巨大芽孢桿菌中芥酸酰胺測定方法的建立及發(fā)酵條件優(yōu)化

湯鑫鑫， 謝毓丹， 肖 洋， 孫 冉， 李 祝， 鄧 麗， 姚蔣龐

(1. 貴州大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴陽 550025； 2. 貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴陽 550003)

芥酸酰胺(Erucamide，Eru)，學名：(Z)-docos-13-enoic acid)，分子式CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11CONH2，化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示。芥酸酰胺是由不飽和脂肪酸(芥酸)所生成的一種具有生物活性的長鏈不飽和脂肪酸酰胺，超長碳鏈結(jié)構(gòu)賦予了它特別的表面性能和高溫性能，被廣泛應(yīng)用于塑料、工程塑料、化妝品、醫(yī)藥、環(huán)保涂料、造紙、食品包裝等領(lǐng)域[1-3]。對芥酸酰胺的研究，國內(nèi)主要集中在其測定方法及其制備[4-6]等，國外也是對其測定方法[7-8]以及減小摩擦因數(shù)性能[9-10]的研究居多。雖然芥酸酰胺所有確切的生物學功能尚未明確，但是已有研究發(fā)現(xiàn)從血漿中分離得到作為水平衡器的芥酸酰胺，可以抑制腸道腹瀉，也可以調(diào)節(jié)其他器官的液體量[11]。Wakamatsu等[12]研究發(fā)現(xiàn)芥酸酰胺是牛腸系膜血管生成的主要脂類，能引起血管生成。Li等[13]研究表明口服芥酸酰胺(5～20 mg/kg)可減輕小鼠抑郁、焦慮樣行為。此外，研究發(fā)現(xiàn)從浮萍根中分離得到的芥酸酰胺能促進熒光假單胞菌脫氮，促進硝酸還原酶和亞硝酸鹽還原酶的活性[14-15]。

芥酸酰胺主要以高芥酸(>50%)的菜籽油為原料制備，其制取方法有芥酸氨化法、芥酸甲酯氨化法、芥酸酰氯氨化法、芥酸酸酐氨化法、芥酸-酰胺置換法、芥酸腈水解法以及高芥酸菜籽油直接氨解法等[16]。目前，國內(nèi)外對與芥酸酰胺的檢測主要采用氣相色譜法(GC)[17]、高效液相色譜法(HPLC)[18-19]、GC-MS[20-22]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[23]和紅外光譜法(FT-IR)[24]。每種方法都有不足之處：HPLC檢測芥酸酰胺含量時，紫外檢測器吸收弱、檢測靈敏度低；GC-MS測定芥酸酰胺含量時檢出限很高；FT-IR定量分析芥酸酰胺含量時誤差較大[25]。目前尚無有關(guān)微生物源芥酸酰胺的方法建立和其發(fā)酵生產(chǎn)的報道。

實驗室在前期工作中從巨大芽孢桿菌L2中分離得到芥酸酰胺，證實該菌株可以產(chǎn)生芥酸酰胺[26-27]，但還未建立其檢測方法。研究在建立芥酸酰胺測定方法的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法，對其培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行研究，不僅為芥酸酰胺微生物來源含量提供依據(jù)，還為芥酸酰胺生物源生產(chǎn)提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

圖1 芥酸酰胺的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure formula of erucamide

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium) L2，由貴州大學真菌資源研究所分離、篩選并鑒定，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China center for type culture collection，CCTCC) (武漢大學)，保藏號：CCTCC No. M2012381。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，瓊脂20 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BIOMATE 3S 紫外分光光度計，美國Thermo Fisher公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國安捷倫公司；FA2204N 精密電子天平，上海菁?？萍加邢薰?；Allegra X-30R 離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；SUKUN(SKY-2112B)立式雙層特大容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海達平儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：將保藏的菌種接入到含有40 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶(100 mL)中，30 ℃，150 r/min，培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將發(fā)酵好的種子液以2%的接種量接入到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶(100 mL)中，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 標準儲備液的配制

準確稱取芥酸酰胺標準品1 mg，用1 mL熱甲醇溶解，所得質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將標準儲備液用二氯甲烷稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40和60 μg/mL標準溶液，按上述條件進行測定。以質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標作圖繪制芥酸酰胺GC-MS標準曲線。

1.2.3 菌體生長量的測定

菌體濃度用在600 nm波長下分光光度計檢測的吸光度OD600表示。

1.2.4 芥酸酰胺含量的測定

巨大芽孢桿菌的種子液按2%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(50 mL/100 mL)，30 ℃，150 r/min，培養(yǎng)2 d。菌懸液10 000 r/min離心10 min，上清液即為發(fā)酵液。發(fā)酵液與二氯甲烷按體積比1∶1進行萃取2 h，每隔15 min劇烈振蕩后靜置分層，將有機相(下層)于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥，再用2 mL二氯甲烷溶解，吸取適量溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，置4 ℃冰箱備用，待后續(xù)進行GC/MS分析。

GC/MS色譜條件：Agilent，HP-5型色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度290 ℃[28]。起始柱溫：150 ℃，保持 2 min，以20 ℃/min升溫至300 ℃保持3 min，載氣為He，流速1.0 mL/min，進樣量為1 μL。

1.2.5 單因素試驗

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以菌體生長和芥酸酰胺產(chǎn)量作為評價指標，對碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇)、碳源添加量(1、5、10、15和20 g/L)、氮源(酵母浸膏、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨、蛋白胨)、氮源添加量(1、5、10、15和20 g/L)、無機鹽添加量(1、3、5、7和9 g/L)、接種量(1、3、5、7和9 g/L)、溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)、搖床轉(zhuǎn)速(100、120、150、180和210 r/min)、pH值(4.0、6.0、7.0、8.0和10.0)進行單因素試驗優(yōu)化，分別考察各因素對L2菌株生長情況和產(chǎn)芥酸酰胺的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用三因素三水平Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，以L2菌株發(fā)酵液中芥酸酰胺的產(chǎn)量為響應(yīng)值，將蛋白胨添加量、溫度、pH值3個因素作為自變量，用軟件Design Expert 8.06對數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，進而確定L2菌株產(chǎn)芥酸酰胺的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥酸酰胺測定方法的建立

2.1.1 標準曲線及線性關(guān)系的考察

以芥酸酰胺標準溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標制作芥酸酰胺標準曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，芥酸酰胺標準曲線線性回歸方程為y= 31 452x+ 12 811，相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 4，芥酸酰胺質(zhì)量濃度在5～60 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，能夠滿足樣品測試要求。

圖2 芥酸酰胺標準曲線Figure 2 Standard curve of erucamide

2.1.2 精密度試驗

取20 μg/mL芥酸酰胺對照品溶液，按1.2.4色譜條件連續(xù)進樣8次，得到對照品峰面積，精密度試驗結(jié)果見表1。芥酸酰胺含量結(jié)果RSD為5.74%，結(jié)果表明該方法精密度高。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.1.3 重復性試驗

平行取同一批次發(fā)酵液6份，按1.2.4制備供試品溶液8份，再按色譜條件進樣，得到對照品峰面積，結(jié)果見表2。芥酸酰胺含量測定結(jié)果RSD值為8.38%，考察的芥酸酰胺含量測定結(jié)果RSD值均小于15%，表明該檢測方法重復性良好。

表2 重復性試驗結(jié)果

2.1.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按照1.2.4方法操作制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10和12 h按照色譜測定方法進樣，記錄峰面積，計算芥酸酰胺含量的RSD，結(jié)果見表3。芥酸酰胺含量測定結(jié)果RSD值為3.67%，考察的芥酸酰胺含量測定結(jié)果RSD值均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.5 回收率試驗

取已知含量的發(fā)酵液9份，分別按照低、中、高 3種濃度水平加入芥酸酰胺對照品溶液，按1.2.4方法處理后，各濃度水平平行測定3次(表4)。由表4可知，樣品平均加標回收率為82.78%～98.14%，表明該方法準確度良好。

表4 回收率試驗結(jié)果

2.1.6 樣品測定

芥酸酰胺標準品GC-MS色譜圖(圖3)，由圖3可知，芥酸酰胺的保留時間為8.041 min。

圖3 芥酸酰胺標準品(40 μg/mL)GC-MS色譜圖Figure 3 GC-MS chromatogram of erucamide standard substance(40 g/mL)

巨大芽孢桿菌發(fā)酵液樣品中芥酸酰胺含量分析GC-MS色譜圖(圖4)。由圖4可知，芥酸酰胺的保留時間為8.037 min，巨大芽孢桿菌發(fā)酵液樣品中的芥酸酰胺含量為0.940 mg/L。

圖4 巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵液樣品中芥酸酰胺含量GC-MS色譜圖Figure 4 GC-MS chromatogram of erucamide content in fermentationbroth of B. megaterium L2

2.2 單因素試驗結(jié)果

分別考察不同碳源、碳源添加量、氮源、氮源添加量、無機鹽添加量、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值對菌株生產(chǎn)量和芥酸酰胺產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5。碳源可以為微生物提供生命活動所需要的能量，分別選用10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為唯一碳源[圖5(a)]，再進行最佳碳源添加量的篩選[圖5(b)]。從圖5(a)明顯看出葡萄糖對L2菌株的生長和芥酸酰胺的產(chǎn)生有顯著差異(P<0.05)，芥酸酰胺產(chǎn)量為1.027 mg/L±0.031 mg/L，其添加量為5 g/L時芥酸酰胺含量最高(1.045 mg/L±0.02 mg/L)。氮源是構(gòu)成微生物細胞物質(zhì)和含氮代謝物的重要來源，選擇10 g/L的酵母浸膏、尿素、硫酸銨、胰蛋白胨和蛋白胨作為氮源進行篩選[圖5(c)]，再進行最佳碳源添加量的篩選[圖5(d)]。從圖5(c)發(fā)現(xiàn)無機氮(尿素和硫酸銨)不利于L2菌株的生長，芥酸酰胺產(chǎn)量低；有機氮(酵母浸膏、胰蛋白胨和蛋白胨)有利于菌體生長和芥酸酰胺的產(chǎn)生，尤其是蛋白胨(P<0.05，1.023 mg/L±0.028 mg/L)，當其添加量為15 g/L時產(chǎn)芥酸酰胺含量最多(1.17 mg/L±0.053 mg/L)。無機鹽對微生物的正常生長發(fā)育和次級代謝產(chǎn)物的合成具有相當重要的影響，3 g/L的NaCl添加量不僅利于菌體產(chǎn)生芥酸酰胺(1.124 mg/L±0.0285 mg/L)，還可以節(jié)約成本，所以3 g/L作為無機鹽最佳添加濃度[圖5(e)]。

圖5 單因素對芥酸酰胺產(chǎn)量的影響Figure 5 Effect of single factor on yield of erucamide

接種量過少，遲緩期較長；接種量過高，種內(nèi)競爭增加，因此，合適的接種量有利于代謝產(chǎn)物合成[29-30]，從圖5(f)發(fā)現(xiàn)接種量為2%～6%時，對菌體的生長和芥酸酰胺的產(chǎn)生無顯著差異，但2%接種量產(chǎn)芥酸酰胺含量達1.135 mg/L±0.041 mg/L[圖5(f)]。溫度通過酶的活性影響微生物的生長和代謝產(chǎn)物的積累[31]，從圖5(g)中明顯看出溫度過高過低都會影響菌株的生長狀況，不利于芥酸酰胺的產(chǎn)生，35 ℃時菌株生長量和產(chǎn)芥酸酰胺含量顯著高于其他處理(P<0.05)，產(chǎn)量為1.727 mg/L±0.034 mg/L。轉(zhuǎn)速較小時，空氣流通量較小，不利菌體生長；轉(zhuǎn)速過大，相應(yīng)的剪切力增加，會對菌體造成傷害，產(chǎn)量減少[32]。pH值對菌體生長量和芥酸酰胺的產(chǎn)生有顯著影響[圖5(h)]，隨著初始pH值的增加，該菌株的生長量和芥酸酰胺產(chǎn)量均呈先遞增后下降的趨勢，表明pH值6.0～8.0利于菌體生長和芥酸酰胺產(chǎn)生，但pH值為6.0時菌體生長量和產(chǎn)芥酸酰胺的產(chǎn)量最大(1.207 mg/L±0.027 mg/L)，因此最佳pH值為6.0。從圖5(i)看出，隨搖床轉(zhuǎn)數(shù)增加，該菌株的芥酸酰胺產(chǎn)量呈先增后降的趨勢，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min時，芥酸酰胺產(chǎn)量達到最大(1.215 mg/L±0.035 mg/L)。初始pH值通過改變酶的活性、細胞質(zhì)膜通透性、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和物質(zhì)溶解性等方面來影響微生物的生長和產(chǎn)物積累[33]。

2.3 L2產(chǎn)芥酸酰胺的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗，采用Box-Behnken試驗對產(chǎn)芥酸酰胺發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行三因素三水平的響應(yīng)面分析，以蛋白胨添加量(A)、溫度(B)、pH (C) 3個因素為自變量，芥酸酰胺含量為響應(yīng)值。這3個因素作為變量，每個變量按低、中、高3個水平分別以-1、0、1進行編碼。由Design Expert軟件設(shè)計了17個響應(yīng)分析試驗，試驗設(shè)計因素及水平見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平

采用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到芥酸酰胺含量為響應(yīng)值的回歸方程：Y=1.27+0.08A-0.014B-0.043C+0.040AB-0.029AC+0.027BC-0.15A2-0.093B2-0.12C2。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 回歸模型方差分析

對上述回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表7。分析表7的結(jié)果可知決定系數(shù)與矯正決定系數(shù)為0.999和0.998，說明自變量與因變量線性關(guān)系顯著，二值較為接近，表明模型較準確地反映了芥酸酰胺的產(chǎn)量與蛋白胨添加量(A)、溫度(B)、pH(C)之間的關(guān)系，且后續(xù)預測值在可信區(qū)間內(nèi)；此外，模型P<0.05(顯著)，失擬項P=1.32>0.05(不顯著)，說明模型可較好擬合試驗數(shù)據(jù)，試驗誤差較??；模型變異系數(shù)CV=4.71%<10.0%，說明本次響應(yīng)面試驗的可信度和精確度較高。綜上，該模型可用于本次試驗。F檢驗可用于判定各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，P值越小顯著性越高[34-35]。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型中一次項A極顯著(P<0.01)，B、C不顯著(P>0.05)，3個因素對菌株L2產(chǎn)芥酸酰胺能力的影響從大到小依次為A>C>B。二次項A2、B2和C2極顯著(P<0.01)；交互項AB、AC、BC均不顯著(P>0.05)，表明3個因素對芥酸酰胺的產(chǎn)生有顯著影響，但它們之間的交互影響不顯著。

表7 回歸方程方差分析結(jié)果

2.3.3 等高線圖與響應(yīng)曲面

根據(jù)回歸方程畫出蛋白胨添加量(A)、溫度(B)、pH(C)交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面(圖6)。不同因素交互效應(yīng)的強弱可以通過等高線的形狀進行判定，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用不顯著。數(shù)學模型分析得菌株L2產(chǎn)芥酸酰胺的最佳培養(yǎng)條件：pH值為5.79、蛋白胨添加量為16.37 g/L，溫度為34.76 ℃，理論響應(yīng)值為1.284 mg/L。結(jié)合實際操作方便性和方差分析結(jié)果，確定最佳發(fā)酵條件：初始pH值為5.80、蛋白胨添加量為16.40 g/L，溫度為34.8 ℃。

圖6 蛋白胨添加量、溫度、pH值對芥酸酰胺產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面與等高線Figure 6 Response surface and contour plots for the effects ofpeptone concentration, temperature and pH on the yield of erucamide

2.3.4 驗證試驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，重復3次搖瓶實驗以驗證預測值，最佳培養(yǎng)條件進行3次平行試驗驗證，結(jié)果的平均值為1.325 mg/L，與理論響應(yīng)值(1.284 mg/L)相差0.041 mg/L。經(jīng)驗證，響應(yīng)面試驗結(jié)果真實可靠。最終結(jié)果顯示，優(yōu)化后的芥酸酰胺產(chǎn)量較優(yōu)化前(0.953 mg/L)提高了39.03%。

3 討論與結(jié)論

建立GC-MS法檢測巨大芽孢桿菌發(fā)酵液中芥酸酰胺含量的分析方法，該方法靈敏度高、操作簡便。結(jié)果顯示：GC-MS法檢測的RSD值均小于15%，樣品平均加標回收率在82.78%～98.14%，滿足方法檢測要求，為今后探索巨大芽孢桿菌發(fā)酵液中物質(zhì)有一定的參考作用，為微生物源芥酸酰胺含量的測定提供有效的分析方法。

科學的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不僅促進菌體快速生長繁殖，增強微生物的代謝性能，還能提高能源利用率，降低生產(chǎn)成本。現(xiàn)代數(shù)學中的很多統(tǒng)計優(yōu)化技術(shù)逐漸滲透到微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中[36]。張玲玲等[37]應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵條件，優(yōu)化后菌株搖瓶發(fā)酵ACT的平均產(chǎn)率為25.60 g/L，比優(yōu)化前菌株ACT產(chǎn)率提高了39.36%。張健等[38]在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化茴香酸生產(chǎn)菌發(fā)酵條件，優(yōu)化后茴香酸生成量為7.24 g/L,為優(yōu)化前的3.5倍。宮愷[39]利用響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸(ALA)發(fā)酵條件，通過優(yōu)化后發(fā)酵條件進行5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得ALA的最高產(chǎn)量達到5.3 g/L,比實驗室先期發(fā)酵條件優(yōu)化的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵ALA的產(chǎn)量提高了1.3倍左右。響應(yīng)面法優(yōu)化實驗次數(shù)少、周期短、精度高，已成功應(yīng)用于各種發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，多數(shù)應(yīng)用于提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量，但目前還未有將該方法應(yīng)用于巨大芽孢桿菌產(chǎn)芥酸酰胺的發(fā)酵培養(yǎng)的報道。

在建立的測定方法基礎(chǔ)上，采用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計方法優(yōu)化巨大芽孢桿菌L2產(chǎn)芥酸酰胺的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，得到優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：葡萄糖濃度為5 g/L、蛋白胨添加量為16.40 g/L、NaCl添加量為3 g/L、接種量為2.0%、培養(yǎng)溫度為34.8 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、初始pH值為5.80，優(yōu)化后芥酸酰胺產(chǎn)量較原始發(fā)酵條件提高了39.03%，實測值與響應(yīng)面預測值吻合良好。