SPE-UPLC-MS/MS法鑒別含龜鱉甲的中成藥

劉宇文， 伍 勛， 諶 宇， 鄒耀華， 侯 娜

(杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310022)

鱉甲、龜甲均收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，均為單一來(lái)源中藥，分別為鱉的背甲和烏龜?shù)谋臣准案辜譡1]，本課題組前期研究和有關(guān)文獻(xiàn)均顯示當(dāng)前混偽情況在龜鱉甲類(lèi)中藥中較多[2-3]，這些混偽品有可能會(huì)轉(zhuǎn)移到中成藥中，因此其質(zhì)量如何也需要研究人員密切關(guān)注。

傳統(tǒng)的性狀鑒別是龜鱉甲類(lèi)藥材的主要鑒別手段，但對(duì)于含該類(lèi)藥材的中成藥并不適用，分子鑒定技術(shù)在龜鱉甲類(lèi)藥材的報(bào)道較多，推廣到中成藥也還不成熟[4-7]。近年來(lái)，特征肽段專(zhuān)屬性鑒別方法在膠類(lèi)藥材監(jiān)管中應(yīng)用成熟[8-13]，課題組結(jié)合相關(guān)研究，擬將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法與固相萃取小柱(SPE)聯(lián)合應(yīng)用，建立可用于檢測(cè)中成藥中11種龜鱉甲(烏龜、巴西紅耳龜、花龜、黃喉水龜、黃緣閉殼龜、緬甸陸龜、小鱷龜、印度楞背龜、鱉、角鱉、珍珠鱉)類(lèi)成分的專(zhuān)屬性方法。

1 材料

1.1 儀器 G6495B型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配置MPP(MassProfiler Professional)(Ver.B.14.00)、MassHunter (Ver.B.10.00)；XS205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；TW-8型恒溫水浴鍋(深圳市優(yōu)博萊科技有限公司)。

1.2 試劑 Oasis 親生親油平衡固相萃取柱(美國(guó)Waters公司，批號(hào)150A37158B)；測(cè)序用胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)SLBZ8570)。碳酸氫銨(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20190911)；乙腈(美國(guó)Tedia公司，批號(hào)AS1122-001，質(zhì)譜純)；甲酸(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)100291，質(zhì)譜純)；水為超純水。

1.3 藥材 鱉TrionyxsinensisWiegmann、烏龜Chinemysreevesii(Grsy)、巴西紅耳龜Trachemysscriptaelegans(Wied.)、黃喉水龜Clemmysmutica(Cantor)、花龜Ocadiasinensis(Gray)、小鱷龜Chelydraserpentina(Linnaeus)、黃緣閉殼龜CyclemysflavomarginataGray.、緬甸陸龜Testudoelongate(Blyth)、印度楞背龜Kachugatectum(Gray)、角鱉Apalonespinifera、珍珠鱉Apaloneferox(Schneider)對(duì)照藥材經(jīng)杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院諸葛隴副主任中藥師鑒定為正品，標(biāo)本保存于杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥天然藥物檢驗(yàn)所標(biāo)本室中。35批市售中成藥涉及19個(gè)品種，其中18批含鱉甲類(lèi)成分，17批含龜甲類(lèi)成分，具體見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Eclipse Plus十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 ESI+離子源；MRM模式，正負(fù)離子切換掃描；毛細(xì)管電壓4 kV；錐孔電壓166 V；源區(qū)溫度325 ℃；干燥氣溫度200 ℃；體積流量 14 L/min；霧化器壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)；霧化氣、碰撞氣N2。

2.1.3 特征離子對(duì)MRM條件建立 本課題組提取11種龜鱉甲的蛋白溶液，以胰蛋白酶酶解對(duì)照藥材溶液，利用高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF)與化學(xué)統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合進(jìn)行分析，獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以分子特征提取模式提取保留時(shí)間和質(zhì)荷比(m/z)參數(shù)，作為一個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)(EMRT數(shù)據(jù)對(duì))，并剔除異常數(shù)據(jù)結(jié)果，保存為CEf文件。總離子流圖CEf文件采用MPP軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，11種龜鱉甲各自特征肽段信息被查找到，再將特征肽段信息導(dǎo)入安捷倫定性分析軟件Agilent Qualitative Analysis B.10.00進(jìn)行再驗(yàn)證確認(rèn)，最終確定了11種龜鱉甲的專(zhuān)屬性特征肽段[3,14-15]。針對(duì)篩選出的特征肽段，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)建立MRM方法，詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表1 中成藥信息

表2 梯度洗脫程序

表3 特征離子MRM采集參數(shù)

2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取對(duì)照藥材(粉碎，過(guò)4號(hào)篩)各約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL超純水，稱定質(zhì)量，室溫浸泡1 h，加熱回流1 h，放冷，超純水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加入0.5 g NH4HCO3，使溶解并搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL至5 mL量瓶中，加新制胰蛋白酶溶液1 mL(1 mg/mL 1%NH4HCO3溶液)，1%NH4HCO3溶液稀釋?zhuān)ㄈ葜量潭?，搖勻，37 ℃酶解12 h，即得[3]。

2.3 供試品溶液制備 取35批樣品(固體粉碎并過(guò)4號(hào)篩，液體適量混勻)適量，加入超純水混勻(約相當(dāng)于處方中原藥材1 g)，精密稱定質(zhì)量，置于150 mL具塞錐形瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，再用HLB固相萃取小柱凈化酶解液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方制備不含龜鱉甲類(lèi)成分的陰性樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 肽段純化及條件優(yōu)化 采用HLB固相萃取小柱凈化酶解液[16]，先進(jìn)行HLB固相萃取小柱活化(依次用1 mL甲醇、1 mL 1%甲酸活化)，然后取1 mL 對(duì)照品酶解液加到SPE小柱上，再依次用5%甲醇、1%甲酸進(jìn)行洗脫，用1 mL含1%甲酸-乙腈(80∶20)溶液分次洗脫，收集洗脫液，洗脫液用氮?dú)獯蹈?，?00 μL含0.1%甲酸-乙腈(95∶5)復(fù)溶，為進(jìn)一步考察固相萃取過(guò)程對(duì)目標(biāo)特征多肽的損失，分別取11種龜鱉甲對(duì)照藥材酶解溶液過(guò)HLB柱，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)照藥材特征肽固相萃取純化效果(n=3)

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“2.4”項(xiàng)下方法制備大補(bǔ)陰丸的陰性樣品溶液，再以龜甲對(duì)照藥材、含龜甲類(lèi)成分中成藥為陽(yáng)性對(duì)照，按“2.3”項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照藥材溶液，選擇龜甲(烏龜)特征離子對(duì)m/z442.7(雙電荷)～631.3和m/z442.7(雙電荷)～560.3，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，在與陽(yáng)性對(duì)照藥材溶液色譜圖中相應(yīng)位置上，陰性樣品未出現(xiàn)相應(yīng)特征離子對(duì)色譜峰，表明該方法具有良好的專(zhuān)屬性。同法對(duì)其他中成藥進(jìn)行專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)，也得到類(lèi)似結(jié)果。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照藥材適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、6、12、18、24、48 h在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲峰面積RSD分別為6.6%、5.4%、4.9%、7.1%、6.6%、8.2%、5.3%、5.8%、5.7%、6.2%、4.7%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

注：1為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)～560.0,2為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)～631.0。圖1 龜甲類(lèi)成分的特征分子離子峰色譜圖

2.8 檢測(cè)限 將對(duì)照藥材溶液逐級(jí)稀釋后，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3∶1為檢測(cè)限，測(cè)得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲檢測(cè)限分別為0.04、0.1、0.1、0.8、2、1、0.1、1、1、0.5、0.1 g/L。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大補(bǔ)陰丸6份(批號(hào)181014)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用龜甲(烏龜)的特征離子對(duì)m/z442.7(雙電荷)～631.3和m/z442.7(雙電荷)～560.3，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得上述特征離子對(duì)峰均有檢出，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 結(jié)果分析 18批含鱉甲的中成藥均檢出鱉甲(鱉)類(lèi)成分，其中還有1批檢出珍珠鱉甲類(lèi)成分；17批次含龜甲類(lèi)成分中成藥中有2批只檢出龜甲(烏龜)類(lèi)成分，6批只檢出巴西紅耳龜甲類(lèi)成分，4批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲類(lèi)成分，3批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜甲類(lèi)成分，1批同時(shí)檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜龜甲、緬甸陸龜甲、花龜甲及鱉甲類(lèi)成分，1批未檢出龜甲類(lèi)成分，可能未投料或投料量太少。由此可知，含龜甲的中成藥大多存在偽品混充或者摻偽情況，僅12%的原料藥材基源符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，提示各有關(guān)部門(mén)應(yīng)對(duì)該類(lèi)中成藥的質(zhì)量控制引起足夠重視，雖然含鱉甲的中成藥情況稍好，但有關(guān)部門(mén)也需加強(qiáng)監(jiān)管。

3 討論

龜鱉甲類(lèi)藥材在我國(guó)使用歷史悠久，均具有補(bǔ)陰益氣的功效，也是眾多中成藥的原料，例如大補(bǔ)陰丸、小兒肺咳顆粒、龜鹿二仙膏、化癥回生片、龜鱉丸、鹿龜酒等。前期研究發(fā)現(xiàn)，龜甲摻偽情況較為嚴(yán)重，例如，巴西紅耳龜、小鱷龜、中華花龜?shù)?，常有混入龜鱉甲藥材中。由于龜鱉甲類(lèi)藥材品種基源的混亂，必然會(huì)造成含龜鱉甲的中成藥質(zhì)量的不可控，不利于該類(lèi)中成藥的系統(tǒng)深入研究，也將增加監(jiān)管的和風(fēng)險(xiǎn)和難度，同時(shí)，國(guó)家已出臺(tái)一些列法律法規(guī)加強(qiáng)對(duì)野生動(dòng)物的保護(hù)，如何防止諸如緬甸陸龜?shù)缺Ｗo(hù)野生進(jìn)入中藥領(lǐng)域，也是急需研究的課題。

龜鱉甲類(lèi)藥材傳統(tǒng)性狀鑒別存在著很大的局限性，而中成藥中的龜鱉甲類(lèi)成分已粉碎或提取過(guò)，性狀鑒別更是無(wú)能為力。龜鱉甲類(lèi)藥材報(bào)道較多的DNA分子鑒定技術(shù)，應(yīng)用于中成藥尚有一定難度。蛋白質(zhì)、多肽等成分在龜鱉甲類(lèi)藥材占主要部分，也是其重要的活性成分之一，利用串聯(lián)質(zhì)譜識(shí)別不同種源的龜鱉甲類(lèi)藥材酶解后的溶液，可達(dá)到鑒別的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期相關(guān)研究，最終建立了適合多種含龜鱉甲類(lèi)中成藥的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽專(zhuān)屬性檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)所建立的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽檢測(cè)方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥質(zhì)量控制，鑒于每種中成藥中龜鱉甲類(lèi)藥材的投料比例有所不同，建議檢測(cè)時(shí)適當(dāng)調(diào)整取樣量，本課題組下一步將擬研究建立含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥特征離子含量測(cè)定方法，用于該類(lèi)中成藥的控制質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，由于多為生粉投料，含龜鱉甲類(lèi)成分中成藥采用超聲法提取效率不高[17-18]，最終確定采用加熱回流提取法提取，效果較好。研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品酶解液含較多雜質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，可用固相萃取小柱來(lái)凈化，先用5%甲醇可清洗極性大的蛋白質(zhì)等物質(zhì)和鹽，也可以防止孔堵塞，再20%酸性乙腈可洗脫目標(biāo)物，非目標(biāo)物留在固相萃取小柱上，達(dá)到了凈化酶解液的目的。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，由于龜甲價(jià)格遠(yuǎn)高于巴西紅耳龜甲，龜甲類(lèi)成分中成藥中主要混偽品為巴西紅耳龜甲[3]，質(zhì)量不容樂(lè)觀，建議急需加強(qiáng)監(jiān)管。另外，含鱉甲類(lèi)成分中成藥檢測(cè)結(jié)果，僅1批檢出混淆珍珠鱉甲類(lèi)成分，表明質(zhì)量狀況尚好，可能因?yàn)轺M養(yǎng)殖量已經(jīng)非常大，成熟的養(yǎng)殖技術(shù)完全能夠滿足臨床用藥需要。