶生物無毒性,具有更多的生物多樣性、豐富的代謝途徑或產(chǎn)物,同時生長周期短,可誘導產(chǎn)物產(chǎn)生等優(yōu)勢[7-9],是目前較有前景的滅螺方法,因此尋找理想的滅螺微生物的工作一直在進行。B59菌株是筆者實驗室從土壤中篩選到的1株滅螺活性較高的微生物[10],準確地對其進行分類鑒定是后續(xù)工作的必要前提。細菌16S rDNA序列分析技術(shù)具有高效、方便、準確、快捷等特點,廣泛應用于各種細菌的遺傳特征和分子差異的研究。本研究對B59菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的序列進行測定,對所測序列進行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,以鑒定其分類地位,為進一步應用提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 供試菌株 B59菌株是從湖南省汨羅市血吸蟲病防治研究試驗基地的螺池土壤中分離純化得到,由筆者實驗室保存。

    1.1.2 主要試劑和儀器 2×Taq Master Mix、DNA marker(DL2000),均購自寶生物工程(大連)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成;My CyclerTM thermal cycler PCR儀,購自美國Bio-Rad公司;UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),購自美國UVP公司;PowerPac Univarsal電泳儀,購自美國Bio-Rad公司;H1850R臺式高速低溫離心機,購自湖南湘儀動力測試儀器有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌體培養(yǎng) 供試菌株在LB斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后接種于LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 細菌基因組DNA的提取 參照DNA提取試劑盒的說明書提取B59菌株基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

    1.2.3 16S rDNA的PCR擴增 采用細菌16S rDNA的通用引物,F(xiàn):5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′,R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系(25 μL)為:2×PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 1 μL,上下游引物(50 μmol/L)各1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應條件:94 ℃ 預變性 5 min;94 ℃ 變性1 min,55 ℃退火 1 min,72 ℃延伸 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證后,擴增產(chǎn)物送北京華大基因科技有限公司進行序列測定。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運用ContigExpress軟件進行序列拼接以得到B59菌株的16S rDNA基因全序列,將其提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫( http://www.ncbi. nlm.nih.gov),在NCBI上進行Blast在線檢索,搜索其相近序列,采用ClustalX進行多序列比對后,通過MEGA 6.0中的鄰接法(NJ)、Phylip 3695中的最大簡約法(MP)及最大似然法(ML)[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行Bootstrap穩(wěn)定性檢驗(1 000次)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

    以“1.2.2”節(jié)中的方法提取得到B59菌株的基因組DNA,電泳檢測到其條帶清晰,無拖尾現(xiàn)象,可直接用于PCR。菌株B59的16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到1條約1 500 bp的特征性條帶(圖1),與預期的大小一致,擴增特異性較高。

    2.2 目的基因16S rDNA序列分析

    運用ContigExpress軟件對序列進行雜峰修正和正反序列拼接,結(jié)果表明B59菌株的16S rDNA長度為1 490 bp(圖2)。

    2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

    將B59菌株的16S rDNA序列在GenBank中進行在線Blast比對,以大腸埃希菌(Escherichia coli)為外群,選取同源性較近的9個序列與B59菌株建立比對模型,分別運用NJ、MP、ML法一起構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,利用Bootstrap生成1 000個自展數(shù)據(jù)集對進化樹進行可靠性分析(圖3、圖4、圖5)。

    由圖3、圖4可知,NJ法和MP法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹得到基本一致的拓撲結(jié)構(gòu),在系統(tǒng)樹上,E.coli作為外群單獨分為一支,其余分為2支,但兩序列經(jīng)Bootstrap驗證都有很高的支持率,說明其系統(tǒng)關(guān)系的可信度較高。NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,B59菌株(KP146144) 與蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)聚為同一分支,親緣關(guān)系最近,序列的相似性高達100%;MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,B59菌株與Bacillus cereus位于枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和土壤芽胞桿菌(Solibacillus silvestris)分支上,其序列相似性達100%;而圖5中,由ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,B59菌株與Bacillus cereus也聚為同一分支,序列相似性達100%,但其位于大腸埃希菌分支上,序列的相似性同為100%。

    3 討論

    16S rDNA是原核生物在漫長的進化過程中十分保守的序列,在現(xiàn)代微生物的分類鑒定中扮演著重要的角色[12],具有分子量大小適中、信息量大、易于分析、突變率小等優(yōu)點,是細菌分類學研究中最常用的分子鐘,素有細菌化石之稱[13],是種屬鑒定的分子基礎,得到多個國際權(quán)威機構(gòu)FDA、NASA、TIGR等的認可[14]?;?6S rDNA序列可對物種之間的同源性進行分析,如果同源性小于98%,認為屬于不同種;同源性小于93%~95%,認為屬于不同屬[15]。

    基于分子水平的系統(tǒng)發(fā)育推斷方法可分為2類,即基于字符序列的方法和基于距離的方法。基于字符序列的方法利用統(tǒng)計技術(shù)定義一個最優(yōu)化標準,對樹的優(yōu)劣進行評價,包括最大簡約法、最大似然法。最大簡約法希望用最小的改變來解釋所要研究的分類群體之間的差異,但這種方法在物種數(shù)量較大時,變得不實用,且沒有考慮樹中分支的長度,這樣無法反映出不同物種間進化距離的長短[16];最大似然法具有良好的統(tǒng)計性質(zhì),能夠更加有效地刻畫不同物種間的進化距離,但其計算量非常大,也是一個NP-難題[17],在物種數(shù)量較大時是不適用的,且這種方法對模型的依賴性較高,導致其在很多情況下應用存在困難;基于距離的NJ法通常無法找到精確的最小進化樹,只能找到近似的,但其計算速度非??欤覝蚀_率較高,因此常被用于系統(tǒng)發(fā)育分析[18]。

    這3類建樹方法由于各自的局限性均有可能導致系統(tǒng)產(chǎn)生誤差,為了避免誤差的影響,本研究同時采用3種方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹以綜合分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明,3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,雖然由ML法構(gòu)建的發(fā)育樹中,Lysinibacillus sphaericus單獨作為外群與其他2種方法不同,但是B59菌株與Bacillus cereus都聚為一支,且置信度較高,均為100%,說明本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是可信的,與郭青云等的研究結(jié)果[19]一致。因此,將B59菌株歸為B. cereus,B. cereus能產(chǎn)生多種化合物如溶血素、脂肽類抗菌物質(zhì)、多烯類物質(zhì)及氨基糖苷等物質(zhì),這些物質(zhì)對多數(shù)細菌、病毒、真菌及蟲體有毒性作用,這可能是釘螺致死的主要原因[ 20-22]。然而,目前有極少研究報道B. cereus具有滅螺活性,其具體的滅螺活性物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)、純化等有待進一步研究。

    4 結(jié)論

    采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增得到B59菌株的16S rDNA序列,運用ContigExpress軟件進行序列拼接,該序列長度為1 490 bp,運用NJ、MP及ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,B59菌株與Bacillus cereus的親緣關(guān)系最近,聚為一支,相似度達100%。

    參考文獻:

    [1] Cui G Y,Wang S P,Cheng H B,et al. Screening of microorganisms against Oncomelania hupensis and assessing the molluscicidal efficacy[J]. Microbiology China,2015,42(6):1060-1066.

    [2]Dai J R,Li Y Z,Wang F,et al. Sensitivity of Oncomelania hupensis to niclosamidea nation-wide survey in China[J]. International Journal of Environmental Research,2014,11(3):3086-3096.

    [3]Manus D P,Gray D J,Li Y S,et al. Schistosomiasis in the Peoples Republic of China:the era of the three gorges dam[J]. Clinical Microbiology Review,2010,23(2):442-466.

    [4]McManus D P,Gray D J,Ross A G,et al. Schistosomiasis research in the dongting lake region and its impact on local and national treatment and control in China[J]. PLoS Neglected Tropical Diseases,2011,5(8):e1053.

    [5]李石柱,鄭 浩,高 婧,等. 2012年全國血吸蟲病疫情通報[J]. 中國血吸蟲病防治雜志,2013,25(6):557-563.

    [6]Zhou X N,Bergquist R,Leonardo L,et al. Schistosomiasis japonica:control and research need[J]. Advance in Parasitology,2010,72:145-178.

    [7]Yang F,Long E,Wen J H,et al. Linalool,derived from Cinnamomum camphora (L.) Presl leaf extracts,possesses molluscicidal activity against Oncomelania hupensis and inhibits infection of Schistosoma japonicum[J]. Parasites & Vectors,2014,7(1):1-13.

    [8]Guo D Z,Chen J,Liu Y D,et al. A high-performance molluscicidal ingredientagainstOncomelania hupensis produced by a rhizospheric strain from Phytolacca acinosa Roxb[J]. Pharmacognosy Magazine,2011,7(28):277-283.

    [9]Rottava I,Toniazzo G,Cortina P F,et al. Screening of microorganisms for bioconversion of (-)β-pinene and R-(+)-limonene to α-terpineol[J]. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie,2010,43(7):1128-1131.

    [10]崔國艷,汪世平,程紅兵,等. 滅釘螺微生物的篩選及功效研究[J]. 中國人獸共患病學報,2015,31(2):109-112.

    [11]Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al. MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

    [12]曾 靜,竇岳坦,王 磊,等. 新疆地區(qū)鹽湖的中度嗜鹽菌16S rDNA全序列及DNA同源性分析[J]. 微生物學報,2002,42(2):133-137.

    [13]李 琬,李 璐,李景鵬,等. 三株田間分離大豆根瘤菌16S rDNA基因鑒定及序列比較[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(6):725-728.

    [14]Hugenholtz P,Huber T. Chimeric 16S rDNA sequences of diverse origin are accumulating in the public databases[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2003,53(1):289-293.

    [15]殷婷婷,薛夢穎,丁麗燕,等. 嗜鹽細菌XJ12的分子鑒定與生長特性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2013,41(11):368-370.

    [16]Sridhar S,Lam F,Blelloh G E,et al. Direct maximum parsimony phylogeny reconstruction from genotype data[J]. BMC Bioinformatics,2007,8(1):472-486.

    [17]Foulds L R,Graham R L. The Steiner problem in phylogeny is NP-complete[J]. Advances in Applied Mathematics,1982,3(1):43-49.

    [18]張麗娜,榮昌鶴,何 遠,等. 常用系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建算法和軟件鳥瞰[J]. 動物學研究,2013,34(6):640-650.

    [19]郭青云,郭道義,李永東,等. 幾種殺螺細菌的篩選與功效研究[J]. 生物學雜志,2009,26(2):31-34.

    [20]Ramarao N,Sanchis V. The pore-forming haemolysins of Bacillus cereus:a review[J]. Toxins,2013,5(6):1119-1139.

    [21]Reis A L S,Montanhini M,Bittencourt J V M,et al. Gene detection and toxin production evaluation of hemolysin BL of Bacillus cereus isolated from milk and dairy products marketed in Brazil[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2013,44(4):1195-1198.

    [22]Hamdache A,Lamarti A,Aleu J,et al. Non-peptide metabolites from the genus Bacillus[J]. Journal of Natural Products,2011,74(4):893-899.尚秋萍,黃 林,胡雨薇,等. 牦牛和犏牛睪丸中泛素結(jié)合酶基因Ube2n、泛素連接酶基因Trim36表達水平的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2017,45(1):19-21.

    猜你喜歡
    釘螺血吸蟲病引物
    DNA引物合成起始的分子基礎
    高中生物學PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    生物學通報(2022年1期)2022-11-22 08:12:18
    2020年洪澇災害后湖北省釘螺擴散情況調(diào)查
    2016—2021年池州市貴池區(qū)新發(fā)和復現(xiàn)釘螺情況分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    肉牛血吸蟲病的臨床癥狀、剖檢變化、診斷及防治
    一種快速鑒別湖北釘螺(Oncomelania hupensis)雌雄性的方法
    我省舉辦家畜血吸蟲病監(jiān)測點培訓班
    牛血吸蟲病的流行與診治
    火炬松SSR-PCR反應體系的建立及引物篩選
    美女内射精品一级片tv| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人免费观看视频高清| 久久久久久九九精品二区国产| 日本wwww免费看| 黑人猛操日本美女一级片| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 能在线免费看毛片的网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久国产乱子免费精品| 色网站视频免费| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩人妻高清精品专区| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩精品有码人妻一区| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产亚洲91精品色在线| 插阴视频在线观看视频| 一个人免费看片子| 亚洲国产日韩一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 最近的中文字幕免费完整| 欧美97在线视频| 免费观看在线日韩| 亚洲内射少妇av| 亚洲国产色片| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品视频女| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 简卡轻食公司| 免费看不卡的av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品色激情综合| 在线观看国产h片| 丰满乱子伦码专区| 久久久成人免费电影| 高清黄色对白视频在线免费看 | 在现免费观看毛片| 亚洲欧美精品专区久久| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 不卡视频在线观看欧美| 精品国产三级普通话版| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产高清不卡午夜福利| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品久久久精品久久久| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av日韩在线播放| 国产一区亚洲一区在线观看| 老司机影院成人| 在线观看一区二区三区激情| 22中文网久久字幕| 欧美一区二区亚洲| 一级av片app| 在线精品无人区一区二区三 | 日日啪夜夜爽| 人体艺术视频欧美日本| 九色成人免费人妻av| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩电影二区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 夫妻午夜视频| 久久人人爽人人片av| 97超碰精品成人国产| freevideosex欧美| av在线播放精品| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美成人a在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| h日本视频在线播放| 亚洲国产av新网站| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品视频人人做人人爽| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久ye,这里只有精品| 99热这里只有是精品在线观看| kizo精华| 亚洲av成人精品一二三区| 97热精品久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品人妻久久久影院| 在现免费观看毛片| 伦精品一区二区三区| 日韩中字成人| 日韩在线高清观看一区二区三区| av免费在线看不卡| 舔av片在线| 五月天丁香电影| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品一二三| 免费观看av网站的网址| 国产精品偷伦视频观看了| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲成人手机| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产精品国产精品| 麻豆成人av视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品乱久久久久久| 99热6这里只有精品| 免费看av在线观看网站| 丰满少妇做爰视频| 国产美女午夜福利| 久久久久久久国产电影| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费看不卡的av| 三级经典国产精品| 国产成人一区二区在线| 永久网站在线| 黄片wwwwww| 一级a做视频免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美高清性xxxxhd video| 熟女av电影| 国产成人精品福利久久| 我的老师免费观看完整版| 搡女人真爽免费视频火全软件| av卡一久久| 在线观看人妻少妇| 91aial.com中文字幕在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 中国三级夫妇交换| 99热全是精品| 插逼视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 直男gayav资源| 制服丝袜香蕉在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av.在线天堂| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久亚洲国产成人精品v| 国产一区二区在线观看日韩| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产在线男女| 精品久久久久久久久亚洲| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲三级黄色毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 婷婷色综合www| 秋霞伦理黄片| 亚洲熟女精品中文字幕| 成年人午夜在线观看视频| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇人妻 视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久99热这里只有精品18| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久99热6这里只有精品| av福利片在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品熟女少妇av免费看| 欧美性感艳星| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | videos熟女内射| 在线看a的网站| 青青草视频在线视频观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| av在线观看视频网站免费| 美女福利国产在线 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产在线免费精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品一二三区在线看| 黑丝袜美女国产一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 中文字幕制服av| 亚洲av日韩在线播放| 在线播放无遮挡| 日韩中字成人| 人妻系列 视频| 久久久久久久久久久免费av| 欧美一区二区亚洲| 免费少妇av软件| 亚洲欧美日韩无卡精品| 下体分泌物呈黄色| 久久久久国产网址| 国国产精品蜜臀av免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成人无遮挡网站| 欧美高清成人免费视频www| 日韩制服骚丝袜av| 如何舔出高潮| freevideosex欧美| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久婷婷青草| 国产熟女欧美一区二区| 精品一区二区免费观看| 久久ye,这里只有精品| 少妇熟女欧美另类| 赤兔流量卡办理| av福利片在线观看| av.在线天堂| 黄片无遮挡物在线观看| 久久99热这里只有精品18| 伦理电影免费视频| 少妇 在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品一区二区性色av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品一区二区三区视频在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 九草在线视频观看| 黄片wwwwww| 久久 成人 亚洲| 热re99久久精品国产66热6| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩欧美 国产精品| 少妇的逼好多水| 麻豆成人午夜福利视频| 九九爱精品视频在线观看| 三级经典国产精品| 少妇人妻久久综合中文| 国产黄片视频在线免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 伦精品一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 青青草视频在线视频观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 插逼视频在线观看| 国产综合精华液| 直男gayav资源| 亚洲欧美精品专区久久| 一级黄片播放器| 国产有黄有色有爽视频| 99久久综合免费| 亚洲性久久影院| 国产亚洲91精品色在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产一区二区三区av在线| 国产亚洲精品久久久com| 岛国毛片在线播放| 日本av手机在线免费观看| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人91sexporn| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久久久视频综合| 成人无遮挡网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品久久久久成人av| 人妻一区二区av| 少妇丰满av| 亚洲精品日本国产第一区| 国产毛片在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 99热这里只有是精品在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产亚洲最大av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品少妇久久久久久888优播| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲无线观看免费| 身体一侧抽搐| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品456在线播放app| 国产高清不卡午夜福利| 大码成人一级视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产一区二区三区综合在线观看 | av在线播放精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 2022亚洲国产成人精品| 欧美成人a在线观看| 97超碰精品成人国产| 日本午夜av视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 蜜桃在线观看..| 美女国产视频在线观看| 国产美女午夜福利| h日本视频在线播放| 亚洲av福利一区| 韩国av在线不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲国产精品一区三区| 久久久久久久久久久丰满| 女人久久www免费人成看片| 成人黄色视频免费在线看| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美3d第一页| 久久女婷五月综合色啪小说| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲熟女精品中文字幕| av国产久精品久网站免费入址| 国产成人a区在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 黄色怎么调成土黄色| 97在线人人人人妻| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 插阴视频在线观看视频| 全区人妻精品视频| 午夜福利影视在线免费观看| 高清午夜精品一区二区三区| 久久国内精品自在自线图片| 身体一侧抽搐| 国产 精品1| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 在线观看人妻少妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人a区在线观看| 日韩大片免费观看网站| 99热这里只有是精品50| 午夜激情久久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 大码成人一级视频| 男人添女人高潮全过程视频| 九色成人免费人妻av| 精品一区二区三卡| 男女边吃奶边做爰视频| 另类亚洲欧美激情| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产日韩一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品一区二区在线观看99| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品不卡视频一区二区| 97超视频在线观看视频| 能在线免费看毛片的网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 香蕉精品网在线| h日本视频在线播放| 国产成人精品婷婷| 一级av片app| 三级国产精品欧美在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产av码专区亚洲av| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久人妻| 亚洲成人av在线免费| 久久久国产一区二区| 内地一区二区视频在线| av在线蜜桃| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 久久99精品国语久久久| 国产在视频线精品| 麻豆成人av视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 婷婷色综合www| 欧美+日韩+精品| 精品午夜福利在线看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 我的老师免费观看完整版| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜日本视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 成年av动漫网址| 精品国产三级普通话版| av在线老鸭窝| 多毛熟女@视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 超碰av人人做人人爽久久| 国产在线视频一区二区| 大片免费播放器 马上看| 99精国产麻豆久久婷婷| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 热re99久久精品国产66热6| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕免费在线视频6| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品亚洲成国产av| 精品久久国产蜜桃| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 不卡视频在线观看欧美| 久久99热这里只频精品6学生| 国产在线免费精品| videossex国产| 亚洲电影在线观看av| 在现免费观看毛片| 男人舔奶头视频| 性色av一级| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩电影二区| 精品一区在线观看国产| 亚洲久久久国产精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人freesex在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久成人av| 国产高潮美女av| 久久人人爽人人片av| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产91av在线免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美国产精品一级二级三级 | 在线天堂最新版资源| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久国产一区二区| 蜜桃在线观看..| 最近中文字幕高清免费大全6| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大香蕉97超碰在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人国产麻豆网| 国产高清三级在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一个人看视频在线观看www免费| 天天躁日日操中文字幕| 国产免费一级a男人的天堂| 久久精品国产亚洲网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 又爽又黄a免费视频| 一级片'在线观看视频| 在线播放无遮挡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲成人av在线免费| 麻豆成人午夜福利视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 一个人免费看片子| 久久人人爽人人爽人人片va| 伦精品一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费观看在线日韩| 国产视频内射| 亚洲国产精品专区欧美| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 最近中文字幕2019免费版| a 毛片基地| 成人黄色视频免费在线看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女国产视频网站| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| av国产免费在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 伦理电影免费视频| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久精品性色| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 在线 av 中文字幕| 街头女战士在线观看网站| 国产乱人偷精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99re6热这里在线精品视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 91久久精品电影网| 亚洲精品456在线播放app| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| a级一级毛片免费在线观看| 久久97久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品一及| 亚洲精品一二三| 精品久久久久久久末码| 日韩av不卡免费在线播放| 极品教师在线视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻一区二区av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜日本视频在线| 久久久久久久久久久丰满| 国国产精品蜜臀av免费| 看十八女毛片水多多多| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久精品久久久久真实原创| h视频一区二区三区| 国产av国产精品国产| 我的老师免费观看完整版| 国产一级毛片在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲在久久综合| 国内精品宾馆在线| 深夜a级毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线天堂最新版资源| 韩国高清视频一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www | av天堂中文字幕网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产伦精品一区二区三区视频9| 青春草视频在线免费观看| 久久青草综合色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费看日本二区| 欧美精品国产亚洲| 黄色一级大片看看| 国产美女午夜福利| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇精品久久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 联通29元200g的流量卡| 国产精品免费大片| 成人综合一区亚洲| 五月玫瑰六月丁香| av在线老鸭窝| 日本av手机在线免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av不卡在线观看| 久久久国产一区二区| 亚洲中文av在线| 国产美女午夜福利| 少妇人妻久久综合中文| 国产伦理片在线播放av一区| 大香蕉97超碰在线| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一区二区三区免费毛片| 国产黄频视频在线观看| 精品久久久噜噜| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91久久精品电影网| 国产在线一区二区三区精| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 晚上一个人看的免费电影| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲经典国产精华液单| 99热全是精品| 亚洲精品色激情综合| www.av在线官网国产| 国产成人aa在线观看| 久久久久久伊人网av| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲美女视频黄频| 亚洲无线观看免费| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲美女视频黄频| 久久av网站| 在现免费观看毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品人妻久久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品国产av在线观看| 春色校园在线视频观看| 最黄视频免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久国内精品自在自线图片| 少妇丰满av| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品久久久久成人av| 99热国产这里只有精品6| 18+在线观看网站| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美成人精品一区二区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲欧洲国产日韩| 人妻一区二区av| 国产精品一区www在线观看| 十分钟在线观看高清视频www | 国产成人精品久久久久久| 内地一区二区视频在线| 欧美一区二区亚洲| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看|