茶樹(shù)SBP-box轉(zhuǎn)錄因子的比較基因組學(xué)與遺傳分析

谷夢(mèng)雅，侯炳豪，王鵬杰,，高 婷，張興坦，葉乃興*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002； 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120)

Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(SBP-box)基因是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，也稱(chēng)SPL(squamosa promoter binding protein-like)，包含高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域[1]。該結(jié)構(gòu)域包含約76個(gè)氨基酸殘基，包括2個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)(Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-His)和1個(gè)核定位信號(hào)(NLS)[2]。SBP-box基因首次從金魚(yú)草的花序cDNA文庫(kù)中分離，并發(fā)現(xiàn)SQUAMOSA的啟動(dòng)子可以和某種核內(nèi)蛋白發(fā)生特異結(jié)合激活該基因的轉(zhuǎn)錄[3]。目前已在其他植物中得到鑒定，如擬南芥[4]、番茄[5]和楊樹(shù)[6]等。在植物中，SBP-box基因參與了不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括調(diào)控開(kāi)花[7]、控制植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化[8]和調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答[9]等。目前SBP轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)中的研究較少，劉亞芹等[10]從茶樹(shù)中克隆出CsSPL6和CsSPL9，發(fā)現(xiàn)Csn-miR156a可能通過(guò)負(fù)調(diào)控CsSPL6和CsSPL9參與茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程，并下調(diào)CsSPL9來(lái)增加耐高溫性。前人對(duì)SBP轉(zhuǎn)錄因子的鑒定主要是在組裝水平較低的茶樹(shù)基因組水平上且研究集中在SBP基因?qū)Σ铇?shù)非生物脅迫和激素的響應(yīng)[11-12]，關(guān)于SBP轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)方面的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。

雜種優(yōu)勢(shì)是指雜種后代在生長(zhǎng)勢(shì)、生物量、抗逆性和適應(yīng)性等方面優(yōu)于親本的現(xiàn)象，國(guó)外學(xué)者曾提出顯性、超顯性和上位性等3個(gè)經(jīng)典的假說(shuō)[13]，然而這些假說(shuō)不足以完全解釋其分子機(jī)制。茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]是多年生異花授粉植物，‘鐵觀音’和‘黃棪’是烏龍茶的主栽品種，因其制茶品質(zhì)優(yōu)異成為烏龍茶育種的重要親本[14]，前人以‘鐵觀音’為母本，‘黃棪’為父本，從F1中選育出‘金觀音’、‘黃觀音’、‘金玫瑰’、‘金牡丹’等早生優(yōu)質(zhì)新品種[15]。郭吉春等[16]研究表明‘金觀音’和‘黃觀音’超親優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高；楊軍等[17]對(duì)‘紫玫瑰’、‘金觀音’、‘金牡丹’、‘悅茗香’及其自然雜交后代的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究表明自然雜交后代有較強(qiáng)母本遺傳效應(yīng)，4個(gè)群體具有明顯的群體遺傳組成特征，然而對(duì)茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)的分子方面研究幾乎是空白。課題組前期研究表明‘金觀音’和‘黃觀音’在揮發(fā)性代謝物上具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)[18]，另外與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的TGY15和TGY283等超高親基因，在‘金觀音’中的表達(dá)量均高于其親本[19]。本課題組前期通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)GRF基因家族在不同茶樹(shù)品種間的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CsGRF2、CsGRF5、CsGRF14等在‘黃觀音’、‘紫玫瑰’中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)表達(dá)，可能與茶樹(shù)生長(zhǎng)勢(shì)雜種優(yōu)勢(shì)的形成有關(guān)[20]。此外，雜交子代基因與親本基因表達(dá)模式的關(guān)系可分為加性和非加性，加性表達(dá)即中親表達(dá)，而超高親、低于雙親、偏高親和偏低親等4種表達(dá)模式屬于非加性表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)非加性表達(dá)基因在茶樹(shù)揮發(fā)性雜種優(yōu)勢(shì)中起著關(guān)鍵作用[18]，且非加性表達(dá)基因可能受到轉(zhuǎn)錄因子(TF)等調(diào)控因子的影響[21]。

CsSBP在茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)調(diào)控中的作用尚不清楚，且SBP基因數(shù)量在茶樹(shù)中是否具有普遍性仍不明確。因此本研究基于最新組裝破譯的染色體級(jí)別的茶樹(shù)‘鐵觀音’和‘黃棪’基因組，對(duì)茶樹(shù)‘鐵觀音’基因組中SBP基因進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定和生物信息學(xué)分析，并對(duì)‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’等3個(gè)不同茶樹(shù)基因組的SBP基因進(jìn)行鑒定和比較，包括系統(tǒng)發(fā)育與共線性分析等。此外，通過(guò)熒光定量檢測(cè)CsTGY_SBP家族成員在‘鐵觀音’和‘黃棪’及其F1代品種‘金觀音’、‘黃觀音’、‘金牡丹’、‘紫玫瑰’等嫩梢中的表達(dá)模式，并與‘鐵觀音’的自然雜交品種‘紫牡丹’、‘黃棪’的自然雜交品種‘瑞香’的表達(dá)量進(jìn)行比較，為完善SBP基因家族的研究及其在雜種和親本上的遺傳規(guī)律提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

以母本‘鐵觀音’(Camelliasinensis‘Tieguanyin’，TGY)、父本‘黃棪’(Camelliasinensis‘Huangdan’，HD)，及雜交后代品種‘金觀音’(Camelliasinensis‘Jinguanyin’，JGY)、‘黃觀音’(Camelliasinensis‘Huangguanyin’，HGY)、‘金牡丹’(Camelliasinensis‘Jinmudan’，JMD)、‘紫玫瑰’(Camelliasinensis‘Zimeigui’，ZMG)和‘鐵觀音’自然雜交品種‘紫牡丹’(Camelliasinensis‘Zimudan’，ZMD)、‘黃棪’自然雜交品種‘瑞香’(Camelliasinensis‘Ruixiang’，RX)的一芽二葉為試驗(yàn)材料，并以中小開(kāi)面葉為標(biāo)準(zhǔn)采摘，于2021年4月在武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃取樣，每個(gè)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，液氮快速固樣后，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹(shù)SBP基因家族成員的鑒定及理化分析在Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/ search# tabview=tab1)下載SBP基因家族的蛋白特征結(jié)構(gòu)域SBP(PF03110)的隱馬爾可夫模型，使用HMMER軟件(https://plants.ensembl.org/hmmer/index.html)進(jìn)行鑒定。利用Blast-P(E≤1×10-5)分別在‘鐵觀音’、‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’染色體級(jí)別基因組范圍內(nèi)進(jìn)行比對(duì)搜索。使用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)一步鑒定SBP基因是否具有完整的SBP保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)在線網(wǎng)站ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析茶樹(shù)SBP蛋白的氨基酸組成、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)，在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析利用在線平臺(tái)WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/)對(duì)CsTGY_SBPs的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。從在線網(wǎng)站Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取擬南芥、水稻和葡萄SBP蛋白序列，利用其保守序列在MEGA 7.0軟件上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰接法，Boostrap設(shè)置為1000，相同方法構(gòu)建‘鐵觀音’、‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’的SBP基因家族的進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 茶樹(shù)SBP_box基因家族的共線性分析從Ensembl Plants網(wǎng)站(http://plants.ens embl.org/index.html)獲取水稻、擬南芥和葡萄的基因序列和染色體文件，利用‘鐵觀音’與‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’的基因序列和染色體文件，在TBtools軟件上分析鐵觀音與水稻、擬南芥、葡萄、‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’的SBP基因家族的共線性。

1.2.4 啟動(dòng)子順式作用元件和miR156靶基因預(yù)測(cè)在TBtools軟件上提取CsTGY_SBPs轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上有2 000 bp的基因序列，利用Plant CARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html)進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析。使用psRNATarget網(wǎng)站(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)對(duì)miR156的潛在靶位點(diǎn)CsTGY_SBP進(jìn)行分析，最大期望值設(shè)為3，其他為默認(rèn)值。

1.2.5 組織特異性表達(dá)分析下載茶樹(shù)‘鐵觀音’不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括花、芽、嫩葉、成熟葉、莖和根，參照前人方法[22]計(jì)算FPKM值，在TBtools工具包上可視化CsTGY_SBP家族基因的表達(dá)水平。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析篩選出CsTGY_SBP基因家族在芽和嫩葉組織中高表達(dá)的家族成員，通過(guò)primer-blast在線程序設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)。用TransScript試劑盒合成雙鏈cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板，以CsGAPDH(登錄號(hào)GE651107)作為內(nèi)參基因，使用Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和程序參照前人方法[23]。用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計(jì)基因的表達(dá)水平。通過(guò)SPSS 24.0軟件的單因素LSD法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)SBP_box基因家族的鑒定

經(jīng)過(guò)隱馬爾可夫模型搜索，在‘鐵觀音’基因組、‘黃棪’基因組、‘舒茶早’基因組和‘龍井43’基因組分別獲得21個(gè)SBP基因(命名為CsTGY_SBP1—CsTGY_SBP21)、25個(gè)SBP基因(命名為HD_SBP1—HD_SBP25)、24個(gè)SBP基因(命名為SCZ_SBP1—SCZ_SBP24)和23個(gè)SBP基因(命名為L(zhǎng)J43_SBP1—LJ43_SBP23)(表2)。

表2 茶樹(shù)SBP基因家族氨基酸序列特征分析

續(xù)表2 Continued Table 2

茶樹(shù)SBP基因組序列的編碼序列從432 bp(CsTGY_SBP13、HD_SBP11)到3 279 bp(CsTGY_SBP4、HD_SBP10、LJ43_SBP10)不等，氨基酸數(shù)量位于143(CsSBP15)到1 092(CsSBP22)之間。分子量為16.31(CsTGY_SBP13、HD_SBP11)～120.35(HD_SBP10)kD，理論等電點(diǎn)范圍為5.56(CsTGY_SBP19)至9.60(SCZ_SBP14)，59%的SBP蛋白為堿性蛋白(等電點(diǎn)大于7)。所有茶樹(shù)SBP蛋白都是親水性的，親水性的平均值低于0。僅SCZ_SBP8和LJ43_SBP7定位于葉綠體中，其他茶樹(shù)SBP家族成員都定位于細(xì)胞核。

2.2 茶樹(shù)CsTGY_SBP家族的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)CsTGY_SBP蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，21個(gè)CsTGY_SBP的SBP結(jié)構(gòu)域是保守的(圖1，A)，所有SBP結(jié)構(gòu)域都包含Cys-Cys-Cys-His(CCCH)和Cys-Cys-His-Cys(CCHC)2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，以及1個(gè)位于碳末端的核定位信號(hào)(NLS)，且所有CsTGY_SBPs的核定位序列(NLS)都高度保守。

A.CsTGY_SBP保守結(jié)構(gòu)域；B.鐵觀音與葡萄、擬南芥和水稻的SBP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析：CsTGY. ‘鐵觀音’;Vv. 葡萄;At. 擬南芥;Os. 水稻；C.‘鐵觀音’與‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’的SBP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析：CsTGY. ‘鐵觀音’;HD. ‘黃棪’;SCZ. ‘舒茶早’;LJ43. ‘龍井43’圖1 CsTGY_SBP蛋白的SBP結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹(shù)分析A.The sequence logos of the conserved CsTGY_SBP domains； B. Phylogenetic analysis of SBP genes of CsTGY_SBP and VvSBP, AtSPL and OsSPL. CsTGY. Camellia sinensis ‘Tieguanyin’; Vv. Vitis vinifera; At. Arabidopsis thaliana; Os. Oryza sativa； C. Phylogenetic analysis of SBP genes of CsTGY_SBP and HD_SBP, SCZ_SBP and LJ43_SBP. CsTGY. Camellia sinensis ‘Tieguanyin’; HD. Camellia sinensis ‘Huangdan’; SCZ. Camellia sinensis ‘Shuchazao’; LJ43. Camellia sinensis ‘Longjing43’Fig.1 The SBP domain and phylogenetic analysis of CsTGY_SBP proteins

為了研究植物中SBP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用來(lái)自茶樹(shù)、擬南芥、水稻和葡萄的74個(gè)保守的SBP結(jié)構(gòu)域序列來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明(圖1)，上述4個(gè)物種的SBP基因可分為8個(gè)亞家族(Ⅰ—Ⅷ)，每組至少包含擬南芥的1個(gè)成員和茶樹(shù)的1個(gè)成員。除亞家族Ⅲ和亞家族Ⅵ外，其余亞家族均含有4種SBP基因，亞家族Ⅲ和亞家族Ⅵ均缺少水稻的SPL基因。此外，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的CsTGY_SBP基因與葡萄和擬南芥的基因親緣關(guān)系更近。來(lái)自4個(gè)不同茶樹(shù)品種的93個(gè)SBP基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)仍然分為8個(gè)亞家族(Ⅰ—Ⅷ)(圖1，C)，發(fā)現(xiàn)在‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’基因組中均能檢測(cè)到CsTGY_SBP的同源基因，且CsTGY_SBPs和HD_SBPs高度同源，意味著CsTGY_SBP基因和HD_SBP基因具有很強(qiáng)的進(jìn)化關(guān)系。

2.3 茶樹(shù)SBP家族的共線性分析

為了進(jìn)一步分析CsTGY_SBP基因的進(jìn)化過(guò)程，對(duì)茶樹(shù)品種‘鐵觀音’與1種單子葉植物水稻、2種雙子葉植物(擬南芥和葡萄)及其他3個(gè)茶樹(shù)品種(‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’)中SBP基因進(jìn)行了共線性分析(圖2，A)。結(jié)果顯示，‘鐵觀音’與水稻、擬南芥、葡萄、‘黃棪’、‘舒茶早’和‘龍井43’有共線性關(guān)系的基因分別為3、12、15、23、21和22個(gè)，說(shuō)明茶樹(shù)和擬南芥、葡萄的共線性關(guān)系與單子葉植物相比更強(qiáng)，同物種內(nèi)發(fā)現(xiàn)‘鐵觀音’和‘黃棪’的共線性關(guān)系更顯著。此外發(fā)現(xiàn)SBP基因在4個(gè)茶樹(shù)基因組中主要定位在5號(hào)、10號(hào)和6號(hào)染色體(圖2，B)，且除HD_SBP基因在9號(hào)染色體無(wú)分布，其他3個(gè)基因組中的SBP基因均有分布，尤其6個(gè)SCZ_SBP基因被掛載到9號(hào)染色體。

圖2 CsTGY_SBP基因家族的共線性分析和染色體分布數(shù)目Fig.2 Synteny analysis and chromosome distribution number of CsTGY_SBP gene family

2.4 茶樹(shù)CsTGY_SBP家族的啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)分析

順式元件在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要作用，為了解CsTGY_SBP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，預(yù)測(cè)了CsTGY_SBP基因的2 kb上游啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。除核心順式元件(TATA-box和CAAT-box)外，共預(yù)測(cè)出4種類(lèi)型的順式作用元件：光響應(yīng)元件、植物生長(zhǎng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)(圖3)。其中光響應(yīng)元件包括Box4、G-box和GT1-motif等，尤其是Box4分布在90%的CsTGY_SBP基因中；CsTGY_SBP基因中發(fā)現(xiàn)了CAT_box、O2_site和GCN4_motif等與植物發(fā)育相關(guān)的順式元件；非生物脅迫相關(guān)順式元件包括厭氧誘導(dǎo)的必需基因(ARE)和低溫響應(yīng)元件(LTR)等；與激素響應(yīng)相關(guān)的CGTCA_motif廣泛分布于80%的CsTGY_SBP基因中。

A.光響應(yīng)元件；B.植物生長(zhǎng)；C.脅迫響應(yīng)；D.激素響應(yīng)圖3 CsTGY_SBP基因家族啟動(dòng)子區(qū)的主要順式元件A. Light responsive; B. Plant growth; C. Stress responsive; D. Phytohormone responsiveFig.3 Main cis-elements in CsTGY_SBP gene family promoters

2.5 茶樹(shù)CsTGY_SBP家族的miR156靶位點(diǎn)

為了確定茶樹(shù)中是否也存在miR156介導(dǎo)的CsTGY_SBP基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，使用psRNATarget服務(wù)器鑒定CsmiR156的靶位點(diǎn)。結(jié)果顯示，13個(gè)CsTGY_SBPs是miR156的潛在靶位點(diǎn)。miR156的靶位點(diǎn)位于9個(gè)CsTGY_SBP1、CsTGY_SBP2、CsTGY_SBP9、CsTGY_SBP10等的編碼區(qū)(圖4)，這些基因?qū)儆诓煌蘑瘛ⅱ?、Ⅲ和Ⅳ亞家族。其?個(gè)CsTGY_SBPs(CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP6、CsTGY_SBP12和CsTGY_SBP13)屬于同一Ⅵ亞族，其目標(biāo)位點(diǎn)位于3′-UTR區(qū)域。說(shuō)明mir156介導(dǎo)SBP-box基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在茶樹(shù)中是保守的。

圖4 CsTGY_SBP基因家族在CDS區(qū)的mir156靶位點(diǎn)分析Fig.4 Analysis of miR156 target sites of CsTGY_SBP gene family in CDS zone

2.6 茶樹(shù)CsTGY_SBP家族在不同組織的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究CsTGY_SBP家族的潛在功能，對(duì)CsTGY_SBP家族的基因在6個(gè)組織(芽、嫩葉、成熟葉、花、莖和根)中的表達(dá)模式進(jìn)行分析(圖5)。結(jié)果顯示21個(gè)CsTGY_SBP基因在6個(gè)組織中表達(dá)，且具有很強(qiáng)的組織特異性表達(dá)模式。CsTGY_SBP基因在芽、嫩葉和莖中高表達(dá)的數(shù)量高于成熟葉、花和根，如CsTGY_SBP2、CsTGY_SBP9、CsTGY_SBP16和CsTGY_SBP17等，表明這些基因可能在芽、嫩葉和莖中具有重要的功能；CsTGY_SBP19的轉(zhuǎn)錄本主要在根中積累；CsTGY_SBP6在花中的表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因可能在花的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

圖5 CsTGY_SBP基因家族在不同組織的表達(dá)譜Fig.5 Expression profiles of CsTGY_SBP gene family in different tissues

2.7 茶樹(shù)CsTGY_SBP家族基因在不同茶樹(shù)品種中的表達(dá)分析

為探討茶樹(shù)F1代品種與親本之間SBP基因表達(dá)模式的差異，對(duì)‘鐵觀音’和‘黃棪’及其F1雜交品種的表達(dá)量進(jìn)行分析，并與‘鐵觀音’自然雜交品種‘紫牡丹’和‘黃棪’自然雜交品種‘瑞香’的表達(dá)量進(jìn)行比較(圖6)。結(jié)果顯示部分CsTGY_SBPs基因在F1‘金觀音’中的表達(dá)量介于母本‘鐵觀音’和父本‘黃棪’之間，呈中親表達(dá)的模式，如CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP9和CsTGY_SBP14的表達(dá)量高于母本‘鐵觀音’，低于父本‘黃棪’，且表達(dá)量偏向母本；多數(shù)CsTGY_SBPs基因在F1‘黃觀音’中的表達(dá)量與其親本相比呈下調(diào)趨勢(shì)，呈低于雙親表達(dá)模式；在F1‘金牡丹’中除CsTGY_SBP5和CsTGY_SBP8顯著高于親本，呈超高親表達(dá)的模式，其他整體上呈低于雙親表達(dá)的模式；CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP7、CsTGY_SBP12、CsTGY_SBP16和CsTGY_SBP18在F1‘紫玫瑰’中的表達(dá)量顯著高于親本，呈超高親表達(dá)的模式，具有雜種優(yōu)勢(shì)；CsTGY_SBPs基因在‘紫牡丹’中整體表達(dá)趨于親本‘鐵觀音’，在‘瑞香’中整體呈現(xiàn)低于親本‘黃棪’的表達(dá)模式。

不同小寫(xiě)字母表示同一基因不同品種間表達(dá)差異顯著(P<0.05)圖6 CsTGY_SBPs在不同茶樹(shù)品種中的表達(dá)模式Different normal letters indicate the expression differences between different tea plants under the same gene at 0.05 levelFig.6 Expression patterns of CsTGY_SBPs in different tea plants cultivars

3 討 論

3.1 茶樹(shù)SBP家族基因進(jìn)化特征和功能分析

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，SBP基因是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中含有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域[2]。通過(guò)植物全基因組分析，已鑒定出多種植物的SBP基因，包括楊樹(shù)的28個(gè)[6]、擬南芥的17個(gè)和水稻的19個(gè)[4]等。本研究在茶樹(shù)品種‘鐵觀音’‘黃棪’‘舒茶早’和‘龍井43’基因組中分別鑒定出21、25、24和23個(gè)SBP基因，SBP基因數(shù)量的差異可能是由于全基因組重復(fù)(WGD)事件[2]。茶樹(shù)SBP家族基因數(shù)量多于模式植物擬南芥和水稻[4]。對(duì)鐵觀音、擬南芥、水稻和葡萄構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)所有的SBP基因分為8個(gè)亞家族(Ⅰ-Ⅷ)，與番茄[5]的分類(lèi)一致。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和共線性分析發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)SBP基因與葡萄和擬南芥的聚類(lèi)比與水稻的聚類(lèi)更緊密，這與茶樹(shù)、葡萄和擬南芥都是雙子葉植物這一事實(shí)相一致[24]。鑒于茶樹(shù)SBP基因和擬南芥的同源性，推測(cè)同一亞族的SBP同源基因可能發(fā)揮相似的功能，AtSPL9和AtSPL15調(diào)控芽葉成熟[8]，其同源基因CsTGY_SBP18可能具有相同的功能。ATSPL3、ATSPL4和ATSPL5調(diào)控?cái)M南芥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變和開(kāi)花[7]，推測(cè)其同源基因CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP6、CsTGY_SBP12和CsTGY_SBP13可能參與茶樹(shù)花開(kāi)花的過(guò)程。

3.2 茶樹(shù)SBP家族基因miR156靶位點(diǎn)的保守性分析

MicroRNAs在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，SBP基因的表達(dá)水平可由miR156或miR157調(diào)控，在水稻中有11個(gè)OsSPL基因被miR156預(yù)測(cè)或驗(yàn)證為靶向基因[25]。過(guò)表達(dá)miR156在擬南芥中下調(diào)多個(gè)SPLs的表達(dá)，但沒(méi)有識(shí)別靶位點(diǎn)的SPLs不受影響[26]，突變AtSPL3的miR156/157識(shí)別位點(diǎn)后，AtSPL3的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[27]。Salinas等[5]研究表明miR156和miR157在番茄的幼苗、葉片和花藥中的表達(dá)量最高，而大多數(shù)miR156靶向的SlySBP基因在幼花序和果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中都有表達(dá)，表明SlySBP基因受miR156/157調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA靶基因預(yù)測(cè)有13個(gè)CsTGY_SBP基因受miR156調(diào)控，其中有9個(gè)靶向的CsTGY_SBP基因在編碼區(qū)，且CsTGY_SBP2、CsTGY_SBP9和CsTGY_SBP16等miR156靶向的基因在芽、嫩葉和莖中高表達(dá)，推測(cè)miR156-SBPs模式可能共同作用于茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育。但關(guān)于miR156-SBPs處于怎樣的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步研究。

3.3 CsTGY_SBP家族基因在茶樹(shù)中的雜種優(yōu)勢(shì)與遺傳分析

目前茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)在分子機(jī)制上的研究與水稻[28]、玉米[29]和煙草[30]等模式植物相比較少，其中重要原因是茶樹(shù)親本基因組研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究基于親本茶樹(shù)‘鐵觀音’和‘黃棪’基因組，對(duì)SBP轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)中的作用進(jìn)行研究。研究表明CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP9和CsTGY_SBP14在F1‘金觀音’中的表達(dá)量介于母本‘鐵觀音’和父本‘黃棪’之間，在F1‘黃觀音’中的表達(dá)量下調(diào)，且表達(dá)量偏向母本‘鐵觀音’，與郭吉春等[16]研究并不完全一致，郭吉春等認(rèn)為‘金觀音’和‘黃棪’屬于早生種，‘黃觀音’的芽葉和嫩莖等遺傳性狀趨向父本‘黃棪’，而本研究的多數(shù)CsTGY_SBP基因在‘金觀音’和‘黃觀音’中的表達(dá)量不完全趨向父本‘黃棪’，可能是親本和雜種基因的差異表達(dá)還受順、反式作用元件及環(huán)境因子等的影響[19,31]。本研究發(fā)現(xiàn)CsTGY_SBPs基因在‘瑞香’中整體呈現(xiàn)低于親本‘黃棪’的表達(dá)模式，與前人對(duì)‘瑞香’的生長(zhǎng)勢(shì)研究結(jié)果一致[32]，侯炳豪等[20]研究顯示在‘瑞香’中CsGRF相對(duì)表達(dá)量顯著低于‘黃棪’，也證實(shí)‘瑞香’的生長(zhǎng)勢(shì)低于‘黃棪’這一觀點(diǎn)，且前人研究發(fā)現(xiàn)‘瑞香’與‘黃棪’親緣關(guān)系最近[33]。此外，非加性基因在植物雜種優(yōu)勢(shì)中發(fā)揮重要作用，在水稻中有34%的基因表現(xiàn)出非加性表達(dá)模式[28]，超顯性對(duì)于玉米的穗重和株高及穗位高相關(guān)性狀的調(diào)控發(fā)揮著重要作用[29]，在煙草中參與煙堿合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因呈現(xiàn)超顯性模式，可能是煙堿雜種優(yōu)勢(shì)的主要原因[30]，本研究表明‘鐵觀音’與‘黃棪’雜交產(chǎn)生的F1‘紫玫瑰’在CsTGY_SBP5、CsTGY_SBP7、CsTGY_SBP12、CsTGY_SBP16和CsTGY_SBP18呈超高親表達(dá)的模式，F(xiàn)1‘金牡丹’中在CsTGY_SBP5和CsTGY_SBP8中的表達(dá)顯著高于親本，存在雜種優(yōu)勢(shì)，符合非加性表達(dá)在雜種優(yōu)勢(shì)形成中起主要作用[18]和超顯性假說(shuō)[31]的觀點(diǎn)。且在F1‘金牡丹’和F1‘紫玫瑰’中均顯著高于親本的CsTGY_SBP5可能是茶樹(shù)雜種優(yōu)勢(shì)的重要調(diào)控因子。本研究將有助于闡明SBP家族基因在茶樹(shù)雜種和親本上的遺傳規(guī)律，但仍需要對(duì)這些候選基因的生物學(xué)功能及miR156-SBPs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步研究。