仙芎骨康顆粒對骨關(guān)節(jié)炎大鼠組織病理學(xué)及MMP-13、IL-1β影響的研究

倪宇峰 汪軒 尹華 章建華

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)室

仙芎骨康顆粒是治療骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的中藥新藥，其處方源自《太平圣惠方》的仙靈脾散，由淫羊藿、川芎、威靈仙、桂心、蒼耳子等中藥組成，具有補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛之功效，臨床常以該方為基礎(chǔ)隨證加減，治療骨關(guān)節(jié)疾病。浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用該方治療OA療效顯著。本研究建立半月板-前交叉韌帶聯(lián)合損傷的大鼠OA模型，通過軟骨組織病理學(xué)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13 （matrix metallopeptidase-13，MMP-13）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等指標(biāo)檢測，探討仙芎骨康顆粒對大鼠OA模型的作用及相關(guān)機(jī)制，為OA的新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性清潔級SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)內(nèi)[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號碼：SYXK （浙）2018-0012]，設(shè)有溫度、濕度、光照、壓力梯度等自動控制和顯示系統(tǒng)，溫度（22±1）℃，相對濕度（60±10）%，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h，光照12 h明暗交替。所有大鼠飼喂60Co輻照全價營養(yǎng)飼料，正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物及試劑 淫羊藿（柔毛淫羊藿）購于華東藥材飲片有限公司（批號：141117），威靈仙、川芎、肉桂、蒼耳子均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司（批號：141101、141001、141101、141101）， 均符合現(xiàn)行版《中國藥典》規(guī)定。仙芎骨康藥液由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)室制備，上述飲片各50 g，10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，濃縮成含生藥3 g·mL-1的藥液；塞來昔布膠囊購于輝瑞制藥有限公司（批號：R55865）；鹽酸氨基葡萄糖膠囊購于海南澳美華制藥有限公司（批號：1504174）；大鼠MMP-13、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于蘇州卡爾文生物科技有限公司（批號：20151201A、20150801A）。

1.3 主要儀器 Bio-Rad 680全自動酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司；IX 71倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Laborota 20 Compact旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購于德國Heidolph公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、模型建立及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組，模型組，仙芎骨康低、中、高劑量組，陽性對照組，每組8只，各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。除空白對照組外，其余各組大鼠均采用Hulth法建立半月板-前交叉韌帶損傷OA模型，具體方法：大鼠以3%巴比妥鈉3 mL·kg-1腹腔注射，麻醉后左側(cè)膝關(guān)節(jié)剃毛，聚維酮碘溶液消毒后，以膝關(guān)節(jié)髕骨為中心，沿髕骨內(nèi)側(cè)緣上下各2 mm依次切開皮膚與關(guān)節(jié)囊，顯露關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，并用尖頭刀刮損半月板，最后依次縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚，建立OA模型。術(shù)后每只大鼠左側(cè)大腿肌肉注射青霉素10 000 U·d-1，連續(xù)3 d。按照人與實(shí)驗(yàn)動物間體表面積折算等效劑量法（大鼠體質(zhì)量以200 g計(jì)、人以70 kg計(jì)），折算出大鼠仙芎骨康藥液的臨床等效劑量為22.50 g·kg-1，以此作為中劑量，設(shè)置低劑量為11.25 g·kg-1，高劑量為45.00 g·kg-1；陽性對照組大鼠所用鹽酸氨基葡萄糖和塞來昔布的臨床等效劑量分別為0.09 g·kg-1、0.75 g·kg-1。 造模與灌胃給藥同時進(jìn)行，模型組和空白對照組灌胃給予等量0.9%氯化鈉注射液，各組大鼠給藥均為1次/d，連續(xù)8周。

1.4.2 指標(biāo)檢測

1.4.2.1 一般情況 觀察各組大鼠的一般情況，每3 d稱量記錄大鼠的體質(zhì)量，比較各組大鼠的活動、飲食、排便、皮毛膚色及精神狀況。

1.4.2.2 組織病理學(xué)檢測 處死各組大鼠，取膝關(guān)節(jié)，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，制成3 μm的薄片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、番紅O（safranin O，SO）染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4.2.3 ELISA檢測血清MMP-13、IL-1β表達(dá)水平 給藥8周后，大鼠禁食12 h，取血，4℃下3 000 r/min離心10 min，分離血清，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀上檢測血清中MMP-13、IL-1β的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及一般情況比較 造模及給藥期間，空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，自主活動與飲食飲水均正常；模型組大鼠出現(xiàn)自主活動減少、靜臥懶動、飲水減少等現(xiàn)象，但無抽搐顫栗、流涎、呼吸困難、痙攣等異常情況，毛順光亮，糞便成型，與空白對照組無明顯差別；各給藥組大鼠表現(xiàn)優(yōu)于模型組，給藥3 d后，各給藥組大鼠自主活動、飲水進(jìn)食、精神狀態(tài)開始恢復(fù)，1周左右活動飲食等均恢復(fù)正常，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間，空白對照組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長，與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長減緩，各時間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；隨著給藥時間增加，各給藥組大鼠體質(zhì)量亦持續(xù)增長，但均明顯低于同時間點(diǎn)空白對照組大鼠（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量增長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass in each group（±s，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass in each group（±s，g）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with blank control group， *P＜0.05，**P＜0.01.

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2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 HE染色可見，空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層厚度均勻，表面光滑，四層結(jié)構(gòu)清晰可見，無軟骨細(xì)胞核固縮、壞死現(xiàn)象；與空白對照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨層變薄、粗糙，四層結(jié)構(gòu)不易辨認(rèn)，部分區(qū)域軟骨細(xì)胞核固縮、壞死，偏于一側(cè)，鈣化層軟骨細(xì)胞呈簇狀堆積，排列紊亂，潮線多不規(guī)整甚至完全消失，軟骨下骨質(zhì)外露；與模型組比較，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)軟骨層增厚，骨細(xì)胞增多，脂肪細(xì)胞減少，且仙芎骨康中、高劑量、陽性對照組較低劑量組軟骨層修復(fù)更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理變化（HE染色，25×）Fig.1 Pathological changes of knee joints of rats in each group （HE staining， 25×）

SO染色可見，空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層厚度正常，表面光滑；與空白對照組比較，模型組大鼠軟骨明顯變薄，軟骨細(xì)胞局部排列紊亂；與模型組比較，各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增多，軟骨層明顯增厚，且仙芎骨康中、高劑量組、陽性對照組較低劑量組改善效果更為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理變化（SO染色，25×）Fig.2 Pathological changes of knee joints of rats in each group （SO staining， 25×）

2.3 各組大鼠血清MMP-13、IL-1β水平比較 與空白對照組比較，模型組及各給藥組大鼠血清MMP-13水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，仙芎骨康中、高劑量組和陽性對照組大鼠血清MMP-13水平顯著降低（P＜0.01）， 但三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而且仙芎骨康低劑量組大鼠血清MMP-13水平與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，模型組與各給藥組大鼠血清IL-1β水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清IL-1β均顯著降低 （P＜0.01），且給藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠血清MMP-13、IL-1β水平比較（±s）Tab.2 Comparison of MMP-13 and IL-1β serum level in each group（±s）

表2 各組大鼠血清MMP-13、IL-1β水平比較（±s）Tab.2 Comparison of MMP-13 and IL-1β serum level in each group（±s）

注：與空白對照組比較， **P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。Note:Compared with blank control group， **P＜0.01;compared with model group，▲▲P＜0.01.

組別 n MMP-13（ng·mL-1） IL-1β（pg·mL-1）空白對照組 8 7.331±0.645 6.208±0.244模型組 8 9.808±0.486** 8.536±0.417**仙芎骨康高劑量組 8 8.338±0.275**▲▲ 7.306±0.225**▲▲仙芎骨康中劑量組 8 8.492±0.295**▲▲ 7.439±0.225**▲▲仙芎骨康低劑量組 8 9.479±0.266** 7.481±0.409**▲▲陽性對照組 8 8.325±0.256**▲▲ 7.168±0.350**▲▲

3 討論

仙芎骨康顆粒是項(xiàng)目組在《太平圣惠方》仙靈脾散的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的中藥新藥，主治早、中期OA。方中淫羊藿補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕為君藥，川芎和威靈仙活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛為臣藥，桂心補(bǔ)火助陽、散寒止痛、溫通經(jīng)脈為佐藥，蒼耳子祛風(fēng)散寒止痛為使藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿可減少蛋白多糖丟失、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metallopeptidase-3，MMP-3）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)，減緩關(guān)節(jié)軟骨退變[1-2]；還能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化，抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，減輕滑膜炎癥反應(yīng)[3-4]。川芎能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)早期軟骨血管新生[5]；還能降低OA大鼠關(guān)節(jié)液中一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）水平[6]，從而能夠減輕關(guān)節(jié)軟骨退變，修復(fù)軟骨損傷[7]。威靈仙能抑制膝關(guān)節(jié)軟骨MMPs、TNF-α表達(dá)，維持和促進(jìn)軟骨合成蛋白多糖與Ⅱ型膠原[8-9]；減輕關(guān)節(jié)軟骨退變，改善骨關(guān)節(jié)功能[10-11]。肉桂能抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥因子的釋放[12]，減輕關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞[13]。蒼耳子具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，可用于關(guān)節(jié)炎的治療[14]。

本研究采用的Hulth法是OA經(jīng)典的手術(shù)造模方法[15]，主要通過切斷前交叉韌帶，刮損內(nèi)側(cè)半月板造成關(guān)節(jié)失穩(wěn)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)面間磨損增加，促使關(guān)節(jié)軟骨退變，與OA臨床病癥更為吻合。由于OA的病程發(fā)展往往不可逆轉(zhuǎn)，考慮中藥起效較慢、給藥周期較長（一般需2個月），為縮短實(shí)驗(yàn)周期，本文采用預(yù)防性給藥（給藥、造模同時進(jìn)行），即造模開始至造模完成的整個過程中，同時給予藥物干預(yù)，觀察比較干預(yù)8周后各給藥組與模型組、空白對照組的差異。本研究采用HE染色和SO染色，觀察膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變[16-18]，提示仙芎骨康顆?？纱龠M(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨層。

OA病變過程復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。MMP-13是促使軟骨降解的主要酶類，IL-1β則是促使軟骨代謝平衡轉(zhuǎn)向分解和誘導(dǎo)軟骨退化的主要細(xì)胞因子之一。許多臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究均表明，OA患者或OA模型中MMP-13和IL-1β呈高水平表達(dá)[19-27]，因此本研究將血清中MMP13和IL-1β的水平作為藥效的評價指標(biāo)。ELISA結(jié)果表明，仙芎骨康顆粒能有效抑制OA大鼠IL-1β的表達(dá)，中、高劑量則能有效抑制OA大鼠MMP-13的表達(dá)。鑒于在藥效相同的情況下，藥物服用的劑量越小有助于減輕不良反應(yīng)，故選用中劑量為最佳給藥劑量。

綜上所述，仙芎骨康顆粒對OA具有較好的防治作用，可有效改善OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理狀態(tài)，修復(fù)軟骨層，其機(jī)制可能與下調(diào)OA大鼠MMP-13的表達(dá)、抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β的分泌有關(guān)。