斑地錦RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選

宋美玲 黃勝和 陳祖杰 鄒嘉軒 劉歡勝 全文軍

摘 要：? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）的前提條件之一是具有合適的內(nèi)參基因。為篩選斑地錦（Euphorbia maculata）合適的RT-qPCR內(nèi)參基因，該文利用同源克隆法克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段，RT-qPCR檢測(cè)7個(gè)候選內(nèi)參基因在斑地錦不同生長(zhǎng)期根、莖、葉和果實(shí)中的表達(dá)情況，并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物學(xué)軟件對(duì)各候選基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：（1）克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個(gè)氨基酸，與其他植物相應(yīng)氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。（2）綜合3個(gè)分析軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性得出，表達(dá)穩(wěn)定性排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此，可以選取UBQ作為斑地錦RT-qPCR分析的內(nèi)參基因，用于不同生長(zhǎng)期基因組織特異性表達(dá)研究。

關(guān)鍵詞： 斑地錦， 基因克隆， 內(nèi)參基因， RT-qPCR

中圖分類號(hào)：? Q943; R286.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）02-0340-09

Screening of reference genes for RT-qPCR

in Euphorbia maculata

SONG Meiling1， HUANG Shenghe1*， CHEN Zujie2，

ZOU Jiaxuan3， LIU Huansheng3， QUAN Wenjun3

（ 1. Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， Jiangxi， China; 2. Jiangxi Medical College，

Nanchang University， Nanchang 330031， China; 3. Fuzhou Medical College， Nanchang University， Fuzhou 344000， Jiangxi， China ）

Abstract：? The suitable reference genes is a prerequisite for real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. In order to find a suitable reference gene for gene expression analysis using RT-qPCR in Euphorbia maculata， GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， and CYP gene fragments from roots， stems， leaves and fruits at different growth stages were cloned with the method of homologous cloning. Subsequently， the expression patterns of the seven candidate reference genes were obtained by RT-qPCR in E. maculata， and the expression stability was assessed by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. The results were as follows： （1） The fragment sequences of GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A and CYP contained 729 bp （encoding 242 amino acids）， 808 bp （encoding 269 amino acids）， 753 bp （encoding 250 amino acids）， 422 bp （encoding 140 amino acids）， 233 bp （encoding 77 amino acids）， 656 bp （encoding 218 amino acids）， and 313 bp （encoding 103 amino acids）， respectively. And the seven amino acid sequences shared over 85% identity with other GAPDH， EF-1α， act， UBQ， TUB-α， eIF-4A， CYP by BlAST in GenBank. （2） The order of expression stability was UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act by geNorm， NormFinder， and BestKeeper. Therefore， UBQ can be selected as a reference gene for RT-qPCR in E. maculata using for gene expression analysis in different plant tissues at different growth stages.

Key words： Euphorbia maculata， gene cloning， reference genes， RT-qPCR

地錦草藥材為大戟科大戟屬一年生草本植物地錦（Euphorbia humifusa）或斑地錦（E. maculata）的干燥全草，又名鬼見(jiàn)愁、血筋草、奶汁草等，分布于中國(guó)江蘇、江西、浙江、湖北、河南、河北、新疆和內(nèi)蒙古等地（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1997），是中醫(yī)、維醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥材，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效，主治痢疾、泄瀉、咯血、尿血、便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015），目前已開發(fā)有腸炎寧片、三七止血片、瀉痢寧片等中成藥。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、止血、免疫調(diào)節(jié)等作用（柳潤(rùn)輝等，2001;安惠霞等，2008）。目前，斑地錦研究多聚焦在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制、藥理學(xué)作用、化學(xué)成分的提取及鑒定等方面（胡建新等，2018;Tian et al.， 2019），分子生物學(xué)相關(guān)研究報(bào)道較少。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上引入熒光基團(tuán)，通過(guò)相應(yīng)的熒光信號(hào)積聚實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程，為未知序列進(jìn)行定量分析的方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確（張玉芳等，2014;Wang et al.， 2019），已經(jīng)成為分子生物學(xué)中研究基因表達(dá)的重要工具之一，而使用合適的內(nèi)參基因是獲得可信定量結(jié)果的前提（Shakeel et al.， 2018）。在實(shí)際應(yīng)用中，RNA提取、cDNA合成及PCR擴(kuò)增效率等因素會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此常用表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化（Bustin， 2002），以減少樣品之間和樣品內(nèi)部的誤差。最近研究結(jié)果表明，內(nèi)參基因不存在絕對(duì)通用性，若不經(jīng)篩選而以一種基因作為任何條件下的內(nèi)參，得到的結(jié)果精確度大幅度降低，甚至錯(cuò)誤（Zhu et al.， 2019）。另外，單一傳統(tǒng)的內(nèi)參基因有時(shí)會(huì)對(duì)結(jié)果精確性產(chǎn)生影響，新內(nèi)參基因?qū)⒅饾u取代某些表達(dá)穩(wěn)定性差的傳統(tǒng)管家基因（Nguyen et al.， 2018），或應(yīng)用內(nèi)參基因組合有效地減少基因表達(dá)誤差（袁偉等，2012），以獲得更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。同時(shí)，基于基因芯片技術(shù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選（Liang et al.， 2018），也將有助于獲得更可靠的內(nèi)參基因。因此，在分析目標(biāo)基因表達(dá)之前，有必要對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選與評(píng)估，而評(píng)價(jià)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的軟件較多，其中g(shù)eNorm、NormFinder和BestKeeper應(yīng)用較為廣泛（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019）。目前，常用的內(nèi)參基因有act（actin）、GAPDH（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase）、EF-1α（elongation factor-1 alpha）、UBQ（ubiquitin）、TUB-α（tubulin alpha）、eIF-4A（eukaryotic translation initiation factor 4A）、CYP（cyclophilin）、18S rRNA（18S ribosomal RNA）等（Haller et al.， 2004;Kozera & Rapacz， 2013）。為篩選斑地錦合適的RT-qPCR內(nèi)參基因，本研究同源克隆斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等7個(gè)候選內(nèi)參基因片段，RT-qPCR檢測(cè)在斑地錦不同生長(zhǎng)期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實(shí)中的表達(dá)情況，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件對(duì)各候選基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為斑地錦不同生長(zhǎng)期基因組織特異性表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑地錦種子由江西天施康生態(tài)中藥種植有限公司惠贈(zèng)，種植于南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田，經(jīng)江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系中藥教研室鑒定為斑地錦。分別采集種植70 d后的苗期（未開花）、花期（開3朵以上的花且未結(jié)果）的根、莖、葉，以及果期（結(jié)3個(gè)以上的果）的根、莖、葉、果，每個(gè)樣品皆為3株以上的混合樣品，采集后立即置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒（Spin Column Plant Total RNA Purification Kit）、膠回收試劑盒（SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit）、引物合成、測(cè)序等，生工生物工程（上海）股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser）、熒光定量PCR試劑（PrimeScriptTM RT Master Mix）等，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司;Pfu酶（TransStart FastPfu DNA Polymerase）、Taq酶、T-載體（pEASY-Blunt Simple Cloning Kit），購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

普通PCR儀（T100TM Thermal Cycler）、熒光定量PCR儀（CFX96 Real-Time）等，美國(guó)Bio-Rad公司;超微量分光光度計(jì)（NanoDrop One），美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA的合成 斑地錦不同生長(zhǎng)期根、莖、葉、果實(shí)總RNA的提取和cDNA的合成皆參照試劑盒說(shuō)明書操作?？俁NA提取后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，并用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 在GenBank中查詢相關(guān)序列，尤其是同科植物蓖麻（Ricinus communis）、麻瘋樹（Jatropha curcas）和橡膠樹（Hevea brasiliensis）等的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP的基因序列，比對(duì)找出高度保守區(qū)段，分別設(shè)計(jì)克隆斑地錦相關(guān)基因的簡(jiǎn)并引物。后續(xù)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)RT-qPCR引物。本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

1.3.3 候選內(nèi)參基因片段的克隆與分析 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：5×GC Buffer 5 μL，dNTPs（各2.5 mmol·L-1）2.5 μL，簡(jiǎn)并引物F（10 μmol·L-1）、R（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶（5 U·μL-1）0.3 μL，滅菌ddH2O 14.2 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，相應(yīng)退火溫度30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的片段的回收純化按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。將回收的DNA片段連接T-載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送測(cè)序。所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3.4 RT-qPCR引物檢測(cè)與熔解曲線分析 為檢驗(yàn)引物特異性，排除引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)結(jié)果的影響，用相應(yīng)引物qF、qR進(jìn)行普通PCR，然后進(jìn)行RT-qPCR，再加熱RT-qPCR產(chǎn)物從65 ℃到95 ℃，每隔0.5 ℃停留5 s檢測(cè)1次熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。RT-qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，引物qF（10 μmol·L-1）、qR（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌ddH2O 7.2 μL;擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，相應(yīng)退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.5 候選內(nèi)參基因的篩選 分別將樣品總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)3個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。將Ct值轉(zhuǎn)化為相對(duì)表達(dá)量（吳建陽(yáng)等，2017），按照公式Q=2（Ct min- Ct sample）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用于geNorm和NormFinder軟件分析，于BestKeeper軟件中直接輸入Ct值進(jìn)行分析，最后進(jìn)行綜合排名，得出最適合斑地錦不同生長(zhǎng)期基因組織特異性表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因片段的克隆與分析

以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，相應(yīng)簡(jiǎn)并引物F、R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖1）。對(duì)其測(cè)序后顯示，克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段分別為729、808、753、422、233、656、313 bp，分別編碼242、269、250、140、77、218、103個(gè)氨基酸。將氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)后，GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP分別與萵苣GAPDH（XP023733724）、蓖麻EF-1α（XP002518073）、荔枝act（ADV17460）、山梨獼猴桃UBQ（GFZ13847.1）、大麥TUB-α（CAB76917.1）、玉米eIF-4A（U17979.1）、油桐CYP（ARV78452.1）的同源性為95%、99%、100%、99%、99%、87%、86%。將相應(yīng)核苷酸序列登錄到GenBank，獲得登錄號(hào)EmGAPDH（MT044466）、EmEF-1α（MT044465）、Emactin（MT044464）、EmUBQ（MW815120）、EmeIF-4A（MW815119）、EmTUB-α（MW815118）、EmCYP（MW815117）。

2.2 RT-qPCR引物檢測(cè)與熔解曲線分析

用相應(yīng)引物qF、qR進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期一致（圖2）。將熒光定量RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，各基因引物的熔解曲線均顯示為單峰（圖3）。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)定量引物無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，可用于后續(xù)的RT-qPCR分析。

2.3 候選內(nèi)參基因的Ct值分析

對(duì)斑地錦不同生長(zhǎng)期各組織（根、莖、葉和果）的cDNA樣品進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，運(yùn)用Ct值評(píng)估各內(nèi)參基因的表達(dá)量，Ct值與其表達(dá)量成反比，即Ct值越小，表達(dá)量越高。內(nèi)參基因的表達(dá)值排序?yàn)镋F-1α>TUB-α>eIF-4A>UBQ>CYP>GAPDH>act，Ct值分別為17.04～19.55、18.52～21.81、18.58～22.04、20.19～22.90、20.63～24.99、21.85～24.95、24.44～29.26（圖4）。3次重復(fù)之間各內(nèi)參基因的表達(dá)量變動(dòng)較小，且表達(dá)量都有所變化。

2.4 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm軟件分析 geNorm軟件通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定系數(shù)M來(lái)分析基因表達(dá)穩(wěn)定性，M值越小，穩(wěn)定性越好。除act外，6個(gè)候選內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)的M值都小于1.5，穩(wěn)定性排名為UBQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表2）。

2.4.2 NormFinder軟件分析 與geNorm類似，NormFinder軟件也是通過(guò)各候選內(nèi)參基因的M值評(píng)估其表達(dá)穩(wěn)定性。經(jīng)NormFinder軟件分析，7個(gè)內(nèi)參基因在各組織中的表達(dá)穩(wěn)定程度存在差異，按M 值大小排序?yàn)閁BQ>TUB-α>EF-1α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表3）。UBQ的M值最低，總體穩(wěn)定性最好。

2.4.3 BestKeeper軟件分析 BestKeeper直接根據(jù)各基因的Ct值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）來(lái)評(píng)估各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。一般來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有較小的SD值和CV值。BestKeeper分析的基因表達(dá)穩(wěn)定性排名為EF-1α>UBQ>eIF-4A>GAPDH>TUB-α>CYP>act（表4）。其中，EF-1α、UBQ、eIF-4A的SD值和CV值比較相近，表達(dá)都相對(duì)穩(wěn)定。

2.4.4 綜合分析 由于各內(nèi)參基因在3個(gè)軟件中的排序略有差異，故運(yùn)用幾何平均值算法進(jìn)行各候選內(nèi)參基因的綜合排名，內(nèi)參基因幾何平均值越低，則其穩(wěn)定性越好。各內(nèi)參基因在斑地錦不同生長(zhǎng)期的不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名為UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act（表5）。

3 討論與結(jié)論

地錦草是中醫(yī)、維醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥材，主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等，其中槲皮素含量作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前，斑地錦的分子生物學(xué)相關(guān)報(bào)道較少。本研究首次克隆了斑地錦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等常用的傳統(tǒng)內(nèi)參基因片段，并作為候選內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR，分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper評(píng)價(jià)在各生長(zhǎng)期（苗期、花期、果期）根、莖、葉和果實(shí)中的表達(dá)穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)中，各候選內(nèi)參基因在不同生長(zhǎng)期各組織中的表達(dá)豐度除act外都較高，Ct值皆在25以下，符合要求。由于3個(gè)評(píng)估軟件采用不同統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，分析結(jié)果通常存在差異，需要綜合分析得到最適合的內(nèi)參基因（Kiarash et al.， 2018;Zhong et al.， 2019），其中g(shù)eNorm和NormFinder的分析結(jié)果較為一致，UBQ、TUB-α、EF-1α、eIF-4A、GAPDH的M值都小于1，比較穩(wěn)定，最佳內(nèi)參基因?yàn)閁BQ，而BestKeeper評(píng)價(jià)結(jié)果與前二者略有差異，EF-1α、UBQ、eIF-4A、GAPDH的SD值小于1，該軟件篩選的最優(yōu)內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α，而UBQ和eIF-4A表達(dá)也比較穩(wěn)定，與EF-1α并無(wú)明顯差異。UBQ是泛素蛋白，與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)，參與細(xì)胞代謝過(guò)程，UBQ是常用的內(nèi)參基因，在許多植物中得到應(yīng)用，例如分析芍藥花瓣不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的基因表達(dá)時(shí)可選用UBQ作為內(nèi)參基因（李健，2017）。EF-1α是轉(zhuǎn)錄延伸因子α亞基基因， 在真核生物中參與轉(zhuǎn)錄控制、凋亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列重要的生命活動(dòng)過(guò)程，也是較為常用的內(nèi)參基因，在朱頂紅不同組織中表達(dá)較穩(wěn)定（劉曉婷等，2018）。GAPDH、act、TUB-α、eIF-4A、CYP等不是斑地錦各生長(zhǎng)期不同組織RT-qPCR的合適內(nèi)參基因，但在其他一些植物中可能穩(wěn)定表達(dá)，這也證明在不同植物或不同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行RT-qPCR有必要對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選與評(píng)估（Kozera & Rapacz， 2013）。因此，若研究斑地錦不同生長(zhǎng)期基因組織特異性表達(dá)時(shí)，可以選取UBQ作為內(nèi)參基因，如果選擇內(nèi)參基因組合，則UBQ和EF-1α較為合適。此結(jié)果為后續(xù)斑地錦分子生物學(xué)相關(guān)研究提供了便利條件。當(dāng)然，隨著斑地錦基因發(fā)掘和表達(dá)研究的深入，不排除會(huì)出現(xiàn)更穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

收稿日期：? 2021-04-19

基金項(xiàng)目：? 江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ191230） [Supported by Scientific and Technological Research Program of Jiangxi Education Department （GJJ191230）]。

第一作者： 宋美玲（1989-），碩士，講師，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，（E-mail）sml0703@163.com。

*通信作者：? 黃勝和，博士，副教授，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，（E-mail）hsh712@163.com。

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