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    不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油主要成分含量及抑菌活性研究

    2022-05-30 10:54:00陳海鷹左小明朱珊梅左晶
    關(guān)鍵詞:抑菌活性氣相色譜法

    陳海鷹 左小明 朱珊梅 左晶

    【摘 要】 目的:考察蒸餾時(shí)間對(duì)香薷揮發(fā)油的主要成分含量及抑菌活性的影響。方法:氣相色譜法測(cè)定不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油中主要成分麝香草酚和香荊芥酚的含量,紙片法和肉湯稀釋法比較不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的抑菌作用。結(jié)果:隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng),香薷揮發(fā)油的提取率不斷升高。不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油中麝香草酚的含量無(wú)顯著性差異。蒸餾時(shí)間1 h的香薷揮發(fā)油中香荊芥酚的含量低于其他蒸餾時(shí)間(P<0.05)。不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的抑菌作用無(wú)顯著性差異。結(jié)論:建立的氣相色譜法可用于測(cè)定香薷揮發(fā)油中麝香草酚和香荊芥酚的含量,蒸餾時(shí)間對(duì)香薷揮發(fā)油的提取率有顯著影響,但對(duì)主要成分的含量和抑菌活性的影響較小。

    【關(guān)鍵詞】 香薷揮發(fā)油;蒸餾時(shí)間;麝香草酚;香荊芥酚;氣相色譜法;抑菌活性

    【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517(2022)17-0032-05

    Study on Contents of Main Compotents of Moslae Herba Volatile Oil at Different Distillation Time and their Antibacterial Activity

    CHEN Haiying1 ZUO Xiaoming1 ZHU Shanmei1 ZUO Jing2*

    1.Department of Pharmacy, the Third Peoples Hospital of Changzhou,Changzhou 213000,China;2.Department of Emergency, the Third Peoples Hospital of Changzhou, Changzhou 213000, China

    Abstract:Objective To investigate the effect of different distillation time on the contents of main compotents and the antibacterial activity of Moslae Herba volatile oil.Methods GC was applied to determinate the contents of main compotents of Moslae Herba volatile oil at different distillation time. Disk diffusion method and broth double dilution method were used to compare the antibacterial activity.Results With the extension of distillation time, the extraction yield of Moslae Herba volatile oil increased. There was no significant difference in the contents of thymol of Moslae Herba volatile oil from different distillation time. The contents of carvacrol of Moslae Herba volatile oils which were extracted for 1 h were significantly lower than volatile oils from other distillation time(P<0.05). There was no significant difference in the antibacterial activity of Moslae Herba volatile oil from different distillation time.Conclusion The GC method can be used to determinate the contents of thymol and carvacrol of Moslae Herba volatile oil. Distillation time had significant effect on the extraction yield,? but and had slight effect on the contents of main compotents and antibacterial activity of Moslae Herba volatile oil.

    Key words:Moslae Herba Volatile Oil; Distillation Time; Thymol; Carvacrol; GC; Antibacterial Activity

    香薷為唇形科植物石香薷Mosla chinensis Maxim.或江香薷M.chinensis ‘Jiangxiangru的干燥地上部分,具有發(fā)汗解表,化濕和中的功效[1]。揮發(fā)油是香薷的主要藥效部位,具有廣譜的抗菌作用 [2-3],可作為抗菌防疫產(chǎn)品的原料。李艷秋等[4]將香薷揮發(fā)油制成了納米乳噴霧劑,具有良好的抗菌作用。

    水蒸氣蒸餾法是提取揮發(fā)油最常用的方法,蒸餾時(shí)間是影響揮發(fā)油成分、含量和藥理作用的重要因素,鄒月等[5]發(fā)現(xiàn)不同蒸餾時(shí)間艷山姜、芳樟葉中揮發(fā)油的得率、化學(xué)成分及含量具有差異性,何金明等[6]發(fā)現(xiàn)不同蒸餾時(shí)段的迷迭香精油的抗氧化能力具有較大的影響。香薷揮發(fā)油的提取率與蒸餾時(shí)間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系已有學(xué)者研究[7],然而不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油化學(xué)成分和藥理作用有無(wú)差異尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究對(duì)不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油主要成分麝香草酚和香荊芥酚的含量和不同蒸餾時(shí)間制得的香薷揮發(fā)油的抑菌活性進(jìn)行了研究,以期為以抑菌活性為導(dǎo)向的香薷揮發(fā)油提取工藝的研究提供參考。

    1 材料與儀器

    1.1 材料與試劑 香薷飲片(產(chǎn)地:湖南邵陽(yáng);批號(hào):200817),購(gòu)自安徽亳州市永剛飲片廠有限公司,經(jīng)常州市第三人民醫(yī)院范正達(dá)主任中藥師鑒定為唇形科香薷(江香薷M.chinensis ‘Jiangxiangru)

    的干燥地上部分。無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇分析純,購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。MH瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):201109)、MH肉湯培養(yǎng)基(批號(hào):181116),購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司。麝香草酚(含量為99.9%,批號(hào)100508-201603)、香荊芥酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%,批號(hào)111691-201704)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。大腸埃希菌(Escherichiacoli)[ATCC25922]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[ATCC29213]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[ATCC27853],由常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。

    1.2 儀器 揮發(fā)油測(cè)定器(上海建強(qiáng)玻璃儀器有限公司)、ZNHW控溫電熱套(上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)、SW-CJ-1A水平層流凈化工作臺(tái)(吳江市凈化設(shè)備總廠)、GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)、電子比濁儀DensiCHEK Plus(生物梅里埃美國(guó)股份有限公司)、XP105電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、Agilent7890B氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的提取 精密稱取香薷飲片5份,每份100 g,精密稱定,按照《中國(guó)藥典》2020年版四部“揮發(fā)油測(cè)定方法”提取揮發(fā)油,分別保持微沸1h、2h、3h、4h、5h后停止蒸餾,收集油水混合物,用正己烷萃取揮發(fā)油3次,每次5mL,合并萃取液,加入適量無(wú)水硫酸鈉脫水,2~8℃靜置24h后過(guò)濾,減壓除去正己烷,精密稱定揮發(fā)油的重量,計(jì)算香薷揮發(fā)油提取率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。香薷揮發(fā)油提取率(%)= 香薷揮發(fā)油重量(g)/香薷藥材重量(g)×100%。

    2.2 GC法測(cè)定香薷揮發(fā)油中麝香草酚與香荊芥酚的含量

    2.2.1 色譜條件 PEG-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.32 μm);載氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%),分流進(jìn)樣,分流比10∶1,進(jìn)樣口250℃,進(jìn)樣量1μL。程序升溫:初始柱溫70℃,保持1 min,以20℃·min-1升至210℃,保持10min,再以20℃·min-1升至250 ℃,保持3 min。FID檢測(cè)器溫度250 ℃,空氣流量400 mL·min-1,氫氣流量40 mL·min-1,尾吹氣流量25 mL·min-1,色譜柱流量1 mL·min-1。

    2.2.2 溶液的配制 精密稱取麝香草酚對(duì)照品50.35 mg,香荊芥酚12.27 mg,置于5 mL容量瓶中,加入無(wú)水乙醇使溶解,定容至刻度,搖勻,配成麝香草酚濃度為10.07 mg·mL-1、香荊芥酚濃度為2.454 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,用無(wú)水乙醇稀釋,制得麝香草酚和香荊芥酚濃度分別為125.9 μg·mL-1、30.67 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密稱取香薷揮發(fā)油9.84 mg,置于25 mL容量瓶中,加入無(wú)水乙醇使溶解,定容至刻度,搖勻,得供試品溶液。

    2.2.3 專屬性 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液及空白溶劑無(wú)水乙醇,分別按上述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,供試品色譜圖中,在與對(duì)照品色譜圖相同保留時(shí)間處有色譜峰,且與相鄰色譜峰之間分離較好,溶劑無(wú)水乙醇對(duì)其無(wú)干擾。理論塔板數(shù)按麝香草酚和香荊芥酚計(jì)均大于10000,麝香草酚和香荊芥酚分離度大于1.5。如圖1所示。

    2.2.4 線性與范圍考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇稀釋,制成麝香草酚濃度分別為503.5μg·mL-1、251.5μg·mL-1、125.7μg·mL-1、62.87μg·mL-1、31.44 μg·mL-1,香荊芥酚濃度分別為122.7μg·mL-1、61.35μg·mL-1、30.67μg·mL-1、15.34μg·mL-1、7.669 μg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液和稀釋后的各濃度對(duì)照品溶液1 μL,按照“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣,記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間和峰面積,以濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸。結(jié)果麝香草酚的回歸方程為Y =1.559X +0.763,相關(guān)系數(shù)r =0.9999,線性范圍為31.44~1007 μg·mL-1;香荊芥酚的回歸方程為Y=1.539X+0.545,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,線性范圍為7.669~245.4 μg·mL-1。

    2.2.5 精密度考察 取“2.2.2”中混合對(duì)照品溶液,按上述的色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間、峰面積。結(jié)果麝香草酚峰面積RSD為0.989%,香荊芥酚峰面積RSD為1.056%,說(shuō)明該儀器的精密度良好。

    2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份香薷揮發(fā)油平行制備6份供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間、峰面積,結(jié)合稱樣量計(jì)算供試品中麝香草酚和香荊芥酚的含量。結(jié)果6份供試品中麝香草酚含量的RSD為0.716%, 6份供試品中香荊芥酚含量的RSD為0.717%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性較好。

    2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,按上述色譜條件,分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24h進(jìn)樣,記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間、峰面積。結(jié)果麝香草酚峰面積的RSD為0.903%,香荊芥酚峰面積的RSD為0.914%,說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取香薷揮發(fā)油(麝香草酚含量為63.69%,香荊芥酚含量為13.67%)約7 mg,置于25 mL容量瓶中,加入混合對(duì)照品溶液(麝香草酚和香荊芥酚濃度分別為4.379 mg·mL-1、0.988 mg·mL-1)1 mL,加入無(wú)水乙醇使溶解,定容至刻度,搖勻,平行制備6份,按上述色譜條件記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間、峰面積,計(jì)算回收率。結(jié)果見表1,結(jié)果表明麝香草酚和香荊芥酚的加樣回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。

    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.4 不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油中麝香草酚與香荊芥酚的含量 精密稱取不同蒸餾時(shí)間的香薷揮發(fā)油10mg,置25 mL容量瓶中,加入無(wú)水乙醇使溶解,定容至刻度,搖勻,平行制備3份,按上述色譜條件記錄麝香草酚和香荊芥酚的保留時(shí)間、峰面積,計(jì)算不同供試品中麝香草酚和香荊芥酚的含量,結(jié)果見表2。由表2可看出,隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng),香薷揮發(fā)油的提取率不斷上升,各蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的提取率具有顯著性差異(P<0.05)。然而,各蒸餾時(shí)間所得香薷揮發(fā)油中麝香草酚含量無(wú)顯著性差異;蒸餾時(shí)間為2 h、3 h、4 h、5 h的香薷揮發(fā)油中香荊芥酚含量無(wú)顯著性差異,但高于蒸餾時(shí)間1 h的香薷揮發(fā)油(P<0.05)。

    2.5 不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的抑菌活性

    2.5.1? K-B紙片法測(cè)定不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的抑菌圈直徑 用0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液制備含不同菌株的MH平板,將無(wú)菌的空白藥敏紙片貼于平板表面,分別滴加5 μL不同蒸餾時(shí)間的香薷揮發(fā)油,33 ℃倒置培養(yǎng)24 h,十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次,取平均值,結(jié)果如圖2和表3所示。由結(jié)果看出,不同蒸餾時(shí)間所得香薷揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑均無(wú)顯著性差異,相同蒸餾時(shí)間的香薷揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑明顯大于對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑(P<0.05),相同蒸餾時(shí)間的香薷揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑無(wú)顯著性差異。

    2.5.2 肉湯稀釋法測(cè)定不同蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度(MIC) 分別取不同蒸餾時(shí)間的香薷揮發(fā)油適量,加入無(wú)水乙醇溶解,制成128 mg·mL-1的儲(chǔ)備液,過(guò)濾除菌。用MH液體培養(yǎng)基將其稀釋為640 μg·mL-1、320 μg·mL-1、160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1系列濃度。將0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液稀釋100倍,取100 μL菌液分別加入各濃度香薷揮發(fā)油溶液中。33 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察并記錄各蒸餾時(shí)間各濃度揮發(fā)油的生長(zhǎng)情況,與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行比較,記錄揮發(fā)油的MIC,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC均在160~320 μg·mL-1,對(duì)銅綠假單胞菌的MIC均在320~640 μg·mL-1。

    3 討論

    3.1 檢測(cè)成分的選擇 麝香草酚和香荊芥酚是香薷揮發(fā)油的主要成分[8],具有較強(qiáng)的抑菌作用[9-10],姚奕等[11]建議將兩者作為香薷的質(zhì)量標(biāo)志物?!吨袊?guó)藥典》2020年版一部對(duì)香薷藥材中揮發(fā)油的總量進(jìn)行了控制,但未對(duì)香薷揮發(fā)油中麝香草酚和香荊芥酚的含量進(jìn)行測(cè)定,故課題組建立了香薷揮發(fā)油中麝香草酚、香荊芥酚的快速測(cè)定方法,以期為進(jìn)一步控制香薷揮發(fā)油的質(zhì)量提供參考。

    3.2 色譜條件的選擇 課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]采用弱極性的Hp-5毛細(xì)管色譜柱測(cè)定了香薷揮發(fā)油中麝香草酚和香荊芥酚的含量,但在改變柱溫、流速、流量后麝香草酚和香荊芥酚的分離度仍達(dá)不到要求,考慮到麝香草酚和香荊芥酚含有酚羥基結(jié)構(gòu),采用極性的PEG-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱后麝香草酚、香荊芥酚及周圍峰分離完全。此外,參考《中國(guó)藥典》2020年版一部香薷藥材中麝香草酚和香荊芥酚的含量測(cè)定方法,將柱溫設(shè)為190 ℃時(shí),麝香草酚和香荊芥酚色譜峰較寬、柱效低、峰形差、基于此筆者采用程序升溫的方法對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。初始柱溫設(shè)為70 ℃,保持1 min,以降低溶劑效應(yīng);升溫速度設(shè)為20℃·min-1,升至210 ℃后保持10 min,使得麝香草酚和香荊芥酚在恒溫平臺(tái)期出峰,減少其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    3.3 麝香草酚和香荊芥酚含量對(duì)香薷揮發(fā)油抑菌活性的影響 李知敏等[2]曾測(cè)定江香薷揮發(fā)油和江香薷揮發(fā)油中麝香草酚、香荊芥酚、麝香草酚乙酸酯、對(duì)具傘花素等8個(gè)主要成分的單體對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC,研究發(fā)現(xiàn),只有麝香草酚、香荊芥酚和麝香草酚乙酸酯的MIC小于江香薷揮發(fā)油的MIC。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各蒸餾時(shí)間所得香薷揮發(fā)油中麝香草酚的含量均達(dá)60%以上,香荊芥酚的含量達(dá)12%以上,蒸餾時(shí)間為2 h、3 h、4 h、5 h的香薷揮發(fā)油中麝香草酚和香荊芥酚含量無(wú)顯著性差異,香荊芥酚的含量略高于蒸餾時(shí)間1 h,各蒸餾時(shí)間香薷揮發(fā)油的抑菌活性無(wú)顯著性差異。據(jù)此,課題組推測(cè)麝香草酚和香荊芥酚的含量對(duì)香薷揮發(fā)油的抑菌活性具有重要影響,具體影響作用有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

    綜上所述,麝香草酚和香荊芥酚可作為香薷揮發(fā)油質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分,二者的含量可能對(duì)香薷揮發(fā)油的抑菌活性具有重要影響。蒸餾時(shí)間對(duì)香薷揮發(fā)油的提取率有顯著影響,但對(duì)麝香草酚和香荊芥酚的含量和抑菌活性的影響較小。本次研究可為以抑菌活性為導(dǎo)向的香薷揮發(fā)油提取工藝的研究提供參考。

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    [13]裴香萍,裴妙榮,李慧峰,等. 氣相色譜法測(cè)定山西產(chǎn)地椒中麝香草酚及香荊芥酚的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(14):132-134.

    [14]江歲. 石香薷生長(zhǎng)分析與揮發(fā)油提取純化工藝研究[D]. 長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

    (收稿日期:2021-12-16 編輯:劉 斌)

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