不同土地利用方式對寧夏鹽漬化土壤細菌群落的影響

李 明，馬 飛，陳曉娟，王 銳2，*

(1 寧夏大學 食品與葡萄酒學院，銀川 750021；2 寧夏大學 葡萄與葡萄酒研究院，銀川 750021；3 寧夏大學 生態(tài)環(huán)境學院，銀川 750021；4寧夏大學 農學院，銀川 750021)

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，土壤微生物通過分解動植物殘體參與土壤微生態(tài)的營養(yǎng)物質循環(huán)和能量傳遞，是衡量土壤肥力的重要指標之一[1]。土壤細菌作為土壤微生物中最大的類群，約占微生物生物量的70%～90%，可調節(jié)土壤結構與肥力的穩(wěn)定性、養(yǎng)分利用效率和植物生長發(fā)育等[2]。同時，土壤細菌比較敏感，其群落結構組成及多樣性易受土壤類型、土壤理化性質、施肥方式、耕作方式和植被類型等多方面因素的影響[3]。已有研究結果證實土地利用方式的改變會明顯影響土壤微生物活性、代謝等，比如少免耕[4]、輕耕[5]、旋耕[6]、翻耕和深松耕[7]等耕作措施能不同程度改變土壤微生物的生物學特性。土地利用方式的改變會影響土壤養(yǎng)分的循環(huán)與供應，直接造成土壤質地和地下微生物群落結構的變化[8]，進而引起土壤微生物多樣性的改變。

為了消減作物連坐障礙，前人從改變耕作制度入手，做了大量研究，并一致認為：輪、間和套作系統(tǒng)可通過維持作物根際土壤微生物群落結構的多樣性，抑制連作條件下的有害微生物增殖，進而增加有益微生物的數量和活性，提高作物產量[9]。比如西瓜和水稻輪作、脆甜豆與胡麻和小麥輪作[10]，可通過改善土壤微生態(tài)環(huán)境，減少土壤蟲害、降低作物病害；不同作物與黃瓜套作，可明顯提高土壤微生物群落的均勻度和多樣性指數，進而改善根際土壤微生態(tài)環(huán)境和系統(tǒng)[11]。因此，輪作、間作和套作等多樣性栽培模式的研究、推廣和應用，對緩解和消減作物連作障礙，改良鹽漬化土壤都具有重要的理論和現實意義。

土壤鹽漬化是一個世界性問題，也是土壤退化和肥力下降的重要表現，不僅造成資源的浪費，而且給生態(tài)環(huán)境和社會經濟的發(fā)展帶來嚴重的危害，成為制約區(qū)域生態(tài)環(huán)境與農業(yè)高效利用的重要因素[12]。寧夏地處內陸，是中國西北最主要的農業(yè)區(qū)與生態(tài)脆弱區(qū)，由于氣候干旱，蒸發(fā)強烈，地勢低洼，成土母質含鹽量及地下水位較高等原因以及長期不合理的耕灌制度，使得區(qū)域鹽堿地面積和鹽漬化程度逐年增加，土壤鹽漬化已成為制約寧夏地區(qū)土地資源利用的主要障礙因子[13]。開展輪作、連作及其相互結合等利用方式對鹽漬化土壤微生物群落及土壤理化性質影響的研究是有效開展區(qū)域鹽漬化土壤資源改良利用的基礎。不同土地利用方式可以顯著影響土壤細菌的群落結構及土壤理化性質，能夠敏感地反映土壤微生態(tài)特征的變化，也可以作為寧夏鹽漬化土壤改良和土地高效利用的指標之一。

本研究選取寧夏平羅鹽漬化土壤，基于高通量測序結合常規(guī)土壤理化性質測定方法，開展不同土地利用方式對土壤細菌群落和土壤理化性質影響的分析，旨在揭示不同土地利用方式下，土壤微生物群落變化規(guī)律及其主要的影響因素，擬為該地區(qū)鹽漬化土壤利用方式的優(yōu)化和利用潛力的提高提供理論參考，促進鹽漬化后備耕地資源的合理開發(fā)與高效利用。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

寧夏銀北地區(qū)分布有大量鹽漬化土壤，是黃河中上游灌溉地區(qū)，該區(qū)域地勢平坦，屬干旱的暖溫帶季風氣候，年均降水量為150～210 mm，年均溫9.5 ℃，年蒸發(fā)量為1 875 mm，地下水埋深1.0～1.2 m，地下水主要含氯化物、硫酸鹽。本研究選取寧夏銀北平羅西大灘水稻和玉米種植區(qū)為試驗區(qū)，采樣信息見表1。土壤類型以鹽土、堿土、灌淤土等為主，土壤透氣和通水性差。原始荒地土壤理化性質為：pH 9.31、電導率10 970.00 μs/cm、有機碳6.83 g/kg、全氮0.73 g/kg、堿解氮21.89 g/kg、全磷587.53 μg/g、速效磷10.43 mg/kg、速效鉀281.31 mg/kg。

1.2 土壤樣品采集

2020年7月26日在銀北西大灘試驗樣地采集土壤樣品。本研究共設5個處理：(1)將原始鹽堿荒地作為對照(CK)；(2)水旱輪作12年玉米地(每2年倒茬1次，PD12Y)；(3)連續(xù)種植12年水稻地(P12Y)；(4)水旱輪作12年水稻地(每2年倒茬1次，DP12Y)；(5)連續(xù)種植12年玉米地(D12Y)。每個處理3次重復。

根據地面作物的生長情況，選擇5個30 m × 30 m的小區(qū)。在每個小區(qū)內，按“S”型選擇6個采樣點，在每個采樣點用直徑30 mm的不銹鋼土鉆鉆取5個深度為0～20 cm的土柱，去除小石塊和粗根，混合作為一個土壤樣品，總共采集15個土壤樣品，立即用冰盒將土壤樣品帶回實驗室。采回的土壤樣品均分為兩部分：一部分于-20 ℃保存，用于土壤微生物DNA的提取；另一部分風干后用于測定土壤理化性質。

1.3 土壤理化性質的測定

將風干后的土壤磨細，分別過2 mm和0.25 mm篩，測定0～20 cm土層土壤有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮和全磷含量，具體測定方法參照鮑士旦《土壤農化分析》(第三版)[14]。有機質采用重鉻酸鉀容量-外加熱法測定；堿解氮采用堿解擴散法測定；有效磷采用鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用火焰光度法測定；全氮采用凱氏定氮法測定；全磷采用鉬銻抗比色法測定。土壤機械組成采用比重計法測定：根據國際制土壤粒級劃分標準將土壤顆粒級別劃分為粘粒(<0.002 mm)、粉砂(0.002～0.02 mm)、砂粒(0.02～2 mm)。

1.4 土壤DNA提取

不同處理土壤樣本中基因組DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Hilden, German)，提取方法按照試劑盒說明書進行，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA質量合格后由諾禾致源Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。

1.5 nova-seq PE250

以1%的凝膠濃度、170 V電壓和30 min電泳時間為基礎條件，進行如下的25 μL反應體系和擴增程序。其中對細菌16S V3-V4區(qū)域擴增的引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

按指定測序區(qū)域(細菌16S V3-V4)，合成帶有barcode的特異引物，或帶有錯位堿基的引物。

全部樣本按照正常試驗條件進行，每個樣本3次重復，將同一樣本PCR產物混合，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen)切膠回收PCR產物，Tris HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。通過Illumina HiSeq 2500平臺進行測序(北京諾禾致源公司http://www.novogene.com/index.php, Beijing, China)。

表1 采樣地信息

1.6 數據統(tǒng)計與分析

對Illumina HiSeq測序結果序列進行質控、過濾和拼接，得到優(yōu)化序列。利用USEARCH軟件將優(yōu)化序列在97%相似度下進行聚類，得到各樣品OUT代表序列。參照文獻[15]的方法，計算覆蓋度(Coverage，反映測序結果是否代表樣本的真實情況)。利用mothur(Version1.33.3)進行alpha多樣性分析：Shannon、Simpson等估算樣品中微生物物種多樣性、Chao-1指數估算樣品中微生物物種總數、ACE估算樣品中微生物物種總數。

Venn圖繪制，Beta多樣性分析(PCA)，主成分分析(PCA)，最大程度反映樣本間差異的一種應用方差分解。運用USEARCH和mothur軟件將OTU代表序列與Silva128數據庫進行物種分類學分析。采用R語言的Vegan軟件對土壤優(yōu)勢細菌門群落和土壤環(huán)境因子進行冗余度分析。

使用Excel 2017對土壤不同組樣品的氮磷鉀、有機質等土壤理化性質數據進行平均值、標準差計算。對土壤不同組樣品的氮磷鉀、有機質的數據進行平均值、標準差進行計算。文中組間差異均使用SPSS 20.0軟件LSD法計算(P<0.05表明組別之間無統(tǒng)計學差異；P>0.05則表明組別之間無統(tǒng)計學差異)，數據表示方式均為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 不同土地利用方式下土壤基本理化性質

與對照相比，全氮、堿解氮、全磷在PD12Y和D12Y處理中最高，其中堿解氮D12Y處理中顯著高于其他處理組(P<0.05)，全磷在PD12Y處理組最高，達到顯著水平(表2)。速效磷、有機質在PD12Y處理組顯著高于其他處理組(P<0.05)；速效磷在PD12Y處理組中顯著高于其他處理組(P<0.05)。同時，土壤pH、電導率值、含水量在PD12Y處理組最低，其中，pH值差異達到顯著水平(P<0.05)。砂粒所占比例在P12Y和D12Y中增加，分別增加了8.18%和9.94%；粉沙所占比例在PD12Y、P12Y、DP12Y和D12Y中都增加，其中在D12Y中增加顯著，為33.54%；粘粒所占比例在PD12Y、P12Y、DP12Y和D12Y中都降低，其中D12Y下降最為顯著，為52.27%。

表2 不同土地利用方式土壤基本理化性質

2.2 不同土地利用方式下土壤細菌操作分類單元(OTU)聚類分析

通過不同土地利用方式下鹽漬化土壤細菌OTU的聚類可知(圖1)，土壤樣品中共檢測到細菌24 400種，5種處理方式的共有種類為1 422種，約占到總數的5.80%。DP12Y擁有的特有性細菌最多，為883種；其次為連續(xù)種稻12年的土壤，有697種；特有性細菌最少的處理為連續(xù)種植12年玉米地的旱地土壤。同樣，DP12Y所測得細菌種類也最多，并高于其他4個處理，為5 570種。其他4個處理細菌豐富度由高到低為P12Y(5 475種)、D12Y(5 180種)、PD12Y(4 877種)和CK(3 298種)。表明種植水稻相對于原始荒地和種植玉米對土壤細菌群落結構影響較大。

圖1 不同土地利用方式鹽漬化土壤細菌OUT聚類圖Fig.1 OUT cluster diagram of bacteria in salinized soil under different land use patterns

2.3 不同土地利用方式下門水平的豐度變化

結果表明，在5種不同土地利用方式下土壤微生物中相對豐度排名前十的優(yōu)勢細菌分別為變形菌門(Proteobacteria)，其相對豐度占總細菌群落的21.25%～46.87%；其次為芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其相對豐度占7.10%～25.36%；放線菌門(Actinobacteria)為第三大優(yōu)勢類群，占5.30%～18.87%；其余依次為擬桿菌門(Bacteroidetes)>酸桿菌門(Acidobacteria)>綠彎菌門(Chloroflexi)>未鑒別古菌(Unidentified Archaea)>厚壁菌門(Firmicutes)>疣微菌門(Verrucomicrobia)>硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(圖2)。

圖2 不同土地利用方式鹽漬化土壤細菌各門類相對豐度Fig.2 Composition and relative abundance of the bacterial community at the phylum level in the salinized soils with different cultivation methods

2.4 不同土地利用方式下屬水平的豐度變化

由表3可知，unidentifiedActinomarinales、Salinimicrobium和Candidatusentotheonella等的相對豐度在幾種不同耕作處理的土壤樣品中顯著地下降(P<0.05)。其中，耕作使得unidentifiedActinomarinales相對豐度顯著下降，相對于CK處理，PD12Y處理下降最多為98.28%；Candidatusentotheonella相對豐度在DP12Y處理中下降最多，為89.32%。硫桿菌屬(Thiobacillus)、硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)等的相對豐度在幾種耕作處理中相對于CK顯著上升(P<0.05)。

表3 不同土地利用方式土壤細菌群落在屬水平上的豐度變化

2.5 Alpha多樣性指數及其與土壤理化性質的相關性分析

對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha diversity分析指數進行統(tǒng)計分析(表4)。如表所示，P12Y樣品的Shannon、Chao-1和ACE指數都高于其他處理組，但沒有達到顯著水平。observed species、Shannon、Simpson、Chao-1和ACE指數在CK樣品中顯著低于其他處理組(P<0.05)。

表4 不同土地利用方式土壤樣品alpha多樣性分析

Pearson相關性分析(表5)：Shannon、Simpson、Chao-1、ACE指數均與電導率值呈顯著負相關(P<0.05)，Shannon指數與土壤含水量呈顯著正相關(P<0.05)。

表5 不同土地利用方式土壤樣品alpha多樣性與土壤理化性質的Pearson相關性分析

2.6 PCA分析和UPGMA聚類分析

第一主成分對樣本差異的貢獻率為16.15%，第二主成分為12.95%。由圖3可見，CK與其他耕作方式的土壤相距較遠，表明其細菌群落結構與其他處理組的土壤差異較大。D12Y與PD12Y距離較近，因此D12Y和PD12Y處理組的細菌群落結構較為相似。DP12Y與P12Y相距較近，表明厭氧環(huán)境中的細菌群落結構較相似。

圖3 不同土地利用方式下鹽漬化土壤細菌群落結構的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterial community composition of salinized soils with different cultivation methods

相對豐度排名前十的物種組成分布的樣本聚類樹如圖4可見：CK處理與其他的4個處理組差異較為顯著，單獨聚為一類。連續(xù)種植12年玉米地(D12Y)和水旱輪作12年(PD12Y)的土壤中優(yōu)勢細菌群落聚在一類PD12Y和D12Y。P12Y和DP12Y土壤中優(yōu)勢細菌群落聚在一類。UPGMA聚類分析和主成分分析呈現的結果基本一致。

右邊為樣品的群落結構柱狀圖圖4 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹The histogram of community structure is on the rightFig.4 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac distance

2.7 不同土地利用方式下細菌群落結構與土壤理化因子之間的相關性

通過R軟件對環(huán)境因子和土壤細菌群落進行dbRDA分析。由圖5可知，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了細菌群落變化的46.92%和30.97%，經過蒙特卡羅檢驗，土壤含水量(R2= 0.56，P= 0.01)和總氮(R2=0.51，P=0.01)是土壤微生物群落的主要影響因子。

圖5 不同土地利用方式鹽漬化土壤性質與細菌群落的distance-based RDA分析Fig.5 Results from distance-based redundancy analysis (dbRDA) to explore the relationship between soil bacterial community and soil physicochemical characteristics

Spearman相關性分析表明(圖6)，排名前十的優(yōu)勢細菌門中，Gemmatimonadetes與總氮(P=0.01)顯著正相關，與土壤含水量(P=0.02)顯著負相關；Actinobacteria與總氮(P=0.00)、有機質(P=0.03)顯著正相關，與含水量(P=0.00)顯著負相關；Bacteroidetes和總氮(P=0.04)、堿解氮(P=0.03)顯著負相關；Acidobacteria與速效鉀(P=0.01)、電導率值(P=0.01)顯著負相關；unidentified archaea與總氮(P=0.02)、堿解氮(P=0.00)和總磷(PS=0.04)顯著負相關，與pH(P=0.03)、電導率(P=0.01)顯著正相關；Firmicutes與總氮(P=0.03)、有機質(P=0.01)顯著負相關，與土壤含水量(P=0.00)顯著正相關；Verrucomicrobia與速效鉀(P=0.02)顯著負相關；Nitrospirae與電導率(P=0.00)顯著負相關。其中，對優(yōu)勢菌門影響最大的土壤理化因子是總氮，其次是土壤含水量和電導率。

圖6 不同土地利用方式鹽漬化土壤優(yōu)勢菌群與土壤理化性質Spearman相關性分析Fig.6 Spearman correlation coefficient between soil dominant bacterial communities and soil physicochemical characteristics

3 討 論

土壤細菌群落結構組成受種植作物和土壤環(huán)境的影響，不同農田生態(tài)系統(tǒng)中細菌群落的組成和豐度存在一定差異。本研究結果表明，變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等為水稻土壤中優(yōu)勢類群，這與陳力力等[6]、袁紅朝等[16]對湖南地區(qū)酸性稻田土壤細菌群落的研究結果相似。

變形菌門被認為是世界上微生物最豐富的菌門，是多數土壤中的優(yōu)勢門類，與碳利用有關[17]，在本研究中耕作使得鹽漬化土壤中變形菌門相對豐度顯著上升，改變了研究區(qū)域土壤微生物群落的基本組成。放線菌門相對豐度在對照組中占比較大(9.32%)，這符合以往對鹽堿地微生物的研究[18]。其中，土壤放線菌對一些有害真菌表現出明顯的抑制效果，具有廣譜抗生性及促進植株種子萌發(fā)、胚根生長的作用[19]。芽單胞菌門和放線菌門在本研究的4種耕作方式土壤中相對豐度均顯著低于對照，芽單胞菌門和放線菌門在干旱土壤中的數量較多[20]，是土壤屬性變遷的生物學指標之一。其中芽單胞菌門與土壤含水量顯著負相關，芽單胞菌門被認為既可在有氧條件又可在無氧條件下生長，具備廣泛的適應性。放線菌是好氧菌群，能夠降解復雜的木質素和纖維素[21]，水稻連續(xù)種植12年(P12Y)和水旱輪作12年的水稻土壤(DP12Y)中放線菌門的相對豐度最低，而這兩個處理中的土壤含水量最高，可見厭氧環(huán)境抑制了放線菌門的生長。Spearman相關性分析顯示放線菌門相對豐度與土壤含水量呈顯著負相關，與土壤總氮和有機質顯著正相關。擬桿菌門與總氮和堿解氮顯著負相關，因此土壤總氮和堿解氮對擬桿菌門菌群豐度起抑制作用，這與以往的研究一致[22]。酸桿菌門在酸性環(huán)境及寡營養(yǎng)條件適合生存[23]，可作為土壤貧瘠的評價指標，在本研究中酸桿菌門與代表土壤鹽分的電導率值顯著負相關。研究表明，酸桿菌門參與單碳化合物的代謝和鐵循環(huán)，在PD12Y和D12Y樣品中酸桿菌門相對豐度顯著升高，人為干擾引起酸桿菌門細菌的增加將有利于土壤中有機質的降解和鐵的循環(huán)[24]。

水旱輪作模式下，土壤環(huán)境為厭氧及好氧條件交替，土壤中的碳/氮循環(huán)加速，是水旱輪作模式土壤中的微生物多樣性高于旱地輪作模式的主要原因[25]，這與本研究結果不一致，Shannon指數在連續(xù)種稻12年(P12Y)的土壤中最高，這可能是由于在水稻連作土壤中，水稻秸稈和殘茬還田為土壤提供了更加豐富的有機質，有利于多種微生物的活動和繁殖，所以其土壤中微生物物種豐富，多樣性高。4種土地利用方式下，土壤微生物群落功能多樣性都比鹽漬化荒地土壤顯著升高，但4種耕作模式下土壤微生物的物種多樣性指數、均勻度指數和優(yōu)勢度指數之間差異都不顯著，這可能是由于土地利用方式、作物根系的活動、土壤狀況、氣候條件以及田間管理等多種影響因子綜合作用的結果，任何單一因素的分析都很難做出較全面的解釋。

大量無機肥料特別是氮肥的投入，通常會導致旱地土壤細菌多樣性減少[26]。本研究結果顯示Shannon指數在PD12Y最低，但與其他處理差異不顯著。分析結果發(fā)現全氮和堿解氮均在種植玉米的旱地土壤中最高(PD12Y、D12Y)，這表明種植玉米的土壤中氮肥的投入最高，反而抑制了土壤細菌多樣性[22]。土壤電導率值可以間接地反映土壤含鹽量，在本研究中，土壤鹽分與多樣性指數呈顯著負相關，過高的土壤鹽分對根際微生物有一定的抑制作用[27]。

土壤機械組成及分布特征是重要的物理屬性，對土壤水熱條件、肥力狀況、養(yǎng)分循環(huán)等過程有重要影響[28]。砂粒含量在連續(xù)種稻(P12Y)和連續(xù)種植12年玉米地(D12Y)的土壤含量顯著增加，說明長期連續(xù)種植單一作物會導致土壤沙化加快，引起土壤質量下降，排水和通氣良好，但易干旱。本研究中，粉粒在水旱輪作的玉米地土壤(PD12Y)和連續(xù)旱作玉米地土壤(D12Y)增加，粉粒增加引起土壤表面緊實和結殼[29]。水旱輪作的玉米地土壤(PD12Y)和連續(xù)旱作玉米地土壤(D12Y)的粘粒含量相比于對照鹽漬化荒地土壤都顯著下降，因此鹽漬化土壤種植玉米降低了土壤的粘粒含量，由此可見旱作增加了對土壤結構的擾動，更利于土壤形成良好的結構，減少土壤干旱時的板結狀態(tài)，但是長期粘粒下降會導致土壤持水量下降。

土壤理化性狀差異能顯著影響微生物群落組成。本研究中，不同耕作方式下水稻和旱地土壤微生物群落結構與環(huán)境因子關系的dbRDA和相關性分析表明：土壤含水量、總氮、有機質、堿解氮、速效鉀、電導率、pH值是影響土壤微生物群落結構的環(huán)境因子，其中土壤含水量、總氮和電導率是影響細菌群落的重要因子。因此，土壤含水量、營養(yǎng)因子和鹽堿程度可能是限制寧夏銀北鹽漬化土壤微生物生長的因素，植物對土壤大部分的環(huán)境因子都有影響，對細菌群落結構的形成也具有重要作用，不同土地利用方式的細菌群落結構具有明顯差異，這值得我們進一步研究。

4 結 論

通過對水旱輪作不同土地利用方式下土壤理化因子和土壤微生物群落多樣性調查分析發(fā)現，研究區(qū)內土地利用方式深刻影響著土壤質量狀況。

本研究中變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等為優(yōu)勢細菌門。主成分分析和冗余度分析表明土壤理化性質和微生物群落能較好地響應鹽漬化土壤不同利用方式的變化，說明通過區(qū)域土地資源的合理利用、土地利用結構的優(yōu)化，可以改善鹽漬化土壤質量因子狀況，進而提高鹽漬化區(qū)域土壤生產力和生態(tài)功能。本研究區(qū)域屬于典型鹽漬化土壤，總體土壤養(yǎng)分狀況不佳，綜合分析結果表明耕作使得土壤質量有所提升，其中提升效果依次為：水旱輪作(玉米)>連續(xù)種玉米>水旱輪作(水稻)>連續(xù)種稻。