青花菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)miRNA的鑒定與表達(dá)特征分析

裴徐梨，荊贊革,2，唐 征，馮鵬宇

(1 昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650214；2 溫州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江溫州 325006)

miRNA是一類重要的內(nèi)源性單鏈小分子RNA[1]。前人研究表明，miRNA及其靶基因在花粉發(fā)育和育性調(diào)控中具有重要的作用[2]。例如，miR156可通過(guò)調(diào)節(jié)SPL轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)影響擬南芥雄配子的產(chǎn)生[3]；miR159a-1能夠抑制MYB基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控花芽分化和植株育性[4]；miR172與其靶基因(AP2類基因)共同調(diào)節(jié)擬南芥的開(kāi)花時(shí)間和器官形成[5]。近年來(lái)，利用高通量測(cè)序技術(shù)很多與植物育性相關(guān)的miRNA已被成功鑒定出來(lái)[6-8]。

青花菜雜種優(yōu)勢(shì)非常明顯。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以其育性穩(wěn)定、開(kāi)花能力優(yōu)良和雜交率高等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于青花菜雜交育種體系中。本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了青花菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的sRNA文庫(kù)，共鑒定到47個(gè)差異表達(dá)miRNA。同時(shí)，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了部分miRNA及其靶基因的表達(dá)特征，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討miRNA調(diào)控青花菜育性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以回交8代以上的青花菜Ogu細(xì)胞質(zhì)雄性不育系WN12-95A(MS)及其保持系WN12-95B(FS)為試驗(yàn)材料。于花期采集長(zhǎng)度小于2 mm的不育系和保持系花蕾用于高通量測(cè)序。采集不育系和保持系3個(gè)不同時(shí)期花蕾(長(zhǎng)度< 2 mm、2～4 mm、> 4 mm)以及保持系大于4 mm花蕾的不同部位(花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊)用于qRT-PCR分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青花菜sRNA文庫(kù)構(gòu)建和miRNA的鑒定從質(zhì)量合格的總RNA中分離和純化得到長(zhǎng)度合適的small RNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，而后進(jìn)行高通量測(cè)序。采用SOAP2將過(guò)濾得到高質(zhì)量clean read比對(duì)到青花菜轉(zhuǎn)錄組參考序列[8]。已知miRNA的鑒定通過(guò)miRDeep2軟件比對(duì)到miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)；新型miRNA的預(yù)測(cè)則通過(guò)堿基延伸未比對(duì)上的序列，再通過(guò)MIREAP軟件進(jìn)一步的篩選。

1.2.2 青花菜不育系和保持系差異miRNA的篩選將miRNA表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理，使用歸一化的數(shù)據(jù)計(jì)算Fold Change(FC)和P值。差異表達(dá)miRNA的篩選以|log2(FC)| ≥ 1，P< 0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 青花菜差異miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋使用psRNA Target軟件進(jìn)行潛在靶基因的預(yù)測(cè)[9]，錯(cuò)配小于4的基因被選為候選靶基因。同時(shí)基于 sRNA 和 mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，采用關(guān)聯(lián)分析的方法鑒定雄性不育相關(guān)差異表達(dá)基因[10]與差異miRNA的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析差異miRNA及靶基因的表達(dá)特性miRNA及總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄均使用TaKaRa公司試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量參照Xu等的方法[11]，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)在ABI 7500(Applied Biosystems公司)上運(yùn)行。miRNA反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。靶基因反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算。以U6 和actin基因分別作為miRNA及其靶基因的內(nèi)參基因。試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜不育系和保持系sRNA數(shù)據(jù)分析

構(gòu)建了青花菜雄性不育系和保持系花蕾的2個(gè)sRNA文庫(kù)，共得到47.88 M原始數(shù)據(jù)(表2)。過(guò)濾掉經(jīng)接頭序列和低質(zhì)量序列后，分別獲得15.44 M(不育系)和24.26 M(保持系)的clean reads，分別占Reads總數(shù)的76.6%和87.5%。過(guò)濾后序列的總堿基對(duì)不育系和保持系分別為351 525 505 bp和535 664 137 bp。

2.2 青花菜不育系和保持系miRNA的鑒定

青花菜不育系和保持系中共鑒定到69個(gè)家族中的181個(gè)已知miRNA，包括138個(gè)保守miRNA和43個(gè)非保守miRNA。其中miR156家族成員數(shù)最多，為10個(gè)，而大部分保守miRNA家族僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)成員。miR403和miR167表達(dá)豐度分別為351 989和 278 824，在2個(gè)樣品中呈現(xiàn)高表達(dá)；而miR1520、miR529和miR535的表達(dá)豐度均較低。

青花菜不育系和保持系中共鑒定到8個(gè)新型miRNA(表3)，其中1個(gè)新型miRNA在保持系中特異性表達(dá)。對(duì)這些新型miRNA的基本信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示它們的最小自由能(the minimum free energy，MFE)為-40.70～-24.10 kcal/mol，長(zhǎng)度介于21到25 nt。

表3 青花菜不育系和保持系中鑒定的新型miRNA

2.3 青花菜雄性不育相關(guān)miRNA的鑒定

通過(guò)比較2個(gè)文庫(kù)中的miRNA的表達(dá)量，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn), 43個(gè)已知miRNA和4個(gè)新型miRNA在青花菜不育系和保持系中差異表達(dá)。其中，24個(gè)已知miRNAs和4個(gè)新型miRNAs表達(dá)上調(diào)，其余miRNA表達(dá)下調(diào)；6個(gè)差異表達(dá)miRNA的差異倍數(shù)大于8；2個(gè)差異miRNA只在不育系中表達(dá)，7個(gè)差異miRNA為保持系所特有。

A.已知miRNA； B.新型miRNA圖1 青花菜不育系(MS)和保持系(FS)差異miRNA表達(dá)量比較分析Fig.1 Comparative relative expressions of differentially expressed miRNAs in male sterile line (MS) and maintainer line (FS) of broccoli

2.4 青花菜差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

利用psRNA Target軟件共預(yù)測(cè)到188條靶序列。通過(guò)進(jìn)一步的靶基因功能分析，發(fā)現(xiàn)其中一些靶基因是雄性不育發(fā)生和花粉發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子。例如AP2-like轉(zhuǎn)錄因子、鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白基因、激素響應(yīng)因子(auxin response factors家族，ARF)和SPL(squamosa promoter binding protein-like)結(jié)合蛋白基因等。同時(shí)，一些靶基因編碼的磷酸甘油酸激酶、三角狀五肽重復(fù)蛋白質(zhì)、油質(zhì)蛋白、谷氨酸脫羧酶和γ-微管蛋白復(fù)合體等都是該過(guò)程中重要的生物蛋白。

圖2顯示，差異表達(dá)miRNA的靶基因經(jīng)GO注釋為17個(gè)生物學(xué)過(guò)程類目，10個(gè)細(xì)胞成分類目和11個(gè)分子功能類目，表明這些靶基因參與了多種代謝和發(fā)育過(guò)程。KEGG注釋結(jié)果(圖3)將靶基因分為23個(gè)代謝途徑，其中“植物病原菌的相互作用”(ko04626)、“N-糖鏈的合成”(ko00510)和“線粒體的脂肪酸延伸”(ko00062)為靶基因參與最多的途徑。COG注釋結(jié)果(圖4)可將靶基因分為19個(gè)不同的功能類。其中屬于“一般功能預(yù)測(cè)”類群的靶基因數(shù)最多(圖4)。

圖2 青花菜差異表達(dá)miRNA靶基因的GO注釋Fig.2 Gene ontology analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

圖3 青花菜差異表達(dá)miRNA靶基因的KEGG注釋Fig.3 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

圖4 青花菜差異表達(dá)miRNA靶基因的COG注釋Fig.4 Clusters of orthologous groups of proteins analysis for target genes of differentially expressed miRNAs in broccoli

2.5 青花菜雄性不育相關(guān)miRNAs與mRNAs的關(guān)聯(lián)分析

將本實(shí)驗(yàn)室的青花菜sRNA 和 mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定到2個(gè)關(guān)聯(lián)的miRNA-mRNA對(duì)(miR859-1/T2-Unigene_BMK.21608和miR5174e-1/T2_Unigene_BMK.31772)(圖5，A)。分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)miRNA均負(fù)向調(diào)控相應(yīng)的靶基因(圖5，B)。對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，miR859-1靶向的花粉外壁蛋白基因(T2/Unigene_BMK.21608)和miR5174e-1調(diào)控的氨基酸通透酶基因(T2_Uni-gene_BMK.31772)均可參與雄性不育的發(fā)生過(guò)程。

圖5 青花菜雄性不育相關(guān)miRNAs與mRNAs的關(guān)聯(lián)分析(A)及表達(dá)特性(B)Fig.5 The association analysis (A) and expression patterns (B) of CMS-related miRNAs and mRNAs in broccoli

2.6 青花菜育性相關(guān)miRNA表達(dá)特性分析

選取青花菜育性相關(guān)的8個(gè)miRNA(5個(gè)已知miRNA和3個(gè)新型miRNA)進(jìn)行熒光定量PCR分析，在花蕾不同時(shí)期的表達(dá)模式分析結(jié)果(圖6，Ⅰ)顯示，miR159a-1、miR164a-1、miR319a-1和miRn11在不育系(A1)中的表達(dá)量高于保持系(B1)。其中，miR164a-1、miR319a-1和miRn11的表達(dá)水平隨著不育系花蕾的發(fā)育逐漸降低，但在保持系花蕾中的表達(dá)量隨著花蕾發(fā)育呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；miR159a-1的表達(dá)量在不育系和保持系花蕾發(fā)育初期均最高，以后表達(dá)量逐漸下降。此外，miR397a-2、miR168a-4、miRn4和miRn16在保持系中上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)模式各有差異。miRn4在不育系花蕾中的表達(dá)量逐漸增加，在保持系中表達(dá)趨勢(shì)相反；其余3個(gè)miRNA在不育系和保持系中的表達(dá)趨勢(shì)一致。同時(shí)，進(jìn)一步比較靶基因和miRNA的表達(dá)特性后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA與其對(duì)應(yīng)的靶基因基本呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì)。

A. 不育系;B. 保持系;1、2、3分別代表 < 2 mm、2～4 mm和 > 4 mm的花蕾圖6 青花菜miRNA及其對(duì)應(yīng)靶基因在不同發(fā)育時(shí)期花蕾和不同部位中的表達(dá)特征A. Male sterile line; B. Maintainer line; 1, 2 and 3. were buds with length of < 2 mm, 2-4 mm, and > 4 mm, respectivelyFig.6 Expression characteristics of miRNAs and their corresponding targets in different developmental stages and different parts of flower buds in broccoli

由圖6，Ⅱ可以看出，miR168a-4、miR159a-1、miR164a-1和miRn4在青花菜不同部位均有表達(dá),且表達(dá)量差異不大；miR319a-1在雄蕊中的表達(dá)量最高，在花萼、花瓣和柱頭中的表達(dá)量降低；miRn11在花萼中的表達(dá)量明顯高于其他組織，而與之相反，miRn16在花萼中的表達(dá)量極低；miR397a-2在雄蕊中表達(dá)量最高，但在花瓣和柱頭中幾乎不表達(dá)，推測(cè)其具有組織特異性。

3 討 論

miRNA的基本特征分析是了解其調(diào)控作用的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中sRNA的長(zhǎng)度分析結(jié)果符合植物miRNA的特征。然而，青花菜的23 nt miRNAs的數(shù)量高于21 nt miRNAs，表明這些miRNA調(diào)控育性的機(jī)制可能具有其特點(diǎn)。近年來(lái)，大量研究表明已知miRNA通常具有較高的表達(dá)水平，且其功能在植物進(jìn)化中較保守。而新型miRNA的表達(dá)量明顯低于保守miRNA。在本研究中鑒定到的青花菜miRNA也存在此現(xiàn)象。

3.1 青花菜表達(dá)上調(diào)miRNA的調(diào)控機(jī)制探討

植物雄性不育的發(fā)生是一系列相關(guān)miRNA參與的結(jié)果。本研究共鑒定到29個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNA，其中miR397a-2靶向laccase-like轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物發(fā)育過(guò)程中油菜素內(nèi)酯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。油菜素內(nèi)酯作為雄性不育發(fā)生的重要因子，其含量升高可降低擬南芥花粉的釋放效率[12]。此外，上調(diào)表達(dá)水稻OsLAC(laccase-like gene)基因可導(dǎo)致部分雄性不育[13]。本試驗(yàn)中miR397a-2在青花菜不育系中的表達(dá)量顯著低于保持系，因此推測(cè)miR397a-2可能是通過(guò)調(diào)控LAC基因的表達(dá)來(lái)參與青花菜的雄性不育發(fā)生。

激素響應(yīng)因子(ARF類基因)在大豆中可以通過(guò)結(jié)合激素響應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控花粉發(fā)育。miR395的靶基因中就有ARF3(auxinresponsefactor3)，且該miRNA在保持系中的表達(dá)量高出不育系4.7倍。因此，推測(cè)miR395能夠通過(guò)調(diào)節(jié)激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)影響青花菜的育性。

3.2 青花菜表達(dá)下調(diào)miRNA的調(diào)控機(jī)制探討

miRNA與其靶基因相互作用來(lái)調(diào)控花粉發(fā)育[14]。miR156通過(guò)介導(dǎo)SBP-box基因來(lái)調(diào)控花粉發(fā)育。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)SPL可以保護(hù)花粉育性[3]。青花菜miR156在不育系中高表達(dá)，推測(cè)miR156可能通過(guò)調(diào)控SBP-box基因的表達(dá)來(lái)影響其育性。三角狀五肽重復(fù)蛋白(pentatricopeptide repeat gene,PPR)在RNA編輯中具有重要功能。miR158、miR400、miR859和miR5067均靶向PPR基因，且在青花菜保持系中的表達(dá)量低于不育系。現(xiàn)有研究表明PPR基因可使蘿卜育性恢復(fù)[15-18]。因此，我們推測(cè)miRNA抑制雄性不育相關(guān)的PPR基因的表達(dá)是青花菜雄性不育發(fā)生的可能原因之一。

Ca2+運(yùn)輸功能障礙可影響花粉發(fā)育。鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶是鈣離子流入細(xì)胞的調(diào)節(jié)器[19]。預(yù)測(cè)靶向鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶基因的miR399在青花菜保持系中下調(diào)表達(dá)，推測(cè)其在不育系中的高表達(dá)引起花粉發(fā)育過(guò)程中鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)和Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路的減弱，從而導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生。