通識(shí)選修課開設(shè)微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)的探究

王宏剛， 魏 遠(yuǎn)， 劉 巍， 李登文， 趙立青

(南開大學(xué)生物國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 天津300071)

通識(shí)教育一直是高等教育的重要組成部分，做好通識(shí)教育對學(xué)生思想政治素質(zhì)、開拓創(chuàng)新精神、身心健康、個(gè)性化發(fā)展等方面的培養(yǎng)都具有積極的作用[1-3]?；A(chǔ)生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課是一門在高校中廣泛開設(shè)的以介紹生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)、訓(xùn)練基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作為目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐類通識(shí)選修課。隨著“六卓越一拔尖”計(jì)劃2.0的推進(jìn)，針對基礎(chǔ)生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法及課程建設(shè)相關(guān)的教學(xué)改革也不斷深入，涌現(xiàn)了不少新的思路[4-6]。

為了提高課程教學(xué)內(nèi)容的創(chuàng)新性，將生命科學(xué)學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)知識(shí)和常用方法引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)，生物國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(南開大學(xué))細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行大量研討和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在基礎(chǔ)生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課中面向非生物類專業(yè)的本科生開設(shè)了微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)。通過該實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞骨架、熒光標(biāo)記技術(shù)等處于生命科學(xué)研究前沿的知識(shí)點(diǎn)和技術(shù)方法引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)，取得了良好的教學(xué)效果。

1 材料與方法

1.1 材料 洋蔥鱗莖。

1.2 方法 (1)取材。

選取靠近中軸的洋蔥內(nèi)表皮，使用刀片在內(nèi)表皮上輕輕畫“井”字方格，長寬以5～8 mm為宜，取材過大會(huì)造成后續(xù)操作中洋蔥內(nèi)表皮發(fā)生卷曲，帶來不便。用鑷子撕下洋蔥內(nèi)表皮置于PBS中漂洗，洗去粘連的葉肉細(xì)胞。(2)固定。加入4%多聚甲醛(體積分?jǐn)?shù))室溫固定20 min，固定過程中應(yīng)不時(shí)翻動(dòng)試驗(yàn)材料，達(dá)到充分固定的目的。固定后棄去固定液，加入Pipes緩沖液清洗3次，每次5 min。(3)抽提。加入Pipes緩沖液配制的含體積分?jǐn)?shù)為0.1% Triton X-100和5% DMSO的抽提液處理洋蔥內(nèi)表皮20～30 min，棄去抽提液，Pipes緩沖液清洗洋蔥內(nèi)表皮3次，每次10 min。此步驟可以在搖床上進(jìn)行以增強(qiáng)抽提效果。(4)染色。將洋蔥內(nèi)表皮平鋪于潔凈的載玻片上，滴加幾滴100 ng/mL羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Pipes緩沖液配制)，避光染色10～20 min。染色過程中要隨時(shí)補(bǔ)加染色液，防止染色液蒸干。染色完成后蒸餾水清洗洋蔥內(nèi)表皮。(5)制片觀察。在實(shí)驗(yàn)材料上滴一滴含有DAPI的防熒光淬滅劑，輕輕蓋上蓋玻片，盡量不要產(chǎn)生氣泡。在熒光顯微鏡下，使用綠光激發(fā)，觀察跟微絲結(jié)合的羅丹明-鬼筆環(huán)肽發(fā)出的紅色熒光。使用紫外線激發(fā)，觀察跟細(xì)胞核結(jié)合的DAPI發(fā)出的藍(lán)色熒光，并拍照。

2 結(jié)果

熒光顯微鏡下可觀察到洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中的微絲發(fā)出紅色熒光，相互交織，充滿整個(gè)細(xì)胞，部分位置有分叉，細(xì)胞核周圍的微絲分布較為密集(圖1)。

3 討論

3.1 教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計(jì)

通識(shí)選修課最重要的教學(xué)目標(biāo)之一是要向?qū)W生普及學(xué)科前沿知識(shí)，基礎(chǔ)生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課的授課對象是非生物類專業(yè)的本科生，他們對生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的了解程度不同，動(dòng)手能力參差不齊。這就要求教學(xué)內(nèi)容要能夠體現(xiàn)學(xué)科發(fā)展的時(shí)代性和前沿性，并通俗易懂、操作簡便、易上手。

細(xì)胞骨架中的微絲與植物細(xì)胞壁的形成、腫瘤的遷移等多種生命活動(dòng)有關(guān)，近年來一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)[7-9]。熒光標(biāo)記技術(shù)是生命科學(xué)研究中普遍采用的實(shí)驗(yàn)方法[10-11]。微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)利用鬼筆環(huán)肽-羅丹明作為熒光探針標(biāo)記微絲，原理簡單明了，步驟簡便，過程可控，適合作為通識(shí)選修課的教學(xué)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)采用洋蔥內(nèi)表皮作為試驗(yàn)材料，洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞是天然的單層細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，取材簡單，觀察方便，操作難度適中。另外，在使用Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行抽提時(shí)加入DMSO來增加細(xì)胞膜的通透性以方便熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽進(jìn)入，增加熒光的亮度。

圖1 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中微絲的分布(10×)Figure 1 The distribution of microfilaments in theonion innerepidermal cells (10×)

3.2 教學(xué)過程的組織

通識(shí)選修課教學(xué)過程最大的特點(diǎn)是要求在相對固定的時(shí)間段內(nèi)完成一個(gè)較為完整的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的教學(xué)。微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)的教學(xué)過程分為知識(shí)點(diǎn)講解、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫3個(gè)部分，需要3～4個(gè)學(xué)時(shí)。

知識(shí)點(diǎn)講解的是細(xì)胞骨架的概念和功能、微絲的結(jié)構(gòu)、熒光標(biāo)記技術(shù)的概念和應(yīng)用等基礎(chǔ)理論知識(shí)，利用微視頻向?qū)W生展示實(shí)驗(yàn)的操作過程，對每個(gè)步驟的注意事項(xiàng)進(jìn)行強(qiáng)調(diào)和示范，約0.5～1個(gè)學(xué)時(shí)。

學(xué)生動(dòng)手完成實(shí)驗(yàn)是教學(xué)過程的主體，需要2～3個(gè)學(xué)時(shí)。微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)共有5個(gè)步驟，每個(gè)步驟對學(xué)生的動(dòng)手能力均有一定的要求，但不是太難。固定和抽提的處理時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，任課教師需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況進(jìn)行適度的優(yōu)化，給學(xué)生一個(gè)較為精確的建議，熒光顯微鏡的使用是實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)難點(diǎn)，任課教師需要對學(xué)生進(jìn)行必要的指導(dǎo)或配備助教幫助學(xué)生進(jìn)行操作。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告分兩個(gè)部分，第一部分是實(shí)驗(yàn)的原始記錄，穿插在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行，要求學(xué)生如實(shí)詳細(xì)地記錄實(shí)驗(yàn)過程中每一步操作和每一個(gè)參數(shù)。第二部分要求學(xué)生在課后閱讀文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上完成思考題，為學(xué)有余力的學(xué)生提供進(jìn)一步拔高的平臺(tái)，提高課程的挑戰(zhàn)度。

4 結(jié)束語

通識(shí)教育是高等教育的重要組成部分，通識(shí)教育的改革需要在教育理念、管理體制、人才培養(yǎng)模式多個(gè)方面進(jìn)行創(chuàng)新。作為通識(shí)教育的重要載體之一，通識(shí)選修課教學(xué)內(nèi)容的建設(shè)格外重要。微絲熒光觀察實(shí)驗(yàn)采用較為簡便的方法將細(xì)胞生物學(xué)前沿的知識(shí)和技術(shù)方法改造為適合在通識(shí)選修課中開設(shè)的教學(xué)內(nèi)容，體現(xiàn)出一定的創(chuàng)新性、高階性和挑戰(zhàn)度，提高了課程的課程教學(xué)水平，收到了良好的效果。