丹參多酚酸鹽對心肌細胞氧化損傷模型大鼠的作用

高洪瑞,閆慧,潘洋,郝巖,李健

(青島大學,山東 青島 266071 1 醫(yī)學部； 2 附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類毒素，其中黃曲霉素B1(AFB1)毒性最大、危害最嚴重[1]，可對機體造成嚴重損害，包括致癌、致突變和肝臟損傷等[2]。AFB1的主要靶器官是肝臟[3]，但一些研究表明，AFB1也會導致嚴重的心臟損傷，其機制涉及線粒體損傷、活性氧(ROS)生成和細胞凋亡等[4-5]。丹參是一種傳統(tǒng)的中藥，具有活血化瘀之功效[6]，丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性有效活性部分，有很強的抗氧化、抗凋亡、內(nèi)皮保護和舒張血管等作用[7]，臨床上主要應用于冠心病的治療[8]。有研究表明，急性心肌梗死病人經(jīng)皮冠狀動脈介入治療圍術(shù)期靜脈輸注丹參多酚酸鹽可有效改善氧化應激反應，促進心功能恢復，增加心肌灌注量[9]。但丹參多酚酸鹽對AFB1誘導心肌細胞氧化損傷的影響鮮有報道。本文研究通過AFB1誘導大鼠心肌細胞(H9C2細胞)制備氧化損傷模型，評估丹參多酚酸鹽對H9C2細胞氧化應激損傷的保護作用，為丹參多酚酸鹽的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞及試劑

H9C2細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司；AFB1(百靈威科技有限公司，純度98%)；丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司，每瓶100 mg)；DMEM高糖培養(yǎng)液(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS，BI)；二甲基亞砜(DMSO)、5XTris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液均購自北京索萊寶公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、10×TBST均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；過氧化物歧化酶2(SOD2)抗體、過氧化氫酶(CAT)抗體(Anti-Catalase)均購自abcam公司;GAPDH(博奧森生物技術(shù)有限公司)；Anti-Rabbit IgG(H+L，Elabscience生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1H9C2細胞培養(yǎng) H9C2細胞置于含體積分數(shù)0.10的FBS和體積分數(shù)0.01青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細胞，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。實驗分為正常對照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細胞)、AFB1誘導模型組(在DMEM培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1)及低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預組(在培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1+濃度分別為5、20、40 mg/L丹參多酚酸鹽)。

1.2.2CCK-8法檢測細胞相對存活率 取對數(shù)生長期的H9C2細胞，消化、重懸、計數(shù)后，將細胞密度調(diào)整為5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜(15～18 h)，分組加藥。①設置正常對照組(H9C2細胞加入DMEM培養(yǎng)液)、DMSO組(DMEM培養(yǎng)液中加濃度2 g/L的DMSO)和AFB1組(AFB1終濃度分別為32、64、96、128、160、192 μmol/L), 以細胞存活率接近50%為最佳的藥物造模濃度；②設置正常對照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細胞)、不同濃度的丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽濃度分別為5、10、20、40、50、60 mg/L)，確定丹參多酚酸鹽的安全使用濃度；③設置正常對照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細胞)和最佳濃度(128 μmol/L)AFB1+丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽濃度分別為0、5、20、40 mg/L)。每組設置6個復孔。培養(yǎng)36 h后，吸除原培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μL(含有CCK-8試劑10 μL)的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育1.5 h后，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值，計算細胞相對存活率。細胞相對存活率(%)=(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.2.3細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期的H9C2細胞，消化、重懸、計數(shù)后，將細胞密度調(diào)整為1.5×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后待細胞長到70%～80%融合，吸去細胞上清液，按照“1.2.1”方法分組及處理36 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學變化。

1.2.4DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)ROS水平 取對數(shù)期生長的H9C2細胞制成細胞懸液，接種至96孔板，每孔5×103個細胞。孵育24 h后，吸除原培養(yǎng)液，按照 “1.2.1”方法分組并處理，每組設置6個復孔。藥物作用36 h后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有DCFH-DA(10 μmol/L)探針的無血清培養(yǎng)液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度(激發(fā)波長為502 nm，發(fā)射波長為530 nm)，并應用Image J軟件分析各組熒光強度。

1.2.5Western blot方法檢測抗氧化應激相關(guān)蛋白表達水平 各組細胞干預36 h后，采用RIPA細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，分別應用體積分數(shù)0.10和0.15的SDS-PAGE對蛋白進行分離，之后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。應用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入1∶2 000的GAPDH、SOD2和CAT一抗，4 ℃孵育過夜，加入相應二抗(抗兔抗體，1∶5 000)37 ℃搖床上孵育1.5 h，通過化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，并用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。目標蛋白的相對表達以目標蛋白條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 最佳藥物造模濃度及丹參多酚酸鹽安全濃度

隨著AFB1濃度的升高，細胞相對存活率呈劑量依賴性下降，差異具有統(tǒng)計學意義(F=293.056，P<0.05)；當AFB1的濃度達到128 μmol/L時，H9C2細胞相對存活率為56.83%，符合造模條件。故選擇AFB1濃度128 μmol/L作為造模濃度。與空白對照組相比，0～50 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細胞，細胞相對存活率無明顯變化(P>0.05)；60 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細胞，細胞相對存活率下降(F=2.387，P<0.05)。0～50 mg/L濃度的丹參多酚酸鹽為安全使用濃度。

2.2 各組 H9C2細胞形態(tài)比較

空白對照組H9C2細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈梭形，緊密連接，邊界清晰可見，貼壁牢固；AFB1誘導模型組H9C2細胞生長密度較低，細胞間空隙增加，可見大片細胞脫落，部分細胞收縮變圓、形狀不規(guī)則，可見細胞碎片；不同劑量丹參多酚酸鹽干預組H9C2細胞生長形態(tài)及狀態(tài)得到一定改善。見圖1。

2.3 丹參多酚酸鹽對H9C2細胞損傷的影響

與空白對照組比較，AFB1誘導模型組細胞相對存活率降低；與AFB1誘導模型組相比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預組細胞相對存活率升高，差異有顯著性(F=226.937，P<0.05)。見表1。

2.4 丹參多酚酸鹽對心肌細胞ROS水平影響

熒光顯微鏡下各組H9C2細胞內(nèi)ROS觀察結(jié)果見圖2。與正常對照組相比，AFB1誘導模型組細胞內(nèi)ROS水平升高；與AFB1誘導模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預組ROS水平顯著降低，差異有顯著性(F=62.751，P<0.05)。見表1。

A:正常對照組；B:AFB1誘導模型組；C:低濃度丹參多酚酸鹽干預組；D:中濃度丹參多酚酸鹽干預組；E:高濃度丹參多酚酸鹽干預組。100倍。

A：正常對照組；B:AFB1誘導模型組；C:低濃度丹參多酚酸鹽干預組；D:中濃度丹參多酚酸鹽干預組；E:高濃度丹參多酚酸鹽干預組。DCFH-DA染色，100倍。

2.5 各組抗氧化蛋白SOD2和CAT表達比較

與正常對照組比較，AFB1誘導模型組心肌細胞SOD2、CAT蛋白表達降低；與AFB1誘導模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預組SOD2、CAT蛋白表達增加，差異有顯著意義(F=12.090、8.023，P<0.05)。見表1。

3 討 論

AFB1是毒性最強、最常見的黃曲霉毒素，被歸類為第一類致癌物。既往研究表明，AFB1誘導毒性的原因之一是氧化應激，氧化應激導致抗氧化酶活力降低及ROS過量生成，從而誘導心肌細胞的損傷[10]。也有研究表明，AFB1誘導心肌細胞線粒體損傷從而促進心肌細胞凋亡[4-5]。丹參多酚酸鹽具有較強的抗氧化活性，體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，其可通過降低ROS水平，穩(wěn)定細胞線粒體膜電位，改善與恢復細胞功能活性[11]。有研究表明，丹參多酚酸鹽可抑制H2O2處理的大鼠心肌細胞ROS的過量生成[11]，可通過抑制氧化損傷來防治H2O2所致的大鼠心肌細胞重構(gòu)[12]。本研究以128 μmol/L濃度的AFB1作用大鼠H9C2細胞制備心肌細胞損傷模型，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AFB1誘導模型組心肌細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞相對存活率顯著降低，提示AFB1對心肌細胞有明顯的毒性作用；與AFB1誘導模型組相比，應用高濃度丹參多酚酸鹽(40 mg/L)干預H9C2細胞36 h，細胞形態(tài)及數(shù)量有所改善，細胞相對存活率增加，說明高濃度的丹參多酚酸鹽對心肌細胞有保護作用。

表1 各組H9C2細胞相對存活率、ROS水平及抗氧化蛋白表達比較

綜上所述，丹參多酚酸鹽對AFB1損傷的心肌細胞有一定的保護作用，其作用機制可能與改善SOD2、CAT等抗氧化酶活力，進而促進過量ROS的清除，減輕氧化應激損傷有關(guān)。本研究可為臨床防治心臟損傷相關(guān)疾病提供新思路。