補(bǔ)體1q／腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9 改善急性心肌梗死小鼠心臟功能和減輕心肌組織纖維化

李香敏，譚延振，張 冰，趙 榮，易定華，孫 陽(yáng)，易 蔚，張 平

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的發(fā)病率顯著下降［1］，隨著早期再灌注治療策略的實(shí)施，以及新的藥理學(xué)方法的引入，AMI 的30天死亡率降低了60%，心臟急性事件期間預(yù)后獲得了很大改善，但生存率的提高導(dǎo)致AMI 后慢性心力衰竭的患者明顯增加［2-3］。 AMI 后心力衰竭的發(fā)病過(guò)程中抗心肌纖維化研究探索一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但是尚未研究出確實(shí)有效的治療靶點(diǎn)和方法。 補(bǔ)體1q／腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（complement 1q／ tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9）作為一種分泌糖蛋白在心臟高度表達(dá)，參與多種代謝紊亂的發(fā)生和發(fā)展，在心血管疾病的保護(hù)、炎癥的調(diào)控及糖脂代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。CTRP9 在改善AMI 后心肌重塑中也發(fā)揮重要作用，這與其抗心肌纖維化密切相關(guān)，但具體的分子機(jī)制尚未完全明確，限制其進(jìn)一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料 八周齡健康雄性野生型C57BL／6 小鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；CTRP9-KO 小鼠由南京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心構(gòu)建。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格按照國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。 抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）β1、抗波形蛋白（vimentin）抗體購(gòu)于abcam 公司，苯基吲哚（DAPI）藍(lán)色熒光購(gòu)于LEAGENE 公司，C1qTNF9 酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒購(gòu)于Cloud-clone 公司，小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購(gòu)于CMCTAG 公司，小鼠TGF-β1 酶免試劑盒購(gòu)于Elabscience 公司，H-89（二氫氯化物dihydrochloride）購(gòu)于MedChemExpress公司，Phospho-PKA C（Thr197） （D45D3） 兔單克隆抗體購(gòu)于CST 公司，重組補(bǔ)體1q／腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（recombinant Complement 1q／ tumor necrosis factor related protein 9，rCTRP9）由本實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠AMI 模型的構(gòu)建 小鼠AMI 模型由美國(guó)Thomas Jefferson 大學(xué)的Gao Erhe 教授幫助構(gòu)建。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式 手術(shù)4 h 后，待動(dòng)物麻醉完全復(fù)蘇后，將AMI 組C57BL／6 小鼠隨機(jī)分為3 組：AMI+Vehicle 組（小鼠進(jìn)行AMI 手術(shù)+腹腔注射生理鹽水）；AMI+CTRP9 組［小鼠進(jìn)行AMI手術(shù)+腹腔注射rCTRP9 0.25 μg／（g·day）］；AMI+CTRP9+H89 組［小鼠進(jìn)行AMI 手術(shù)+腹腔注射H-89 0.5 μg／（g·day）+腹腔注射rCTRP9 0.25 μg／（g·day）］；外加另外3 組：KO-AMI+Vehicle 組（KO 小鼠進(jìn)行AMI 手術(shù)+腹腔注射生理鹽水）；野生型小鼠（wild type，WT）假手術(shù)（Sham）+Vehicle 組（WT 小鼠進(jìn)行假手術(shù)操作+腹腔注射生理鹽水）；KO-Sham+Vehicle 組（KO 小鼠進(jìn)行假手術(shù)操作+腹腔注射生理鹽水）。

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)管理 開(kāi)放管理，自由采食，足量飲水。 每日檢查有無(wú)死亡動(dòng)物，AMI 后第4 天處死少量動(dòng)物留取血清標(biāo)本，手術(shù)后第28 天行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后，處死動(dòng)物，留取標(biāo)本。

1.2.4 心臟功能評(píng)估 應(yīng)用Matrx 動(dòng)物麻醉機(jī)將異氟烷和氧氣混合后在麻醉盒內(nèi)將小鼠麻醉后四肢用膠布固定并繼續(xù)吸入混合氣維持麻醉，使用Vevo2100 小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)并計(jì)算小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.5 取材 應(yīng)用Matrx 動(dòng)物麻醉機(jī)將異氟烷和氧氣混合后在麻醉盒內(nèi)將小鼠麻醉，稱(chēng)重、取血標(biāo)本、取出心臟用磷酸鹽緩沖液將血液沖洗干凈后稱(chēng)重。

1.2.6 石蠟包埋小鼠心臟及切片 將小鼠左心室用多聚甲醛固定后修剪、石蠟包埋、切片。

1.2.7 小鼠心臟組織masson 染色 脫蠟至水、重鉻酸鉀染色、鐵蘇木素染色、麗春紅酸性品紅染色、磷鉬酸染色、苯胺藍(lán)染色、分化、透明封片。 結(jié)果判讀：膠原纖維呈藍(lán)色；肌纖維呈紅色。

1.2.8 心肌組織免疫熒光染色檢測(cè)CTRP9 表達(dá)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）／vimentin 雙染檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞 石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、透化處理、封閉、孵化一抗（CTRP9 稀釋比例為1 ∶50，α-SMA 稀釋比例為1 ∶100，vimentin 稀釋比例為1 ∶100）、孵化二抗、染核、封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.9 波形蛋白vimentin 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)小鼠血清CTRP9、TGF-β1 水平 參照ELISA 試劑盒步驟檢測(cè)血清CTRP9、TGF-β1 水平變化。

1.2.10 免疫蛋白印跡（Western Blotting）檢測(cè)心肌組織蛋白表達(dá) Western Blotting 檢測(cè)心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1、蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）、p-PKA 蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 文中和圖中的所有數(shù)值均以n 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示。 數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism-5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 生存曲線采用Log-rank （Mantel-Cox）檢驗(yàn)。 對(duì)兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，對(duì)多組數(shù)據(jù)首先對(duì)所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni＇s 多重比較檢驗(yàn)。P≤0.05（雙側(cè)）認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AMI 28 d 后，小鼠生存率顯著減低，心臟收縮功能明顯降低，心肌纖維化程度明顯增加 AMI+Vehicle 組死亡率為（10／27）、 Sham+Vehicle 組為（0／16）， Log-rank （Mantel-Cox）檢驗(yàn)，I2＝7.233，P＝0.0072，AMI 后小鼠生存顯著降低；Sham+Vehicle組心臟重量／體重為（4.475±0.165）mg／g， AMI+Vehicle 組心臟重量／體重為（6.675±0.135）mg／g，AMI后小鼠心臟變大；Sham+Vehicle 組LVEF 為（74.460±1.668）%，AMI+Vehicle 組LVEF 為（25.190±1.488）%，AMI 后小鼠心臟收縮功能明顯減低；Sham+Vehicle組（左室游離壁）纖維化為（0.495±0.084）%，AMI+Vehicle 組（梗死交界區(qū)）心肌纖維化為（25.410±1.041）%，AMI 后小鼠梗死交界區(qū)心肌纖維化明顯增加。 見(jiàn)圖1。

圖1 Sham+Vehicle 組與AMI+Vehicle 組心臟大小、收縮功能、纖維化程度比較

2.2 AMI 后小鼠心肌組織及血清CTRP9 水平降低，血清TGF-β1 水平明顯升高，梗死交界區(qū)肌成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加，PKA 活性增強(qiáng)，纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加 小鼠AMI 后第28 天應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠AMI 后心肌組織CTRP9 表達(dá)變化，與Sham+Vehicle 組（左室游離壁）比較，AMI+Vehicle 組CTRP9 在遠(yuǎn)離區(qū)、交界區(qū)及梗死區(qū)表達(dá)均有不同程度降低，且越接近梗死區(qū)，降低越嚴(yán)重。 見(jiàn)圖2。

圖2 Sham+Vehicle 組與AMI+Vehicle 組心肌組織染色圖像及蛋白變化比較

小鼠AMI 后第4 天Sham+Vehicle 組血清CTRP9 為（907.000±40.190） μg／L， AMI+Vehicle 組為（519.700±17.770）μg／L，n ＝5，t檢驗(yàn)P＜0.001，AMI 后小鼠血清CTRP9 水平明顯降低。 小鼠AMI后第4 天Sham+Vehicle 組血清TGF-β1 為（66.790±2.690）ng／L， AMI+Vehicle 組為（118.500±6.872）ng／L，n ＝5，t檢驗(yàn)P＜0.001，AMI 后小鼠血清TGFβ1 水平明顯升高。

小鼠AMI 后第28 天Sham+ Vehicle 組心肌組織中（左室游離壁）肌成纖維細(xì)胞數(shù)量（α-SMA／Vimentin 雙染陽(yáng)性）為（0.250±0.250），AMI+Vehicle 組（梗死交界區(qū)）為（7.500±0.646），n ＝4，t檢驗(yàn)P＜0.001，AMI 后小鼠梗死交界區(qū)肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增加。

小鼠AMI 后第28 天AMI+ Vehicle 組心肌組織（取自梗死交界區(qū)）膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、TGFβ1、p-PKA／PKA 分別為Sham+Vehicle 組（取左室游離壁）的（2.819±0.427）倍、（1.839±0.089）倍、（1.605±0.062）倍，n ＝4，t檢驗(yàn)P＝0.0238、P＝0.0025、P＝0.0023，AMI 后膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1 表達(dá)升高，PKA磷酸化水平增高，活性顯著增加。

2.3 敲除CTRP9 AMI 小鼠較野生型AMI 小鼠28天死亡率更高，心臟收縮功能更差，心肌纖維化更加嚴(yán)重，PKA 活性受到部分抑制，纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)增加更多 WT-Sham+Vehicle 組小鼠第28 天死亡率為（0／13），KO-Sham+Vehicle 組為（0／11），WT-AMI+Vehicle 組為（10／27），KO-AMI+Vehicle 組為（10／22）。 4 組Log-rank （Mantel-Cox）檢驗(yàn)，χ2＝12.52，P＝0.0058，4 組之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然KO-AMI+ Vehicle 組較WT-AMI+Vehicle組死亡率增加，但2 組之間χ2＝0.2983，P＝0.5849，生存曲線未達(dá)到統(tǒng)計(jì)差異。 見(jiàn)圖3。

圖3 WT-Sham+Vehicle、KO-Sham+Vehicle、WT-AMI+Vehicle、KO-AMI+Vehicle 四組檢測(cè)圖像和各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)比較

WT-Sham+Vehicle 組心臟重量／體重為（4.475±0.165）mg／g，n ＝6，KO-Sham+Vehicle 組心臟重量／體重為（4.633±0.194）mg／g，n ＝6，t檢驗(yàn)P＝0.5485，KO-CTRP9+Vehicle 組小鼠心臟大小與WT-Sham+Vehicle 組小鼠無(wú)差異；WT-AMI+Vehicle 組心臟重量／體重為（6.675±0.135）mg／g，n ＝6，KO- AMI+Vehicle 組心臟重量／體重為（7.233 ±0.145）mg／g，n ＝6，t檢驗(yàn)P＝0.0182， AMI 后KO-CTRP9 型小鼠心臟比WT-AMI 組明顯增大。

WT-Sham+Vehicle 組LVEF 為（74.460±1.668）%，n ＝5，KO-Sham+Vehicle 組LVEF 為（73.400±1.839）%，n＝5，t檢驗(yàn)P＝0.7931，兩組小鼠心臟收縮功能無(wú)差異；KO-AMI+Vehicle 組LVEF 為（15.100±1.345）%，n＝5，WT-AMI+Vehicle 組LVEF 為（25.190±1.488）%，n ＝5，t檢驗(yàn)P＝0.0010，KO-AMI+Vehicle 組小鼠心臟收縮功能減低更嚴(yán)重。

Masson 染色檢測(cè)KO-Sham+Vehicle 組（左室游離壁）纖維化為（0.495±0.084）%，n ＝4，KO-Sham+Vehicle 組（梗死交界區(qū)）纖維化為（0.510±0.103）%，n ＝4，t檢驗(yàn)P＝0.9139，兩組小鼠心肌纖維化程度無(wú)差異；WT-AMI+Vehicle 組纖維化為（25.410±1.041）%，n ＝4，KO-AMI+Vehicle 組纖維化為（31.550±2.098）%，n ＝4，t檢驗(yàn)P＝0.0395， KO-AMI+Vehicle 組小鼠心臟纖維化較WT-AMI+Vehicle 組小鼠嚴(yán)重。

KO-Sham+ Vehicle 組心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1、p-PKA／PKA 分別為WT-Sham+ Vehicle組的（1.029±0.079）倍、（1.010±0.088）倍、（0.984±0.080）倍，n ＝4，t檢驗(yàn)P＝0.7365、P＝0.9197、P＝0.8494，兩組之間膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1、PKA 磷酸化水平無(wú)差異；WT-AMI+Vehicle 組心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1、p-PKA／PKA 分別為WT-Sham+Vehicle 組的（2.819±0.427）倍、（1.839±0.089）倍、（1.605±0.062）倍，KO- AMI+Vehicle 組心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1、p-PKA／PKA 分別為WT-Sham+Vehicle 組的（3.110±0.464）倍、（2.257±0.092）倍、（1.465±0.047）倍，n ＝4，WT-AMI+Vehicle 組與KO-AMI+Vehicle 組之間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＝0.0090、P＝0.0126、P＝0.0063，KO-AMI+Vehicle 組較WT-AMI+Vehicle 組膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1 表達(dá)升高，PKA 磷酸化水平減低，活性受到抑制。

2.4 補(bǔ)充rCTRP9 后小鼠AMI 第28 天的死亡率較AMI+Vehicle 組降低，心臟收縮功能改善，心肌纖維化減輕，纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)減少，且這種作用可被PKA 抑制劑H-89 阻斷 AMI 后第28 天AMI+Vehicle 組小鼠死亡率為（10／27）， AMI+CTRP9 組為（4／26），AMI+CTRP9+H-89 組為（9／27）；Log-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)，χ2＝3.272，P＝0.1948。 雖然AMI+CTRP9 組死亡率較AMI+Vehicle 組及AMI+CTRP9+H-89 組減低，但三組生存曲線未達(dá)到統(tǒng)計(jì)差異。 見(jiàn)圖4。

圖4 AMI+ Vehicle、AMI+CTRP9、AMI+CTRP9+H-89 三組檢測(cè)圖像和各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)比較

AMI+Vehicle 組心臟重量／體重為（6.675±0.135）mg／g，n ＝6，AMI+CTRP9 組心臟重量／體重為（5.833±0.182）mg／g，n ＝6，AMI+CTRP9+H-89 組心臟重量／體重為（6.600±0.193）mg／g，n ＝6，AMI+CTRP9 組小鼠心臟比AMI+Vehicle 組小鼠減小，AMI+Vehicle 組和AMI+CTRP9+H-89 組小鼠心臟大小無(wú)差異，AMI+CTRP9+H-89 組較AMI+CTRP9 組小鼠心臟增大。

心臟超聲檢查AMI+Vehicle 組LVEF 為（25.190±1.488）%，AMI+CTRP9 組LVEF 為（41.250±1.493）%，AMI+CTRP9+H-89 組LVEF 為（26.760±1.481）%，n ＝5，AMI+CTRP9 組小鼠心臟收縮功能較AMI+Vehicle 組明顯增強(qiáng)，AMI+Vehicle 組和AMI+CTRP9+H-89 組小鼠心臟收縮功能無(wú)差異，AMI+CTRP9+H-89 組較AMI+CTRP9 組小鼠心臟收縮功能明顯差。

Masson 染色檢測(cè)AMI+Vehicle 組（梗死交界區(qū)）纖維化為（25.410 ±1.041）%，AMI+CTRP9 組纖維化為（17.510 ±0.893）%，n ＝4，AMI+CTRP9+H-89 組纖維化為（25.430 ±1.031）%，n ＝4，AMI+CTRP9 組小鼠心肌纖維化程度較AMI+Vehicle 組明顯減輕，AMI+Vehicle 組和AMI+CTRP9+H-89 組小鼠心肌纖維化程度無(wú)差異，AMI+CTRP9+H-89 組較AMI+CTRP9 組小鼠心肌纖維化程度明顯重。

Western Blotting 檢測(cè)AMI+CTRP9 組心肌組織（梗死交界區(qū)）蛋白表達(dá)變化原蛋白Ⅰ、TGF-β1、p-PKA／PKA 分別為AMI+Vehicle 組的（0.624±0.054）倍、（0.538±0.082）倍、（1.598±0.058）倍，AMI+CTRP9+H-89 組心肌組織（梗死交界區(qū)）蛋白表達(dá)變化原蛋白Ⅰ、TGF-β1、p-PKA／PKA 分別為AMI+Vehicle 組的（0.947±0.096）倍、（0.988 ± 0.101）倍、（1.113±0.078）倍，n ＝4，AMI+CTRP9 組小鼠心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1 的表達(dá)量較AMI +Vehicle明顯減少，AMI+Vehicle 組和AMI+CTRP9+H-89 組小鼠心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1 的表達(dá)量無(wú)差異，AMI+CTRP9+H-89 組較AMI+CTRP9 組小鼠心肌組織膠原蛋白Ⅰ、TGF-β1 的表達(dá)量明顯增加，AMI+CTRP9 組小鼠PKA 磷酸化激活程度較AMI+Vehicle 升高，AMI+Vehicle 組和AMI+CTRP9+H-89組小鼠PKA 磷酸化激活程度相同，AMI+CTRP9+H-89 組較AMI+CTRP9 組小鼠PKA 磷酸化激活減低。

3 討 論

缺血性心臟病在全球范圍內(nèi)仍然是主要死亡原因［4］，心肌成纖維細(xì)胞通過(guò)沉積細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)修復(fù)壞死心肌組織，在心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［5］。 AMI 后非梗死區(qū)局部結(jié)締組織的擴(kuò)張，梗死邊緣區(qū)和遠(yuǎn)離區(qū)未受損傷心肌的反應(yīng)性纖維化導(dǎo)致心肌硬度增加，順應(yīng)性降低，從而進(jìn)一步降低心輸出量［6］，引起心臟功能衰竭，這是造成AMI 致死的重要原因之一。

CTRP9 是一種在心臟高度表達(dá)的分泌糖蛋白，在心血管疾病的保護(hù)、炎癥的調(diào)控及糖脂代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，本研究組在過(guò)去研究中發(fā)現(xiàn)在缺血性心臟損傷中，血漿和心室組織中CTRP9 的表達(dá)顯著降低，CTRP9 具有明顯的心肌保護(hù)作用，CTRP9 通過(guò)改善心肌纖維化在改善心肌重塑中發(fā)揮重要作用［7］。 但目前研究CTRP9 主要以心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，以心肌成纖維細(xì)胞作為對(duì)象的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用免疫熒光染色的方法直接觀察了AMI 不同區(qū)域CTRP9 的表達(dá)變化，與缺血的嚴(yán)重程度直接相關(guān)，表達(dá)水平從梗死遠(yuǎn)離區(qū)、交界區(qū)、梗死區(qū)依次明顯降低。 在小鼠AMI 后第4 天血清中CTRP9 水平明顯減低伴隨著血清中TGF-β1 明顯升高。 TGF-β 家族是研究最多的纖維反應(yīng)調(diào)節(jié)因子之一，它在心肌損傷后的適應(yīng)和重塑中起著重要作用［8-10］。 本研究發(fā)現(xiàn)AMI 后28 天梗死交界區(qū)肌成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加。 肌成纖維細(xì)胞分泌大量結(jié)構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［11-12］，可以引起心肌組織纖維化，在梗死交界區(qū)纖維化明顯增加。 這些結(jié)果提示在AMI 過(guò)程中CTRP9 的表達(dá)降低及TGF-β1 的升高可引起成纖維細(xì)胞的持續(xù)激活，分泌大量基質(zhì)蛋白造成心肌組織發(fā)生纖維化。

為了進(jìn)一步證實(shí)這一觀點(diǎn)，本研究構(gòu)建了CPRT9 敲除小鼠，在無(wú)AMI 時(shí)，KO-CTRP9 小鼠與WT 型小鼠心肌纖維化程度及心臟收縮功能基本一致，但在AMI 發(fā)生后，KO-CTRP9 小鼠的心肌纖維化程度更加嚴(yán)重，心臟收縮功能降低更加嚴(yán)重，從反面證實(shí)CTRP9 的減低參與了AMI 后過(guò)度的心肌纖維化并且造成心臟收縮功能的進(jìn)一步減低。 補(bǔ)充rCTRP9 后，心肌纖維化明顯減輕，心臟收縮功能明顯改善，從正面證實(shí)補(bǔ)充CTRP9 可減低AMI 后的心肌纖維化并且改善心臟的收縮功能。

前期研究證實(shí)CTRP9 可激活促生存信號(hào)分子PKA 而抑制H9C2 細(xì)胞缺氧損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡減輕心肌重塑［7］。 本研究發(fā)現(xiàn)在AMI 后第28天，PKA 活性水平比對(duì)照組明顯升高，而KOCTRP9 小鼠的AMI 發(fā)生后，PKA 活性水平比野生型AMI 小鼠明顯減低；補(bǔ)充rCTRP9 后PKA 活性水平進(jìn)一步明顯提高，從正反兩面證實(shí)在整體水平CTRP9 通過(guò)影響PKA 活性發(fā)揮抗AMI 后心肌纖維化，改善心臟收縮功能。

為了進(jìn)一步研究PKA 通路在CTRP9 抗AMI 后心肌纖維化中的作用，在動(dòng)物水平應(yīng)用PKA 抑制劑H-89 阻斷PKA 活性升高，觀察CTRP9 抗AMI 后心肌纖維化的作用的變化。 發(fā)現(xiàn)應(yīng)用H-89 后補(bǔ)充rCTRP9 引起的PKA 活性水平提高被阻斷，同時(shí)Masson 染色檢測(cè)AMI 交界區(qū)纖維化結(jié)果顯示CTRP9 抗AMI 后心肌纖維化作用也被阻斷，CTRP9改善心臟收縮功能的作用也隨之被阻斷。

本研究證實(shí)CTRP9 有通過(guò)PKA 通路減輕AMI小鼠心肌組織纖維化和改善心臟功能的作用。