清醒小鼠背側(cè)耳蝸核單個(gè)神經(jīng)元的細(xì)胞外記錄技術(shù)

秦春暉， 湯正權(quán)

(安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥230601)

在體電生理記錄技術(shù)，主要包括在體多通道電生理記錄技術(shù)(multi-channelinvivorecording)、在體單細(xì)胞記錄技術(shù)(single-unitinvivorecording)以及在體全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)(invivowhole-cell patch-clamp recording)，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。多通道記錄技術(shù)，是采用細(xì)胞外記錄的方法檢測(cè)一群神經(jīng)元或者單個(gè)神經(jīng)元的放電活動(dòng)，具有記錄的神經(jīng)元數(shù)量多、可以在清醒自由活動(dòng)的動(dòng)物上進(jìn)行記錄、數(shù)周乃至數(shù)月長(zhǎng)期記錄等優(yōu)點(diǎn)[1]。然而，多通道記錄技術(shù)有個(gè)明顯的缺點(diǎn)：多通道記錄使用的是金屬電極，對(duì)腦組織傷害程度大，不適合做深層腦區(qū)神經(jīng)元放電活動(dòng)的記錄。在體全細(xì)胞膜片鉗記錄是指在清醒或麻醉動(dòng)物上對(duì)其中樞神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄的技術(shù)，常采用盲法記錄或與雙光子顯微鏡結(jié)合的可視法記錄，此技術(shù)能對(duì)神經(jīng)元離子通道和突觸傳遞特性的研究提供更精確的手段，但其缺點(diǎn)是技術(shù)難度大，較適合皮層、嗅球淺層神經(jīng)元記錄[2]。

隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，對(duì)深層腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元放電活動(dòng)的研究可以進(jìn)一步揭示某一類的神經(jīng)元在大腦中的信息編碼功能和疾病發(fā)生機(jī)制[3]。因此，探索清醒動(dòng)物深層腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元的電生理活動(dòng)記錄具有重要的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用前景。近年來(lái)，深層腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的研究受到廣泛關(guān)注，但是對(duì)清醒動(dòng)物深層腦區(qū)神經(jīng)元放電活動(dòng)的研究存在一定的難度。目前大多記錄單細(xì)胞放電活動(dòng)使用的都是金屬電極，對(duì)腦組織都有一定程度的傷害[4-5]，而使用玻璃微電極可以有效減少金屬電極帶來(lái)的傷害程度。因此，本研究采用玻璃微電極對(duì)清醒小鼠深層腦區(qū)背側(cè)耳蝸核單個(gè)神經(jīng)元的細(xì)胞外記錄技術(shù)進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J SPF級(jí)小鼠(8～12周)，購(gòu)自廬江縣白湖博源實(shí)驗(yàn)用品銷售有限公司[SCXK(蘇)2016-0010]和美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory)，用于在體電生理技術(shù)記錄背側(cè)耳蝸核主神經(jīng)元。Ai32和GlyT2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)于美國(guó)Jackson Lab，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，子代小鼠經(jīng)PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性后進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。GlyT2-Cre;Ai32由雄性Ai32小鼠和雌性GlyT2-Cre小鼠雜交產(chǎn)生。GlyT2-Cre;Ai32小鼠的抑制性中間神經(jīng)元標(biāo)記有綠色熒光蛋白用于離體腦片膜片鉗記錄背側(cè)耳蝸核中間神經(jīng)元[6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽大學(xué)動(dòng)物房和美國(guó)俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)動(dòng)物房。所有動(dòng)物程序均符合安徽大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定(2020-039)以及美國(guó)俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)操作和頭部固定系統(tǒng)

通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)使成年小鼠麻醉，等實(shí)驗(yàn)小鼠完全麻醉后，使用眼膏防止小鼠干眼癥。將小鼠頭部固定在立體定位儀上，利用剪刀剪去頭部毛發(fā)并進(jìn)行碘酒消毒。用手術(shù)刀片切開(kāi)頭皮暴露顱骨Bregma和Lambda，然后使用牙科水泥將一個(gè)金屬桿(headpost)固定在顱骨前部正中位置上，并在前額骨下放置一個(gè)參考電極。使用立體定位儀定位右側(cè)背側(cè)耳蝸核的位置 (距離Bregma約5.9 mm ，距離Midline約2.3 mm)[7]，在體視顯微鏡下用顱鉆切除部分顱骨，行開(kāi)顱手術(shù)做 1 cm2切口(craniotomy)暴露腦膜，并用骨蠟封住切口，并且在切口周?chē)可先?lián)抗生素軟膏。最后縫合手術(shù)切口，將小鼠放回籠子恢復(fù)至少2 d。

1.2.2 在體細(xì)胞外記錄

將小鼠身體放在一個(gè)可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)的輪子上，并將其頭部固定在一個(gè)金屬架上，讓小鼠在轉(zhuǎn)輪上自由活動(dòng)或跑動(dòng)[圖1(a)]，熟悉并訓(xùn)練3 d后再進(jìn)行聲音刺激和在體細(xì)胞外電生理記錄 (200B patch-clamp amplifier, MANTA neurophysiology data acquisition)。在記錄的過(guò)程中，利用微操使玻璃微電極從小腦緩慢進(jìn)入背側(cè)耳蝸核的表層(molecular layer)、中間層(fusiform layer)和深層(deep layer)，記錄各層神經(jīng)元對(duì)聲音刺激的反應(yīng)以及在靜息狀態(tài)下的自發(fā)放電活動(dòng)[圖4(a)]。通過(guò)自寫(xiě)的Matlab程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 電極記錄位置的驗(yàn)證

電生理記錄結(jié)束后，通過(guò)玻璃電極，利用快速微離子(iontophoresis)導(dǎo)入熒光染料(Alexa 594)或者利用微量注射泵注入CTB488病毒來(lái)標(biāo)記電極記錄的位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并取出腦組織，檢測(cè)Alexa 594熒光染料或者綠色熒光蛋白標(biāo)記[圖1(e)]，確定記錄的腦區(qū)是背側(cè)耳蝸核。

(a)清醒小鼠細(xì)胞外記錄模式圖；(b)背側(cè)耳蝸核矢狀切片；(c)背側(cè)耳蝸核冠狀切片；(d)背側(cè)耳蝸核神經(jīng)環(huán)路(FC,fusiform cell；CWC,cartwheel cell；VC,vertical cell); (e)橢圓形虛線指示背側(cè)耳蝸核邊緣，白實(shí)線表示玻璃電極注入CTB488的位置。腦片厚度：100 μm。比例尺：200 μm。圖1 在清醒狀態(tài)下，C57BL/6J小鼠背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元細(xì)胞外記錄技術(shù)以及背側(cè)耳蝸核的神經(jīng)環(huán)路Figure 1 The extracellular recordings of principal neuron fusiformcell in awake mice

1.2.4 腦片膜片鉗記錄

將小鼠用戊巴比妥鈉深度麻醉后，快速斷頭取腦，在冰凍(0 ℃)的人工腦脊液中取出組織，隨后采用振動(dòng)切片機(jī)(Leica VT1200 S)進(jìn)行切片，得到腦切片后在ACSF中室溫下孵育1 h，最后對(duì)背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄[8]。在電流鉗模式下，記錄背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)[圖4(b)]。全細(xì)胞電流記錄使用膜片鉗放大器Axon 700B，Digidata 1440數(shù)模轉(zhuǎn)換器，數(shù)據(jù)采集和分析用Clampex軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 主神經(jīng)元對(duì)聲音的反應(yīng)特性

盡管背側(cè)耳蝸核神經(jīng)環(huán)路上約有10種細(xì)胞類型，但是之前的在體電生理記錄結(jié)果表明背側(cè)耳蝸核中只有主神經(jīng)元梭形細(xì)胞(fusiform cell，F(xiàn)C)和抑制性中間神經(jīng)元垂直細(xì)胞(vertical cell,VC)對(duì)聲音有反應(yīng)，且主神經(jīng)元梭形細(xì)胞具有能進(jìn)行自發(fā)放電活動(dòng)、對(duì)聲音刺激閾值較低以及對(duì)聲音的反應(yīng)調(diào)頻曲線(frequency tuning curve,FTC)為“V”型等典型的電生理學(xué)特性[7]。在記錄過(guò)程中，玻璃電極緩慢從小腦穿過(guò)，逐漸進(jìn)入背側(cè)耳蝸核，并且用聲音刺激記錄梭形細(xì)胞對(duì)聲音刺激的反應(yīng)[圖1(b)和(d)]。并檢測(cè)了梭形細(xì)胞對(duì)不同頻率調(diào)制范圍，聲音誘導(dǎo)的反應(yīng)調(diào)頻曲線為“V”型[圖2(b)和(c)] ，刺激時(shí)間直方圖(peri-stimulus time histogram,PSTH)為 “建立型”(buildup)[圖2(d)]。此外，我們檢測(cè)了梭形細(xì)胞對(duì)雪貂(ferret)發(fā)出的4種聲音反應(yīng) [圖3(a)] ，神經(jīng)元并不是對(duì)所有聲音都有反應(yīng)，而是選擇性對(duì)其中的一種發(fā)聲(vocalization)有反應(yīng)[圖3(b)] 。

(a)小鼠背側(cè)耳蝸核單個(gè)神經(jīng)元對(duì)聲音刺激的反應(yīng)；(b)單個(gè)神經(jīng)元對(duì)20 dB 21 kHz聲音誘導(dǎo)的反應(yīng)；(c)頻率調(diào)諧曲線(FTC)；(d)刺激時(shí)間直方圖 (PSTH)。圖2 C57BL/6J小鼠主神經(jīng)元梭形細(xì)胞的在體細(xì)胞外電生理記錄Figure 2 The extracellular recordings of principal neuron fusiformcell in C57BL/6J mice

(a)雪貂發(fā)出4種聲音的頻譜圖；(b)用揚(yáng)聲器播放雪貂發(fā)出4種聲音，梭形細(xì)胞只對(duì)其中1種發(fā)聲有反應(yīng)。圖3 C57BL/6J小鼠主神經(jīng)元梭形細(xì)胞選擇性對(duì)動(dòng)物發(fā)聲的反應(yīng)Figure 3 Principal neuron fusiform cell responds to sound vocalizationsin C57BL/6J mice

2.2 在體和離體電生理記錄的單個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)比較

在腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，GlyT2-Cre;Ai32小鼠的背側(cè)耳蝸核腦片中抑制性中間神經(jīng)元標(biāo)記有綠色熒光蛋白，通過(guò)熒光顯微鏡可以鑒別出中間神經(jīng)元[9]。主神經(jīng)元梭形細(xì)胞位于中間層(fusiform layer)，胞體形狀為梭形，2個(gè)樹(shù)突分別位于分子層(molecular layer)和深層結(jié)構(gòu)(deep layer)中；在熒光顯微鏡下，通過(guò)玻璃電極內(nèi)液中載有熒光染料顯現(xiàn)梭形細(xì)胞的形態(tài)和位置[9]，從而鑒別出梭形細(xì)胞。因此，在GlyT2-Cre;Ai32轉(zhuǎn)基因小鼠背側(cè)耳蝸核神經(jīng)環(huán)路上，利用腦片膜片鉗技術(shù)記錄了3種類型的細(xì)胞自發(fā)放電活動(dòng)，主神經(jīng)元梭形細(xì)胞自發(fā)放電活動(dòng)[圖4(b)]，中間神經(jīng)元車(chē)輪細(xì)胞(cartwheel cell, CWC)自發(fā)放電活動(dòng)非?；钴S，主要呈現(xiàn)暴發(fā)性鋒電位序列 (burst spike train)；另一類中間神經(jīng)元垂直細(xì)胞在靜息狀態(tài)下無(wú)自發(fā)放電活動(dòng)(數(shù)據(jù)沒(méi)有展現(xiàn))。在體細(xì)胞外記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主神經(jīng)元梭形細(xì)胞具有自發(fā)放電活動(dòng)[圖4(a)]，并對(duì)聲音的刺激有反應(yīng)，車(chē)輪細(xì)胞基本對(duì)聽(tīng)覺(jué)刺激不反應(yīng)但是表現(xiàn)出暴發(fā)性鋒電位序列 ，而垂直細(xì)胞對(duì)聲音刺激有反應(yīng)，但是沒(méi)有自發(fā)性動(dòng)作電位的發(fā)放。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果和之前的報(bào)道是一致的[8-9]。結(jié)果表明，利用玻璃微電極能鑒別出主神經(jīng)元梭形細(xì)胞。

(a)在體細(xì)胞外記錄梭形細(xì)胞的自發(fā)放電活動(dòng)；(b)離體腦片電流鉗模式下記錄梭形細(xì)胞的自發(fā)放動(dòng)作電位[9]。圖4 GlyT2-Cre;Ai32轉(zhuǎn)基因小鼠主神經(jīng)元梭形細(xì)胞在靜息狀態(tài)下的自發(fā)放電活動(dòng)Figure 4 Principal neuron firs a spontaneous spike activity at rest inGlyT2-Cre;Ai32 mice

3 討論

采用玻璃微電極對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的細(xì)胞外記錄技術(shù)，記錄清醒小鼠背側(cè)耳蝸核主神經(jīng)元梭形細(xì)胞對(duì)聲音刺激的反應(yīng)以及其自發(fā)放電活動(dòng)(圖 1)。研究結(jié)果表明，梭形細(xì)胞對(duì)純音刺激誘導(dǎo)反應(yīng)的頻率調(diào)諧曲線(FTC) 呈“V”型，刺激時(shí)間直方圖(PSTH)為“建立型”(buildup)，見(jiàn)圖 2，并且對(duì)動(dòng)物的發(fā)聲有選擇性反應(yīng)(圖 3)。為進(jìn)一步驗(yàn)證在體單細(xì)胞記錄技術(shù)能精確鑒定細(xì)胞的類型， 利用腦片膜片鉗技術(shù)記錄了GlyT2-Cre;Ai32轉(zhuǎn)基因小鼠背側(cè)耳蝸核上的3種主要細(xì)胞類型(梭形細(xì)胞、車(chē)輪細(xì)胞和垂直細(xì)胞)在靜息狀態(tài)下的自發(fā)放電活動(dòng)。與腦片膜片鉗技術(shù)記錄結(jié)果一致，在體單細(xì)胞記錄的主神經(jīng)元梭形細(xì)胞在靜息狀態(tài)下自發(fā)放電活動(dòng)(圖 4)，與中間神經(jīng)元車(chē)輪細(xì)胞在靜息電位下自發(fā)放電暴發(fā)性鋒電位和垂直細(xì)胞在靜息狀態(tài)下無(wú)自發(fā)放電活動(dòng)有明顯的差別。因此，本研究結(jié)果初步表明此方法可以準(zhǔn)確鑒定背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元細(xì)胞類型。在未來(lái)的研究中，將結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫染色以及光遺傳學(xué)等方法技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證神經(jīng)元的細(xì)胞類型。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元在細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的多樣性。不同種類的神經(jīng)元的電生理特性差別很大[10]。例如，聽(tīng)覺(jué)中樞背側(cè)耳蝸核——一個(gè)很小的腦區(qū)(直徑為5 mm)就存在多種不同的神經(jīng)元類型，包括主神經(jīng)元梭形細(xì)胞、中間神經(jīng)元車(chē)輪細(xì)胞和垂直細(xì)胞等[9]。目前，研究表明聽(tīng)覺(jué)中樞背側(cè)耳蝸核在聲源定位和消除動(dòng)物自身活動(dòng)產(chǎn)生噪音方面起了重要的作用[11]。隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，單一類的神經(jīng)元在腦疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。例如：多巴胺細(xì)胞功能紊亂與帕金森疾病發(fā)生相關(guān)[12]；一些離體電生理和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明背側(cè)耳蝸核梭形細(xì)胞或者車(chē)輪細(xì)胞的興奮性升高會(huì)導(dǎo)致耳鳴的發(fā)生[13-14]。因此，對(duì)背側(cè)耳蝸各類神經(jīng)元的電生理功能進(jìn)行分析，在臨床預(yù)防治療耳鳴上具有重要的科學(xué)價(jià)值和意義。

雖然早期的研究已經(jīng)對(duì)小鼠的背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元進(jìn)行記錄，但是利用麻醉動(dòng)物或者固定小鼠的身體會(huì)導(dǎo)致小鼠急性的應(yīng)急反應(yīng)(stressful)甚至抑郁發(fā)生[7,15-16]。我們采用固定小鼠的頭部，但小鼠的身體可以自由活動(dòng)的方法，讓小鼠可以在轉(zhuǎn)盤(pán)上跑步，相對(duì)不會(huì)導(dǎo)致小鼠過(guò)度的應(yīng)急反應(yīng)。利用玻璃微電極能夠記錄到信噪比很好的單細(xì)胞自發(fā)放電活動(dòng)和對(duì)不同聲音的反應(yīng)。因此，此技術(shù)可以應(yīng)用到深層腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元的生理功能以及疾病相關(guān)的研究中。我們記錄到的梭形細(xì)胞對(duì)聲音的反應(yīng)特性，和以前在豚鼠小鼠報(bào)道中主要采用金屬電極記錄取得的結(jié)果是一致的，在靜息電位下表現(xiàn)出自發(fā)放電活動(dòng)，對(duì)聲音的調(diào)頻曲線為“V”字形狀[7,15-17]。此外，早期研究表明背側(cè)耳蝸核神經(jīng)元對(duì)動(dòng)物發(fā)聲有反應(yīng)[15]，也可以抑制動(dòng)物自身活動(dòng)產(chǎn)生的噪音[11]。的確，我們的研究也表明主神經(jīng)元梭形細(xì)胞對(duì)動(dòng)物發(fā)聲有選擇性反應(yīng)。

現(xiàn)有在體電生理記錄方法大多是使用金屬電極對(duì)淺層腦區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行記錄，但利用玻璃微電極對(duì)深層腦區(qū)的神經(jīng)元記錄少有報(bào)道。本研究采用玻璃微電極和頭部固定系統(tǒng)對(duì)清醒小鼠背側(cè)耳蝸核的主神經(jīng)元作急性細(xì)胞外電信號(hào)記錄，并且能準(zhǔn)確鑒定主神經(jīng)元梭形細(xì)胞。最后，利用聲音刺激確定所記錄的神經(jīng)元定位在聽(tīng)覺(jué)核團(tuán)。研究結(jié)果初步提示了在體電生理記錄技術(shù)能夠被應(yīng)用于清醒動(dòng)物深層腦區(qū)神經(jīng)元類型的鑒定。與大多數(shù)金屬電極記錄方法相比，此方法具有準(zhǔn)確性高和對(duì)組織傷害性小的特點(diǎn)，為深入研究深層腦區(qū)的功能提供了有效手段 。

致謝：感謝美國(guó)俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)Vollum 研究所 Laurence O Trussell教授提供轉(zhuǎn)基因小鼠、儀器等支持和技術(shù)指導(dǎo)。