急支糖漿一板多藥味HPTLC鑒別和HPLC含量測(cè)定方法的研究

丁浩然 劉峰 陳艷 王夢(mèng)月 李曉波

中圖分類(lèi)號(hào) R286.0;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）05-0555-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.08

摘 要 目的 優(yōu)化急支糖漿現(xiàn)有薄層色譜鑒別和含量測(cè)定方法。方法 采用高效薄層色譜（HPTLC）法鑒別急支糖漿方中的四季青、魚(yú)腥草、前胡、枳殼和甘草5種藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷的含量。結(jié)果 HPTLC法結(jié)果顯示，具棲冬青苷、白花前胡甲素、柚皮苷、甘草苷4種對(duì)照品和魚(yú)腥草對(duì)照藥材的薄層斑點(diǎn)均顯示清晰，比移值均在0.2～0.8范圍內(nèi);經(jīng)驗(yàn)證，方法專(zhuān)屬性、耐用性和批次重復(fù)性良好。HPLC法結(jié)果顯示，原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷的線(xiàn)性范圍分別為4.32～431.67、1.14～114.17、7.02～702.33 μg/mL（r均大于0.996）;平均加樣回收率分別為100.61%、100.40%、99.22%（RSD均小于2.00%）;精密度（n=6）、穩(wěn)定性（24 h，n=7）、重復(fù)性（n=6）試驗(yàn)的RSD均小于2.00%。原兒茶酸等3種活性成分在10批急支糖漿中的平均含量依次為623.3、152.1、1 213.9 μg/mL（RSD均小于10.00%）。結(jié)論 本研究建立了急支糖漿一板多藥味HPTLC鑒別方法，使用1種樣品前處理方法、2個(gè)薄層色譜條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)處方中5種藥材的快速鑒別;建立了HPLC含量測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)急支糖漿中3種活性成分的快速定量，可用于優(yōu)化急支糖漿現(xiàn)有法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)。

關(guān)鍵詞 急支糖漿;一板多藥味;高效薄層色譜法;高效液相色譜法;含量測(cè)定;整體鑒別

Study on HPTLC identification of one-plate multi-drug and HPLC content determination method for Jizhi syrup

DING Haoran，LIU Feng，CHEN Yan，WANG Mengyue，LI Xiaobo（School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To optimize the existing thin layer chromatography （TLC） identification and content determination methods of Jizhi syrup. METHODS High performance thin-layer chromatography （HPTLC） was used to identify five medicinal materials in Jizhi syrup， such as Ilex chinensis， Houttuynia cordata， Peucedanum praeruptorum， Citrus aurantium， Glycyrrhiza uralensis. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of procatechuic acid， ephedrine hydrochloride and naringin in Jizhi syrup. RESULTS HPTLC results showed that the identification spots of pedunculoside， praeruptorin A， naringin， and liquiritin were clearly displayed， and the retention factors were in the range of 0.2 to 0.8. After validation， the method had been proved to be strongly specific， robust and repeatable. HPLC results showed that the linear ranges of protocatechuic acid， ephedrine hydrochloride and naringin were 4.32-431.67， 1.14-114.17 and 7.02-702.33 μg/mL （all r>0.996）， respectively. The average recoveries were 100.61%， 100.40% and 99.22%， and RSDs were all less than 2.00%. RSDs of precision （n=6）， stability （24 h， n=7） and repeatability （n=6） were all less than 2.00%. The average contents of the three components in 10 batches were 623.3， 152.1， 1 213.9 μg/mL （RSD<10.00%）， respectively. CONCLUSIONS In this study， HPTLC method of one-plate multi-drug is established for the identification of Jizhi syrup. One sample pretreatment method and two TLC conditions are used to realize the rapid identification of five kinds of medicinal materials. An HPLC method is established to determine the content of Jizhi syrup， which realizes the fast quantification of three active components in Jizhi syrup， and can be used to optimize the identification and content determination items in the existing legal quality standards of Jizhi syrup.

KEYWORDS? ?Jizhi syrup; one-plate multi-drug; HPTLC; HPLC; content determination; overall identification

急支糖漿處方是來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院沈自尹院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，目前收載于2020年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]，也被收入《四川省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防控技術(shù)指南（第五版）》[2]。急支糖漿由四季青、魚(yú)腥草、金蕎麥、紫菀、前胡、麻黃、枳殼、甘草8味中藥制成，具有清熱宣肺、理氣化痰的功效[3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，急支糖漿對(duì)急性支氣管炎和慢性支氣管炎急性發(fā)作引發(fā)咳嗽的臨床總有效率大于92%[4]，在與抗生素聯(lián)用治療支氣管炎及外感風(fēng)熱咳嗽方面也有顯著療效[5]。2020年版《中國(guó)藥典》鑒別項(xiàng)對(duì)急支糖漿中的鹽酸麻黃堿（來(lái)源于麻黃）、柚皮苷（來(lái)源于枳殼）、原兒茶酸和阿魏酸進(jìn)行了薄層色譜鑒別[1]。該鑒別項(xiàng)使用3種展開(kāi)條件，共鑒別4種成分，但各展開(kāi)條件所對(duì)應(yīng)的樣品前處理方法不一致，操作繁瑣;且所鑒別的原兒茶酸和阿魏酸是來(lái)源于處方中四季青、金蕎麥、紫菀等多味藥材的酚酸類(lèi)成分[6-9]，專(zhuān)屬性差。另外，2020年版《中國(guó)藥典》中急支糖漿的含量測(cè)定項(xiàng)僅對(duì)柚皮苷進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于成分復(fù)雜的中藥復(fù)方僅選擇單一藥材的特征成分進(jìn)行質(zhì)量控制，具有一定局限性，不能滿(mǎn)足質(zhì)量日益提升的要求[10]。

基于中藥復(fù)方制劑組成藥味多，單味藥逐一鑒別操作復(fù)雜，“整體鑒別”的思路被提出——在首選君藥、貴重藥、毒性藥鑒別的基礎(chǔ)上，盡可能多地對(duì)制劑中的有效成分、專(zhuān)屬性成分進(jìn)行鑒別[11-12]。一板多藥味鑒別法是“整體鑒別”思路的直接應(yīng)用，可以節(jié)省人工及材料成本，最大程度地提高檢測(cè)效率[13-14]。為保證急支糖漿在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中原料的可追溯性，簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)省材料，有必要建立一種基于專(zhuān)屬性成分的一板多藥味高效薄層色譜（high performance thin-layer chromatography，HPTLC）鑒別方法。在優(yōu)化含量測(cè)定項(xiàng)方面，質(zhì)量標(biāo)志物為質(zhì)量控制研究提供了新思路，物質(zhì)存在性、特有性、可測(cè)性、功效關(guān)聯(lián)性和溯源傳遞性“五原則”已成為選擇質(zhì)量控制指標(biāo)的重要判斷依據(jù)[15];同時(shí)新方法的高效性、實(shí)用性、耐用性，是否能為實(shí)際產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供便利，也是優(yōu)化含量測(cè)定方法需考慮的重要因素。所以，本研究建立了一種一板多藥味HPTLC鑒別法，通過(guò)1種樣品前處理方法、2個(gè)薄層色譜條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)急支糖漿中君藥四季青和魚(yú)腥草、臣藥前胡、佐藥枳殼、使藥甘草的同時(shí)鑒別[3];建立了一種高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷3種活性成分的快速定量。兩種方法均簡(jiǎn)單高效，擬用于優(yōu)化2020年版《中國(guó)藥典》中急支糖漿的鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)，提升該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所使用的主要儀器有PWN85ZH型十萬(wàn)分之一電子分析天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]，HPTLC系統(tǒng)（包括Automatic TLC Sampler 4型自動(dòng)點(diǎn)板儀、Automatic Developing Chamber 2型自動(dòng)展開(kāi)儀、TLC Visualizer 2型自動(dòng)成像儀，瑞士CAMAG公司），1290 Infinity型HPLC系統(tǒng)（包括G4226A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C型柱溫箱、G4212A DAD型檢測(cè)器、G4220A型二元超高壓梯度泵，美國(guó)Agilent公司），Research plus型手動(dòng)移液器（量程100～1 000 μL）、Centrifuge 5417R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

無(wú)水乙醇、甲醇、三氯甲烷、乙醚、石油醚、環(huán)己烷、氯化鈉均購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司，乙酸乙酯、硫酸、六水合氯化鎂均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;乙腈購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，磷酸購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，均為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水使用Millipore Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備。高效薄層板HSGF254購(gòu)自煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司，高效薄層板G購(gòu)自青島海洋化工有限公司，高效薄層板HSG60購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

甘草苷對(duì)照品（批號(hào)wkq18040902，純度≥98%）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司;柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)DST191011-099，純度≥98%）、具棲冬青苷對(duì)照品（批號(hào)DST19032-034，純度≥98%）、白花前胡甲素對(duì)照品（批號(hào)DST190214-020，純度≥98%）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)DST180428-081，純度≥98%）、四季青對(duì)照藥材（批號(hào)DST190808-046）均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)171241-201809，純度≥99%）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)120904-201620）、枳殼對(duì)照藥材（批號(hào)120981-201605）、前胡對(duì)照藥材（批號(hào)120951-201706）、魚(yú)腥草對(duì)照藥材（批號(hào)121046-201607）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。10批急支糖漿（批號(hào)分別為19040073、19040074、19040075、19040077、19040086、19040097、19040098、19040101、19040114、19040116）、6批缺方陰性樣品（分別為缺甘草、枳殼、四季青、前胡、魚(yú)腥草、麻黃的陰性樣品，廠家未提供生產(chǎn)批號(hào)）均由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 一板多藥味HPTLC法鑒定急支糖漿中的5種藥材

2.1.1 供試品溶液制備

取本品30 mL，置分液漏斗中，用石油醚振搖提取2次，每次30 mL;棄去石油醚液，水液加乙醚振搖提取2次，每次30 mL;合并乙醚提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為急支糖漿供試品一溶液。水液再加乙酸乙酯振搖提取2次，每次45 mL;合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為急支糖漿供試品二溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液、單味對(duì)照藥材溶液和缺方陰性樣品溶液制備

精密稱(chēng)取甘草苷、柚皮苷、具棲冬青苷、白花前胡甲素對(duì)照品，分別加甲醇制成每毫升各含0.25 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別稱(chēng)取5種對(duì)照藥材各1 g，加30 mL水，加熱回流2.5 h，重復(fù)提取2次，4 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，濃縮至30 mL，得對(duì)照藥材濃縮液;取對(duì)照藥材濃縮液，按照“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備單味對(duì)照藥材溶液（前胡、魚(yú)腥草參照供試品一溶液;甘草、枳殼、四季青參照供試品二溶液）。分別取缺甘草、枳殼、四季青、前胡、魚(yú)腥草的陰性樣品按“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備缺方陰性樣品溶液。

2.1.3 甘草、枳殼和四季青藥材的HPTLC鑒別

吸取“2.1.1” “2.1.2”項(xiàng)下急支糖漿供試品二溶液、3種對(duì)照品溶液（甘草苷、柚皮苷、具棲冬青苷）、3種單味對(duì)照藥材溶液及對(duì)應(yīng)陰性樣品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一高效薄層板HSGF254上，以三氯甲烷-甲醇-水（體積比16 ∶ 10 ∶ 3，4 ℃靜置12 h取下層液）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和20 min后，以展距70 mm、溫度（24±2） ℃、相對(duì)濕度（50±5）%的條件展開(kāi);取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱顯色至斑點(diǎn)清晰，在日光下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品二溶液色譜在與甘草苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的黃色熒光斑點(diǎn)，比移值（Rf）為0.56;在與柚皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的棕色熒光斑點(diǎn)，Rf為0.39;在與具棲冬青苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的紫色熒光斑點(diǎn)，Rf為0.70。甘草、枳殼和四季青對(duì)照藥材色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)。各缺方陰性樣品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。4批急支糖漿供試品二溶液色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明該方法在不同批次的急支糖漿樣品間重復(fù)性良好。

2.1.4 前胡和魚(yú)腥草藥材的HPTLC鑒別

吸取“2.1.1” “2.1.2”項(xiàng)下急支糖漿供試品一溶液、白花前胡甲素對(duì)照品溶液、2種單味對(duì)照藥材溶液及對(duì)應(yīng)陰性樣品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一高效薄層板HSGF254上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比9 ∶ 5）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 min后，以展距75 mm、溫度（24±2） ℃、相對(duì)濕度（50±5）%的條件展開(kāi);取出，晾干，在紫外光366 nm下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖2。供試品一溶液色譜在與魚(yú)腥草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示2個(gè)相同的淡黃色熒光斑點(diǎn)，Rf分別為0.21和0.63;在與白花前胡甲素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，Rf為0.52。前胡對(duì)照藥材色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)。各缺方陰性樣品色譜在指定對(duì)照品色譜相應(yīng)位置無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。4批急支糖漿供試品一溶液色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明該方法在不同批次的急支糖漿樣品間重復(fù)性良好。

2.1.5 一板多藥味HPTLC的耐用性驗(yàn)證

（1）不同廠家的薄層板考察：以“2.1.3” “2.1.4”項(xiàng)下色譜參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同廠家的薄層板（煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司、青島海洋化工有限公司、德國(guó)Merck公司）對(duì)展開(kāi)效果的影響。結(jié)果顯示，采用HPTLC法鑒定甘草、枳殼、四季青藥材時(shí)，日光下3種薄層板均呈現(xiàn)了較好的分離效果，符合耐用性原則，詳見(jiàn)圖3;采用HPTLC法鑒定前胡、魚(yú)腥草藥材時(shí)，在紫外光366 nm下，3種薄層板均呈現(xiàn)了較好的分離效果，符合耐用性原則，詳見(jiàn)圖4。

（2）溫濕度聯(lián)合考察：以“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下色譜參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同溫濕度的展開(kāi)缸環(huán)境對(duì)展開(kāi)效果的影響。以800 mL飽和氯化鈉溶液控制薄層展開(kāi)系統(tǒng)的高相對(duì)濕度為（75±5）%，分別在室內(nèi)偏低溫度（20±2） ℃和室內(nèi)偏高溫度（28±2） ℃條件下展開(kāi);以800 mL飽和六水合氯化鎂溶液控制薄層展開(kāi)系統(tǒng)的低相對(duì)濕度為（38±5）%，分別在室內(nèi)偏低溫度（20±2） ℃和室內(nèi)偏高溫度（28±2） ℃條件下展開(kāi)。甘草、枳殼和四季青藥材的HPTLC結(jié)果顯示，除室內(nèi)偏高溫度、低相對(duì)濕度條件下Rf偏高外，整體展開(kāi)效果較好，該方法耐用性良好，詳見(jiàn)圖5。前胡和魚(yú)腥草藥材的HPTLC結(jié)果顯示，除室內(nèi)偏高溫度、高相對(duì)濕度條件下斑點(diǎn)整體Rf偏高外，其他溫濕度條件下整體展開(kāi)效果較好，該方法耐用性良好，詳見(jiàn)圖6。

2.2 HPLC法測(cè)定急支糖漿中3種活性成分的含量

2.2.1 供試品溶液制備

將瓶裝急支糖漿充分搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加入80%甲醇定容，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液和缺方陰性樣品溶液制備

取鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加80%甲醇溶解得0.913 mg/mL的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液、1.233 mg/mL的原兒茶酸對(duì)照品溶液、2.007 mg/mL的柚皮苷對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種對(duì)照品溶液250、700、700 μL，置于同一2 mL量瓶中，加入80%甲醇定容，搖勻，配制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.114、0.432、0.702 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。分別取缺麻黃、枳殼陰性樣品按照“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備缺方陰性樣品溶液。

2.2.3 色譜條件

以ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm × 4.6 mm，3.5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～4 min，11%B;4～7 min，11%B→18%B;7～18 min，18%B→21%B）;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和缺方陰性樣品溶液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各待測(cè)成分色譜峰峰形好，且分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于10 000，缺麻黃陰性樣品溶液對(duì)鹽酸麻黃堿的測(cè)定無(wú)干擾，缺枳殼陰性樣品溶液對(duì)柚皮苷的測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察及定量限、檢測(cè)限測(cè)定

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用80%甲醇分別稀釋2、5、10、25、50、100倍，將混合對(duì)照品溶液及系列稀釋混合對(duì)照品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程;以峰高信號(hào)為基線(xiàn)噪音信號(hào)的10倍確定定量限，以峰高信號(hào)為基線(xiàn)噪音信號(hào)的3倍確定檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.6 精密度考察

取一份供試品溶液（批號(hào)19040075），按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，原兒茶酸、鹽酸麻黃堿、柚皮苷峰面積的RSD分別為0.16%、0.71%、0.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性考察

取同一批急支糖漿樣品（批號(hào)19040075），按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并代入線(xiàn)性回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果顯示，原兒茶酸、鹽酸麻黃堿、柚皮苷含量的RSD分別為1.50%、1.30%、1.45%（n=6），表明供試品溶液制備方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

取一份供試品溶液（批號(hào)19040075），分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，原兒茶酸、鹽酸麻黃堿、柚皮苷峰面積的RSD分別為0.33%、1.10%、0.26%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

基于實(shí)測(cè)1 mL急支糖漿（批號(hào)19040075）中含原兒茶酸679.3 μg、鹽酸麻黃堿151.6 μg、柚皮苷1 170.8 μg，精密量取該批次急支糖漿1 mL置于10 mL量瓶中，加入1.280 mg/mL的原兒茶酸對(duì)照品溶液500 μL、0.770? ? mg/mL的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液200 μL、2.314 mg/mL的柚皮苷對(duì)照品溶液500 μL，加入80%甲醇定容，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得加樣回收樣品溶液。平行制備6份樣品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，原兒茶酸、鹽酸麻黃堿、柚皮苷的平均回收率分別為100.61%、100.40%、99.22%，RSD分別為1.21%、1.82%、1.58%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.10 急支糖漿樣品含量測(cè)定

取10批急支糖漿樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并代入線(xiàn)性回歸方程計(jì)算樣品中原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷的含量。每批樣品平行測(cè)定2次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 HPTLC鑒別和HPLC含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇

基于“整體鑒別”思路，為實(shí)現(xiàn)一板多藥味鑒別，本研究選擇甘草、枳殼、四季青藥材中的黃酮類(lèi)成分甘草苷、柚皮苷、具棲冬青苷進(jìn)行同板鑒別，選擇前胡藥材中的香豆素類(lèi)成分白花前胡甲素和魚(yú)腥草對(duì)照藥材進(jìn)行同板鑒別;使用魚(yú)腥草對(duì)照藥材鑒別雖無(wú)法指認(rèn)具體成分，但2個(gè)特征性斑點(diǎn)仍可保證鑒別的準(zhǔn)確性。薄層鑒別指標(biāo)成分的選擇均參照2020年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)：柚皮苷、具棲冬青苷（又名長(zhǎng)梗冬青苷）、白花前胡甲素均為鑒別枳殼、四季青、前胡藥材的特征成分，甘草苷是甘草藥材含量測(cè)定的特征成分，滿(mǎn)足專(zhuān)屬性條件。本研究較2020年版《中國(guó)藥典》，去除了非專(zhuān)屬性成分原兒茶酸和阿魏酸成分的鑒別，增加專(zhuān)屬性成分甘草苷（來(lái)源于甘草）、具棲冬青苷（來(lái)源于四季青）及魚(yú)腥草對(duì)照藥材特征斑點(diǎn)的鑒別。專(zhuān)屬性成分的鑒別可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)中原料藥材的可追溯性;而非專(zhuān)屬性成分由于來(lái)源于多個(gè)藥材，即便檢出也無(wú)法準(zhǔn)確判定該批次急支糖漿的質(zhì)量，所以專(zhuān)屬性成分鑒別是中藥復(fù)方制劑薄層鑒別的發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)于麻黃、金蕎麥、紫菀3種處方藥材，麻黃中的代表性成分為生物堿類(lèi)成分，樣品制備條件和展開(kāi)系統(tǒng)條件均要求偏堿性條件[16]，不適宜與其他成分進(jìn)行同板鑒別，所以仍沿用藥典方法;目前金蕎麥、紫菀的水提液中可檢出特征成分表兒茶素和紫菀酮，但在急支糖漿中無(wú)法檢出，推測(cè)與這2種成分水溶性差、工業(yè)化生產(chǎn)未粉碎藥材等因素相關(guān)[17]，筆者推薦使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)金蕎麥和紫菀的特征成分進(jìn)行鑒別。

結(jié)合質(zhì)量標(biāo)志物篩選“五原則”中的可測(cè)性、特有性和功效關(guān)聯(lián)性原則，本研究的含量測(cè)定選擇原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷3種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。原兒茶酸、鹽酸麻黃堿、柚皮苷在10批急支糖漿中的平均含量分別為623.3、152.1、1 213.9 μg/mL，且其色譜峰分離度均大于1.5，滿(mǎn)足可測(cè)性原則[15]。原兒茶酸來(lái)源于四季青、金蕎麥、魚(yú)腥草等多味藥材，雖非專(zhuān)屬性成分，卻是復(fù)方中的代表性酚酸類(lèi)成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等作用[18];鹽酸麻黃堿是麻黃藥材的特征性生物堿成分，有解熱、發(fā)汗、止咳、抗哮喘等功效[19];柚皮苷是枳殼藥材的特征性二氫黃酮類(lèi)成分，有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗?jié)兊茸饔肹20]。以上3種活性成分均與急支糖漿的功效作用相關(guān)，是潛在的質(zhì)量標(biāo)志物。

3.2 HPTLC前處理方法及薄層色譜條件考察

在HPTLC方法建立過(guò)程中，對(duì)甘草、枳殼、四季青藥材的鑒別，考察了不同樣品前處理方法（直接萃取、5%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH11～12再萃取、稀鹽酸調(diào)至pH2～3再萃取），不同展開(kāi)劑[正丁醇-乙醇-水（體積比? 4 ∶ 1 ∶ 5，取上層）、正丁醇-乙酸乙酯-水（體積比4 ∶ 1 ∶ 5，取上層）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比15 ∶ 40 ∶ 22 ∶ 15，4 ℃靜置取下層）、三氯甲烷-甲醇-水（體積比16 ∶ 10 ∶ 3，4 ℃靜置取下層）]，不同顯色劑（10%硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、2%三氯化鋁甲醇溶液），不同檢視條件（日光、紫外光254 nm和366 nm）以及不同展距（60、70、80 mm）。對(duì)急支糖漿中前胡和魚(yú)腥草藥材的鑒別，考察了不同樣品前處理方法（考察項(xiàng)同上），不同展開(kāi)劑[二氯甲烷-丙酮（體積比15 ∶ 1）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比4 ∶ 1）、三氯甲烷-甲醇（體積比19 ∶ 1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮（體積比5 ∶ 1 ∶ 4）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比? ?9 ∶ 5）]，不同顯色劑（10%硫酸乙醇溶液、5%磷鉬酸乙醇溶液、2，4-二硝基苯腈鹽酸乙醇溶液），不同檢視條件（考察項(xiàng)同上）和不同展距（65、75、85 mm）等各因素對(duì)展開(kāi)效果的影響。最終所選擇的樣品前處理方法和薄層色譜條件均為各項(xiàng)考察下的最優(yōu)結(jié)果，經(jīng)后期各項(xiàng)方法學(xué)考察證實(shí)，專(zhuān)屬性、耐用性、批次重復(fù)性良好。

3.3 HPLC前處理方法及色譜條件考察

在采用HPLC法測(cè)定含量過(guò)程中，考察了不同溶劑（60%甲醇、80%甲醇、甲醇、80%乙醇、乙醇）制備供試品溶液的效果，考察了水相添加劑0.1%磷酸、0.1%甲酸和0.1%冰醋酸的分離效果，考察了柱溫30、35、40、45 ℃的分離效果，也考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)、進(jìn)樣量、流速等多個(gè)色譜條件，選擇了最優(yōu)的樣品制備方法和色譜條件作為本實(shí)驗(yàn)條件。其中，鹽酸麻黃堿僅在210 nm下有末端吸收，當(dāng)使用0.1%磷酸作為添加劑時(shí)，在210 nm波長(zhǎng)下整體基線(xiàn)平穩(wěn)，所以本色譜條件對(duì)于僅有末端吸收的化合物成分檢測(cè)非常適用。經(jīng)驗(yàn)證，本研究所建立的HPLC含量測(cè)定方法同樣適用于1200型HPLC系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司），耐用性好。

綜上，本研究建立了急支糖漿的一板多藥味HPTLC鑒別法和HPLC含量測(cè)定法。HPTLC法采用1種樣品前處理方法、2個(gè)薄層色譜條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)急支糖漿中5種藥材的快速鑒別，并同時(shí)覆蓋君、臣、佐、使4類(lèi)配伍藥材，專(zhuān)屬性、耐用性、批次重復(fù)性良好;HPLC法實(shí)現(xiàn)了對(duì)急支糖漿中3種活性成分原兒茶酸、鹽酸麻黃堿和柚皮苷的快速定量，方法便捷高效，精密度、穩(wěn)定性、耐用性好。本研究為優(yōu)化《中國(guó)藥典》中急支糖漿的鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)、提升其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：1372-1373.

[ 2 ] 紅星新聞.趕快收藏！四川新冠肺炎中醫(yī)藥防控技術(shù)指南（第五版）來(lái)了[EB/OL].[2021-10-10]. https：//sichuan.scol.com.cn/sczh/202012/57978238.html.

[ 3 ] 張婭.急支糖漿研究概述[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2019，15（8）：182-184.

[ 4 ] 張前進(jìn)，崔海燕，黎巍威，等.“清肺止咳化痰湯”治療急性氣管-支氣管炎及慢性支氣管炎急性發(fā)作149例臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2017，23（2）：237-239，265.

[ 5 ] 陳延軍，郝東偉，楊立波.急支糖漿或抗生素治療單純急性氣管-支氣管炎的隨機(jī)對(duì)照臨床研究[J].中藥藥理與臨床，2015，31（1）：262-264.

[ 6 ] 潘娓婕，劉琳，劉曉星，等.高效液相色譜-電化學(xué)法測(cè)定四季青葉中4種化合物的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（6）：870-873.

[ 7 ] 李敏，郭青，張瀟. HPLC法同時(shí)測(cè)定金蕎麥片中6個(gè)多酚類(lèi)成分[J].藥物分析雜志，2015，35（4）：644-648.

[ 8 ] 萬(wàn)昶宸，劉艷艷，楊浩天，等. HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定紫菀中9種化學(xué)成分[J].中草藥，2016，47（14）：2534-2539.

[ 9 ] VERARDO V，GLICERINA V，COCCI E，et al. Determination of free and bound phenolic compounds and their antioxidant activity in buckwheat bread loaf，crust and crumb[J]. LWT，2018，87：217-224.

[10] 閆凱莉，尹程程，劉夢(mèng)瑤，等.芩連潤(rùn)肺湯的HPLC指紋圖譜建立、含量測(cè)定及多元統(tǒng)計(jì)分析[J].中國(guó)藥房，2021，32（16）：1956-1963.

[11] 周躍華，路金才，周娟，等.關(guān)于中藥新藥復(fù)方制劑“整體鑒別”新模式的思考[J].中草藥，2021，52（8）：2199-2204.

[12] 張子龍，李雯珊，滕菲，等.絞股藍(lán)總苷提取物及總苷片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2020，45（24）：5976- 5981.

[13] LIU F，WANG M Y，LI X B. Simultaneous qualitative characterization of four herbs in Weikangling capsules by a validated high-performance thin-layer chromatography method[J]. JPC-J Planar Chromatogr-Mod TLC，2020，33（5）：449-455.

[14] MEIER B，SPRIANO D. Modern HPTLC：a perfect tool for quality control of herbals and their preparations[J]. J AOAC Int，2010，93（5）：1399-1409.

[15] 劉昌孝.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）：提高中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制理論和促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展[J].中草藥，2019，50（19）：4517-4518.

[16] 李紅霞，丁明玉，呂琨，等.麻黃、含麻黃中成藥及生物體液中麻黃堿的定量分析方法[J].藥物分析雜志，2001，21（2）：142-145.

[17] 巢穎欣，劉夢(mèng)詩(shī)，楊秀娟，等.薄層色譜法快速鑒別廣陳皮與陳皮[J].中成藥，2021，43（7）：1937-1940.

[18] AL OLAYAN E M，ALOUFI A S，ALAMRI O D，et al. Protocatechuic acid mitigates cadmium-induced neuro- toxicity in rats：role of oxidative stress，inflammation and apoptosis[J]. Sci Total Environ，2020，723：137969.

[19] WU X，ZHANG H B，F(xiàn)AN S S，et al. Quality markers based on biological activity：a new strategy for the quality control of traditional Chinese medicine[J]. Phytomedicine，2018，44：103-108.

[20] CHEN R，QI Q L，WANG M T，et al. Therapeutic potential of naringin：an overview[J]. Pharm Biol，2016，54（12）：3203-3210.

（收稿日期：2021-10-12 修回日期：2021-12-14）

（編輯：曾海蓉）

1590501705214