腦蛋白水解物-Ⅰ對PD小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

王悅,武筱林,任宇倩,馬曉晴，劉英娟

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合中心,山東 青島 266021)

帕金森病(PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，其病理特征是紋狀體中多巴胺含量降低及黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性，以肌強(qiáng)直、震顫、運(yùn)動遲緩和步態(tài)姿勢異常等運(yùn)動特征為主要臨床表現(xiàn)[1-3]。目前，臨床上PD的治療仍以補(bǔ)充外源性多巴胺類藥物和抑制乙酰膽堿能類藥物為主，但遠(yuǎn)期療效不十分理想。腦蛋白水解物-Ⅰ(CH-Ⅰ)是通過動物腦組織蛋白酶水解而獲得的多種氨基酸和低分子肽的混合物，其50%～80%的游離氨基酸可通過血-腦脊液屏障進(jìn)入腦神經(jīng)細(xì)胞，分子量低于10 000的小分子肽也可透過血-腦脊液屏障并影響呼吸鏈[4]。研究表明，腦蛋白水解物具有抗低氧作用，可改善腦細(xì)胞低氧癥狀，增強(qiáng)腦對低氧的耐受性；此外，CH-Ⅰ尚能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，使已損傷但未變性的神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)功能[5]。SUI等[6]的研究表明，腦蛋白水解物注射液可以通過下調(diào)半胱天冬酶分子表達(dá)減輕腦缺血再灌注損傷。有文獻(xiàn)報道，CH-Ⅰ對血管性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有較好的療效[7]。但CH-Ⅰ對PD的療效尚未見報道。因此，本研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)建立PD小鼠模型，并用CH-Ⅰ進(jìn)行干預(yù)，探討CH-Ⅰ對PD小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CH-Ⅰ注射液(#0190501-1，每支30 mg)為河北智同生物制藥股份有限公司產(chǎn)品；MPTP、甲苯胺藍(lán)購自Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)；單克隆抗體酪氨酸羥化酶(TH，#ab112)、神經(jīng)生長因子(NGF，#ab52918)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，#ab108319)、GAPDH(#ab8245)購自Abcam公司(Cambridge，USA)。成年健康雄性C57BL/6小鼠48只，8～10周齡，體質(zhì)量為25～30 g，由南京模式動物研究中心提供。

1.2 動物分組及處理

小鼠飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、濕度60%～70%的環(huán)境中，給予12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，可自由進(jìn)食。小鼠預(yù)適應(yīng)環(huán)境7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字法分為對照組(A組)、模型組(B組)、CH-Ⅰ 10 mg/kg組(C組)和CH-Ⅰ 20 mg/kg組(D組)，每組12只。除對照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余3組小鼠每天給予30 mg/kg的MPTP腹腔注射，連續(xù)7 d，誘導(dǎo)建立PD小鼠模型。通過爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)判定造模是否成功。然后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組以及CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠連續(xù)14 d給予對應(yīng)劑量的CH-Ⅰ腹腔注射，對照組及模型組小鼠注射等體積生理鹽水。動物的處理遵循青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會制定的實(shí)驗(yàn)動物福利原則。

1.3 行為學(xué)評價

全部小鼠給藥結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)評價。參考CAO等[8]報道的方法進(jìn)行懸掛實(shí)驗(yàn)。取一條棉線質(zhì)長繩，固定在離地面高約50 cm處，被測小鼠倒置懸掛，使小鼠前爪抓住繩子，觀察小鼠的行為：若小鼠用兩后爪抓繩，記為3分；單后爪抓繩，記為2分；后爪不抓繩，記為1分；掉落則記為0分。

1.4 免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，每組取6只小鼠，應(yīng)用100 mg/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，于冰上迅速開顱完整取腦，取出紋狀體，置-80 ℃保存。組織稱質(zhì)量后，按50 mL/g加入裂解液(50 mmol/L Tris、pH值7.4，150 mmol/L NaCl，10 g/L Triton X-100，10 g/L脫氧膽酸鈉，1 g/L SDS，原釩酸鈉，氟化鈉，EDTA以及亮肽素)，4 ℃勻漿研磨后，以12 000 r/min離心5 min，收集上清液。采用BCA試劑盒測定蛋白含量。加入上樣緩沖液(主要成分為SDS、DTT、溴酚藍(lán)、緩沖鹽溶液等)混勻，于100 ℃水浴中變性5 min，在100～150 g/L SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用50 g/L牛血清清蛋白作為封閉液，孵育2 h。然后加入兔抗TH(1∶1 000)、兔抗NGF(1∶1 000)、兔抗BDNF(1∶1 000)和兔抗GAPDH(1∶5 000)等一抗4 ℃過夜孵育，用TBST洗3次，每次10 min，再加入HRP-IgG二抗(1∶2 000)孵育。ECL顯影，將所有膠片進(jìn)行掃描，分析各條帶的光密度值。計算其他3組相對于對照組的目的蛋白表達(dá)量。

1.5 Nissl 染色觀察細(xì)胞損傷程度

采用Nissl染色法評估神經(jīng)元細(xì)胞死亡的程度[9-10]。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取6只小鼠，用100 g/L水合氯醛腹腔注射深度麻醉，以預(yù)冷生理鹽水20 mL灌流后，應(yīng)用40 g/L多聚甲醛灌注，至小鼠四肢變白、肝臟變硬。隨后取出小鼠整腦，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，自視交叉后連續(xù)冠狀切片，每隔3張抽取1張，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，加入10 g/L甲苯胺藍(lán)溶液，60 ℃孵育40 min。切片用蒸餾水洗滌3次，每次10 min，進(jìn)行乙醇分級脫水處理后，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞損傷程度。計算其他3組相對于對照組的染色細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CH-Ⅰ對PD小鼠行為學(xué)障礙的影響

模型組小鼠的機(jī)體協(xié)調(diào)性較對照組明顯減弱，經(jīng)CH-Ⅰ處理以后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠的肌肉力量得到恢復(fù)，機(jī)體協(xié)調(diào)性較模型組明顯改善(F=5.516，P<0.05)。而CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組行為學(xué)評分比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 CH-Ⅰ對PD小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

模型組小鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NGF和BDNF的表達(dá)均較對照組明顯降低，經(jīng)CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組小鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NGF和BDNF的表達(dá)較模型組明顯增加(F=44.110、26.567，P<0.01)。見圖1和表1。

2.3 CH-Ⅰ對PD小鼠TH表達(dá)的影響

模型組小鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TH的表達(dá)較對照組明顯降低，經(jīng)CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ 20 mg/kg組TH的表達(dá)較模型組明顯增加，特別是CH-Ⅰ 20 mg/kg組TH的表達(dá)增加尤為明顯(F=43.458，P<0.01)。提示CH-Ⅰ可以通過提高TH的表達(dá)而抑制PD進(jìn)展。見圖2和表1。

2.4 CH-Ⅰ對PD小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷程度的影響

紋狀體神經(jīng)元Nissl染色定量分析顯示，模型組Nissl染色細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，經(jīng)過CH-Ⅰ處理后，CH-Ⅰ 10 mg/kg組和CH-Ⅰ20 mg/kg組Nissl染色細(xì)胞數(shù)均較模型組明顯增加(F=121.066，P<0.01)。提示MPTP誘導(dǎo)了小鼠的神經(jīng)元丟失，而CH-Ⅰ可以抑制MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元丟失。見圖3和表1。

A：對照組；B：模型組；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg組；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg組。

A：對照組；B：模型組；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg組；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg組。

A：對照組；B：模型組；C：CH-Ⅰ 10 mg/kg組；D：CH-Ⅰ 20 mg/kg組。Nissl染色，200倍。

表1 各組小鼠不同觀察指標(biāo)的比較

3 討 論

PD是一種以紋狀體中多巴胺含量降低及黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于50歲及以上中老年人，給社會和經(jīng)濟(jì)都帶來嚴(yán)重影響。PD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，藥物治療是目前臨床治療PD的主要方法，但多為對癥治療及經(jīng)驗(yàn)性治療，可延緩病人病情發(fā)展、毒副作用少、療效長久的藥物比較缺乏，難以抑制和扭轉(zhuǎn)病人的神經(jīng)功能退行性病變。CH-Ⅰ是一種通過酶解動物腦蛋白獲得的低分子肽混合物，對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、血管性癡呆和急性腦梗死等，均具有顯著的治療效果，但它對PD影響的報道很少。有研究表明，CH-Ⅰ可加速葡萄糖通過血-腦脊液屏障的運(yùn)轉(zhuǎn)速度，改善腦能量供應(yīng)，增加腺苷酸環(huán)化酶的活性，催化其他激素系統(tǒng)，改善記憶功能[6,11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CH-Ⅰ干預(yù)后，MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的機(jī)體協(xié)調(diào)性得到明顯改善，提示CH-Ⅰ可能通過上述機(jī)制改善PD小鼠的神經(jīng)行為功能。

NGF是一種具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的維持均具有重要的調(diào)控作用[12]。BDNF是一種在大腦中合成的蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生存、分化、生長和發(fā)育起重要作用[13]。TH是多巴胺合成的限速酶，常被用作檢測多巴胺能神經(jīng)元完整性的標(biāo)志酶[14-15]。本研究應(yīng)用免疫印跡法檢測顯示，CH-Ⅰ可以顯著增加NGF、BDNF以及TH的表達(dá)水平，提示CH-Ⅰ可以通過提高PD小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子和TH的表達(dá)而抑制PD的病情進(jìn)展。

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位，尼氏小體(Nissl body)是神經(jīng)元的特征結(jié)構(gòu)之一，其主要功能是合成神經(jīng)活動所需要的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞某些組件更新和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶的生成[11]。本研究Nissl染色結(jié)果表明，CH-Ⅰ對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，可以抑制MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元丟失。觀察是否具有類似PD癥狀的小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，常被用作初步評價PD小鼠病情程度或藥物療效的方法。本研究采用懸掛實(shí)驗(yàn)評估結(jié)果也顯示，CH-Ⅰ可以顯著改善PD小鼠的行為障礙。

總之，CH-Ⅰ可以能通過增加NGF、BDNF以及TH的表達(dá)水平，抑制MPTP誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而改善PD小鼠的行為學(xué)障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。