芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

宋 歌 高 偉 冀亞茹 李 娜 郭婷婷 晏婷婷 徐曉燕

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥理學(xué)研究所，山東泰安 271016

芍藥苷（paeoniflorin，PF）是中草藥芍藥的主要有效成分，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、解熱解痙、利尿以及護(hù)肝作用，并且具有擴(kuò)張血管、抗血栓、抗高血脂、抗炎、抗腫瘤、抗?jié)兒涂惯^敏、抗抑郁、抗自由基損傷等多種生物學(xué)效應(yīng)［1-4］。近年來，PF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用越來越受關(guān)注，研究顯示，PF可以改善神經(jīng)突觸可塑性損傷，對(duì)腦缺血損傷、阿爾茨海默病等都有一定的治療作用［5-9］。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK2N2SH，具有神經(jīng)突觸樣的細(xì)胞質(zhì)突起，廣泛運(yùn)用于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制研究［10-12］。本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法和蛋白質(zhì)印跡法研究不同濃度的芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（Infinife M200 pro型號(hào)TECAN公司）；美國bio-RAD Powerpac Basic電泳儀（伯樂）；倒置顯微鏡（OLYMPUS-1＊71）。DMEM完全高糖培養(yǎng)液（江蘇凱基生物科技股份有限公司）。脂多糖（SIGMA公司）；芍藥苷［peoniflorn，PF，南京普怡生物科技有限公司（批號(hào)SYG20150522），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.76%（HPLC測定）］；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京Solarbio公司）；NLRP3、Bax、Bcl2、β-actin（一抗，美國abcom公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。隨機(jī)分為（1）正常對(duì)照（control）組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；（2）LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1μg/μL LPS；（3）芍藥苷組：培養(yǎng)液中先加入PF（100、200和400μg/mL）培養(yǎng)24 h，再加入0.1μg/μL LPS；繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞活力和LDH測定 將細(xì)胞按4×103/孔接種于96孔板上，經(jīng)上述分組處理后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，每組每孔加入CCK-8溶液10μL，在37℃繼續(xù)孵育2 h，多功能酶標(biāo)儀于450 nm處測定光密度（optical density，OD）值。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其OD值占對(duì)照組OD值的百分比表示，計(jì)算各組細(xì)胞存活率，并進(jìn)一步計(jì)算脂多糖對(duì)各組細(xì)胞增殖的抑制率。

1.2.3 Western blot法分析NLRP3、Bax、Bcl-2在各組細(xì)胞中的表達(dá) 將細(xì)胞按6×103/孔接種于6孔板上，經(jīng)上述分組處理后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，提取各組細(xì)胞總蛋白，調(diào)整各組蛋白濃度，將等量各組蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)8%奶粉液封閉4 h。將封閉好的相應(yīng)PVDF膜條正面朝上分別放入經(jīng)封閉液稀釋好的一抗（NLRP3、Bax、Bcl2、β-actin）中4℃孵育過夜，第二天取出后室溫?fù)u晃2 h。洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，抗原-抗體復(fù)合物用ECL法顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，MD，USA）分析蛋白條帶積分光密度（integrated optical density，IOD）值，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞生長良好，樹枝狀軸突明顯，細(xì)胞生長為橢圓形或梭形，細(xì)胞透亮；LPS組的細(xì)胞有損傷且細(xì)胞密度變小，細(xì)胞的間隙變大，細(xì)胞增殖受到抑制；LPS+PF組的細(xì)胞生長較好，密度相對(duì)較大，細(xì)胞增殖受抑制減輕。細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芍藥苷組細(xì)胞抑制率明顯降低，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表1。

表1 芍藥苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

2.2 芍藥苷對(duì)NLRP3炎性小體表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞NLRP3表達(dá)增加，而芍藥苷組的細(xì)胞NLRP3降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示芍藥苷對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與降低NLRP3的表達(dá)和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。結(jié)果見圖1，表2。

表2 芍藥苷對(duì)NLRP3炎性小體表達(dá)的影響

圖1 芍藥苷對(duì)NLRP3炎性小體表達(dá)的影響

2.3 芍藥苷對(duì)Bax及Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，芍藥苷組Bax蛋白表達(dá)降低、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，且具有一定劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示芍藥苷可以影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果見圖2，表3。

表3 芍藥苷對(duì)BAX及Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 芍藥苷對(duì)BAX及Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

脂多糖中脂質(zhì)A是細(xì)菌內(nèi)毒素活性的根源，可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，使細(xì)胞增殖受抑制，甚至凋亡［13-14］。本實(shí)驗(yàn)前期采用MTT法摸索了LPS誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的最佳濃度為0.1μg/μL，損傷時(shí)間為24 h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行芍藥苷的預(yù)保護(hù)，結(jié)果顯示，各濃度芍藥苷可明顯減輕LPS造成的SHSY5Y細(xì)胞損傷，細(xì)胞活力受抑制的程度明顯減輕，并存在一定的劑量依賴性。

NLRP3炎癥小體是一種大分子多蛋白復(fù)合體，能被多種病原相關(guān)的分子進(jìn)行活化，對(duì)發(fā)揮固有免疫系統(tǒng)的功能具有重要的作用。NLRP3可以被脂多糖刺激活化，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)炎癥性腸病和阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生［15-18］。目前研究表明，NLRP3炎癥小體可能成為多種炎癥疾病的核心及防治的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂多糖可使NLRP3的表達(dá)增加，芍藥苷可使NLRP3的表達(dá)降低，提示芍藥苷對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與降低NLRP3的表達(dá)和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

研究表明，細(xì)胞凋亡與很多神經(jīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中Bcl-2的發(fā)現(xiàn)打開了基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的先河，其在線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上編碼26 kD的蛋白，通過過度表達(dá)來有效抑制細(xì)胞凋亡［19］。Bax是一類與Bcl-2作用相反的促凋亡蛋白，屬于Bcl家族，它的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究顯示，細(xì)胞增殖及凋亡與Bax表達(dá)有關(guān)［20］。所以，通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡水平，而Bcl-2和Bax也成為了評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖組Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加，而芍藥苷組Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)降低，提示芍藥苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用，可能與其上調(diào)Bcl-2表達(dá)及下調(diào)Bax表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

綜上所述，芍藥苷可通過抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)；同時(shí)增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制脂多糖誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活率。本研究為進(jìn)一步深入闡明芍藥苷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突