PCL-羧基殼聚糖納米纖維膜對小鼠創(chuàng)面愈合影響

李軍,何才,康恩豪,曾滿芹,陳振雨

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 美容整形外科； 2 病理科)

創(chuàng)面的愈合是一個極為復(fù)雜而持續(xù)的病理生理過程，維持創(chuàng)面濕潤、透氣、無菌的微環(huán)境是創(chuàng)面良好愈合的基礎(chǔ)條件。既往創(chuàng)面處理多采用清創(chuàng)換藥聯(lián)合植皮術(shù)或局部皮瓣/肌瓣/筋膜瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)術(shù)，但手術(shù)治療方法的實施需要具備臨床技術(shù)基礎(chǔ)及外科手術(shù)條件，且手術(shù)治療影響外觀并可引起功能障礙[1]。敷料作為創(chuàng)面治療的重要工具，在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著巨大的作用。許多研究已經(jīng)報道了使用各種技術(shù)制造納米纖維合成高分子材料類敷料，例如靜電紡絲[2]。靜電紡絲技術(shù)是一種簡單、廉價且用途廣泛的紡絲方法，作為組織工程應(yīng)用的潛在生物技術(shù)已引起廣泛的興趣[3-4]。本實驗旨在觀察評估利用靜電紡絲技術(shù)制備的聚己內(nèi)酯(PCL)-羧基殼聚糖混紡納米纖維膜在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中的作用，以探尋一種使用安全、成本低廉的促進(jìn)傷口愈合及預(yù)防感染發(fā)生的組織工程材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康c57小鼠15只，6周齡，體質(zhì)量(20±1)g，雌雄不限，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜 由青島大學(xué)紡織學(xué)院制備，PCL與羧基殼聚糖的配比約為1∶4。

1.2 實驗方法

1.2.1傷口造模 每只小鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉，劑量為35 mg/kg，待小鼠麻醉效果滿意后將其固定于操作臺上。用刮毛器將背部鼠毛刮凈，用標(biāo)記筆在小鼠后背標(biāo)記2個在脊柱兩側(cè)對稱分布的1 cm×1 cm大小正方形創(chuàng)面，以碘附消毒3次后，沿標(biāo)記線剪除2個創(chuàng)面內(nèi)全層皮膚組織，至深筋膜層，止血，制成機(jī)械性損傷動物模型。

1.2.2創(chuàng)面處理 以小鼠脊柱左側(cè)創(chuàng)面為實驗組，脊柱右側(cè)創(chuàng)面為對照組。實驗組用滅菌后的PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜覆蓋創(chuàng)面，對照組用普通無菌紗布覆蓋。

1.2.3傷口愈合情況監(jiān)測 于造模后3、7、13 d對小鼠創(chuàng)面進(jìn)行拍照處理，用Photoshop CS7軟件對圖片進(jìn)行分析，確定實驗組及對照組愈合及未愈合面積，利用像素計量方法計算傷口面積變化。

1.2.4愈合傷口組織的病理學(xué)觀察 造模后14 d切取兩組小鼠傷口愈合處組織，將切取的組織浸入40 g/L中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片。組織切片經(jīng)脫蠟水化后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肉芽組織形成情況。觀察指標(biāo)包括：皮膚附屬器、毛囊及新生毛細(xì)血管；膠原沉積及排列；細(xì)胞層次；炎細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面面積比較

兩組小鼠術(shù)后1周內(nèi)創(chuàng)面面積均縮小，但變化幅度不大；造模后13 d時，傷口面積減小到很小。實驗組創(chuàng)面的愈合能力強(qiáng)于對照組，其創(chuàng)面面積明顯縮小的快，愈合明顯；造模后13 d，實驗組小鼠創(chuàng)面基本愈合，而對照組則未完全愈合。兩因素重復(fù)測量方差分析顯示，兩組小鼠造模后3、7、13 d創(chuàng)面未愈合面積均逐漸變小，不同時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10 534.901、15 559.614，P<0.01)；與對照組相比較，實驗組小鼠在造模后3、7、13 d時的創(chuàng)面未愈合面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=157.500～840.000，P<0.01)。見表1。

2.2 病理學(xué)觀察

2.2.1大體觀察 造模后3 d：兩組創(chuàng)面面積均較大，創(chuàng)面顏色紅、收縮，創(chuàng)腔可見肉芽組織，創(chuàng)緣新生上皮組織生長較明顯，實驗組創(chuàng)面PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜覆蓋完好，對照組可見較大結(jié)痂。造模后7 d：兩組創(chuàng)面顏色深紅、收縮，創(chuàng)腔被肉芽組織填平，創(chuàng)緣新生上皮組織生長明顯，創(chuàng)緣可見瘢痕組織形成，實驗組創(chuàng)面PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜覆蓋完好，對照組結(jié)痂較前縮小。造模后13 d：兩組創(chuàng)面顏色淺紅，創(chuàng)面上皮化明顯，實驗組PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜脫落，創(chuàng)面表面閉合、收縮良好，對照組結(jié)痂脫落，創(chuàng)面表面基本閉合，創(chuàng)面收縮較實驗組差。造模后兩組創(chuàng)面均未出現(xiàn)皮膚紅斑和水腫反應(yīng)，未見局部充血、腫脹及壞死等刺激反應(yīng)。見圖1。

2.2.2光鏡下觀察 HE染色顯示，實驗組創(chuàng)面新生皮膚組織，皮膚表皮層菲薄，真皮層增厚，內(nèi)見大量皮膚附屬器、毛囊及新生毛細(xì)血管，皮下纖維結(jié)締組織增生并膠原化，排列尚整齊，膠原沉積較多且排列規(guī)則、有序，細(xì)胞層次較對照組多，炎細(xì)胞比例約為20%；對照組創(chuàng)面新生皮膚組織，皮膚表皮及真皮層尚可，未見明顯皮膚附屬器及毛囊，可見小血管增生，皮下纖維結(jié)締組織增生及膠原化不明顯，排列紊亂，內(nèi)有較多慢性炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞層次較實驗組少且雜亂，炎細(xì)胞比例約為35%。見圖2。

表1 兩組小鼠造模后不同時間皮膚創(chuàng)面未愈合面積比較(n=15，A/cm2)

3 討 論

創(chuàng)面的治療常因保護(hù)不足導(dǎo)致愈合速度慢、愈合質(zhì)量差等問題，因此保護(hù)創(chuàng)面是其臨床治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。敷料作為阻絕外界病原菌、營造創(chuàng)面組織細(xì)胞生長所需微環(huán)境的重要工具，一直以來都是創(chuàng)面修復(fù)的重要武器[5]。

PCL是一種人工合成的線性脂肪族聚酯，不僅具有良好的生物相容性、可控的生物降解速度和優(yōu)良的力學(xué)性能,而且其可塑性好、成本低廉[6-8]。利用靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)的PCL納米纖維膜敷料具有比表面積大、疏松多孔、柔韌抗拉、可生物降解、無細(xì)胞毒性等諸多特點(diǎn)[9]。但是，PCL的疏水作用使得PCL納米纖維膜無法有效吸收創(chuàng)面滲液，可以導(dǎo)致創(chuàng)面滲液的聚集及感染風(fēng)險的增加[10]。近年來因為抗生素的濫用使很多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，而天然抗菌物質(zhì)的使用可以有效降低抗生素的濫用率[11]。殼聚糖，又名甲殼胺，是自然界中具有良好抗菌性能的天然聚合物[12-14]。然而，殼聚糖因其分子內(nèi)存在大量的NH2基團(tuán)使其在水中溶解度差，故靜電紡絲過程中殼聚糖的溶解需要大量具有細(xì)胞毒性和生物刺激性的酸性溶劑的輔助[15-16]。為解決此問題，我們在殼聚糖分子內(nèi)引入-COOH形成羧基殼聚糖，以提高殼聚糖在水溶液中的溶解度，使殼聚糖在靜電紡絲過程中形成靜電紡絲溶液時不再需要以酸性溶液作為媒介，克服了傳統(tǒng)酸性溶媒體系存在的細(xì)胞刺激性及毒性問題[16-19]。我們制備的PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜既能有效阻隔外界微生物入侵，又能在創(chuàng)面形成濕潤、透氣的微環(huán)境，羧基殼聚糖等的加入進(jìn)一步賦予了電紡纖維膜親水、抗菌等特性，而且PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜內(nèi)部纖維間孔隙小于組織細(xì)胞直徑，能有效避免應(yīng)用傳統(tǒng)敷料時組織細(xì)胞長入敷料網(wǎng)眼內(nèi)造成換藥時創(chuàng)面疼痛和組織損傷。

A、B、C分別表示兩組小鼠術(shù)后3、7、13 d時的創(chuàng)面愈合情況。

A：實驗組，B：對照組；HE染色，100倍。

本實驗結(jié)果表明，PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜相對于傳統(tǒng)紗布敷料，促進(jìn)創(chuàng)面愈合能力強(qiáng)，貼合性更好。究其原因可能是：①PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜覆蓋于創(chuàng)面能夠阻擋外來細(xì)菌感染；②PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜與創(chuàng)面貼合性好，有利于創(chuàng)面周圍組織細(xì)胞爬行愈合，從而加快創(chuàng)面愈合；③PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜具有一定透氣性，能夠保持創(chuàng)面愈合所需適宜濕潤環(huán)境；④PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜內(nèi)部纖維間孔隙小于組織細(xì)胞直徑，能有效避免應(yīng)用傳統(tǒng)敷料時組織細(xì)胞長入敷料網(wǎng)眼內(nèi)，在創(chuàng)面愈合后可自動脫落，避免二次損傷。

總之，本實驗通過構(gòu)建小鼠創(chuàng)面模型研究結(jié)果表明，PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜對于小鼠創(chuàng)面能起到很好的保護(hù)作用，有利于創(chuàng)面的愈合。本研究為臨床創(chuàng)面敷料的選擇與研發(fā)、減少抗生素的濫用提供了新思路。本實驗應(yīng)用的創(chuàng)面類型屬于機(jī)械性損傷創(chuàng)面，后續(xù)實驗可以檢測PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜對燒傷、糖尿病皮膚組織潰瘍等其他類型創(chuàng)面的影響；PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜應(yīng)用時未出現(xiàn)皮膚紅斑和水腫反應(yīng)等副作用，因此可將PCL-羧基殼聚糖靜電紡絲納米纖維膜作為基礎(chǔ)性載體敷料，加入可促進(jìn)創(chuàng)面愈合的物質(zhì)后再觀測其對于創(chuàng)面愈合的影響；后期還可對系列靜電紡絲納米纖維膜的生物相容性進(jìn)行綜合性檢測。