基于UPLC指紋圖譜和一測多評法的虎杖藥材質(zhì)量評價

梁慧 潘曉君 楊文惠 呂渭升 羅宇琴 吳佳璇 魏梅 程學(xué)仁 蘭小勇 李振雨

摘 要 目的：建立虎杖藥材的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并測定藥材中4種活性成分的含量，為虎杖藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)。方法：以色譜柱為Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液（梯度洗脫）、流速為0.4 mL/min、柱溫為40 ℃、檢測波長為290 nm、進樣量為1 μL的色譜條件建立虎杖藥材的UPLC指紋圖譜，并采用相似度計算、聚類分析和正交偏最小二乘法判別分析方法對指紋圖譜進行評價。以虎杖苷為內(nèi)參物，測定白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素的相對校正因子，建立一測多評法;再利用相對校正因子計算15批虎杖藥材中上述4種成分的含量，并將一測多評法與外標(biāo)法的結(jié)果進行比較。結(jié)果：建立了15批虎杖藥材的UPLC指紋圖譜，確定了12個共有峰，指認(rèn)出了其中5個成分，分別為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚。15批虎杖藥材指紋圖譜的相似度為0.865～0.976;聚類分析將15批藥材分為4類，并呈現(xiàn)一定的產(chǎn)地規(guī)律性;正交偏最小二乘法判別分析共確定了7個差異性標(biāo)志物，差異顯著性排序為峰7>大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷>白藜蘆醇>峰8>虎杖苷>峰1>峰10。采用一測多評法測得的15批虎杖藥材中白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素的含量與外標(biāo)法測得的含量的相對平均偏差均小于5.0%，說明兩種方法無明顯差異。結(jié)論：UPLC指紋圖譜結(jié)合一測多評法可便捷、可靠地對虎杖藥材進行質(zhì)量評價;安徽和重慶所產(chǎn)虎杖藥材的質(zhì)量較優(yōu)。

關(guān)鍵詞 虎杖;超高效液相色譜法;指紋圖譜;一測多評法;含量測定;質(zhì)量評價;產(chǎn)地

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the UPLC fingerprint of Polygonum cuspidatum， and to determine the contents of four active ingredients and to provide reference for the quality evaluation of P. cuspidatum. METHODS： The determination was performed on Waters BEH C18 column （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid （gradient elution） at flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and detection wavelength was 290 nm. The sample size was 1 μL. The fingerprints were evaluated by similarity calculation， cluster analysis and orthogonal partial least square discriminant analysis （OPLS-DA）. Using polydatin as internal standard， relative calibration factors of resveratrol， emodin-8-O- β-D-glucoside and emodin were determined to develop a method of QAMS. The contents of 4 above components in 15 batches of P. cuspidatum were calculated by relative calibration factors. The results of QAMS were compared with those of external standard. RESULTS： UPLC fingerprints of 15 batches of P. cuspidatum were established， and 12 common peaks were confirmed. Five components were identified， i.e. polydatin， resveratrol， emodin-8-O-β-D-glucoside， emodin， emodin methyl ether. The fingerprint similarity of 15 batches of P. cuspidatum was in the range of 0.865-0.976. According to cluster analysis， 15 batches of P. cuspidatum were classified into 4 categories， showing certain regularity of origin. Seven markers were identified by OPLS-DA method. The order of difference significance was peak 7>emodin-8-O-β-D-glucoside>resveratrol>peak 8>polydatin>peak 1>peak 10. The relative deviation among the contents of resveratrol， emodin-8-O-β-D-glucoside and emodin in 15 batches of P. cuspidatum determined by QAMS and external standard method was less than 5.0%， indicating that there was no significant difference between the two methods. CONCLUSIONS： UPLC fingerprint combined with QAMS method is convenient and reliable for the quality evaluation of P. cuspidatum; the quality of P. cuspidatum produced in Chongqing and Anhui province is better.

KEYWORDS? ?Polygonum cuspidatum; UPLC; Fingerprint; QAMS; Content determination; Quality evaluation; Producing area

虎杖，始載于《名醫(yī)別錄》，別名花斑竹、大蟲杖、苦杖、斑杖等[1]。2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根莖和根，其味微苦、性微寒，臨床常用于治療濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛等病癥[2]?；⒄纫酝鳟a(chǎn)于我國江南各省[1]，但目前我國虎杖產(chǎn)量最大的3個產(chǎn)區(qū)分別為湖北省十堰市、重慶市（主要為黔江區(qū)和石柱縣）和福建省三明市，這3個產(chǎn)區(qū)的虎杖總產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的85%以上[3]。

化學(xué)成分研究顯示，虎杖中主要含有以大黃素、大黃酚為代表的蒽醌類化合物和以虎杖苷、白藜蘆醇為代表的二苯乙烯類化合物，從而使該藥材具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂和擴張血管等多種藥理作用[4]。 虎杖含有多種有效化學(xué)成分，但2020年版《中國藥典》（一部）僅以大黃素和虎杖苷作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，難以全面反映該藥材質(zhì)量。近年來，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法為中藥材的整體質(zhì)量控制提供了一種新的思路[5-6]。目前有關(guān)虎杖指紋圖譜及其中一種或數(shù)種成分含量測定的研究較多[7-10]，但大都采用高效液相色譜法（HPLC），分析時間較長。超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)具有分離度好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，將UPLC指紋圖譜結(jié)合一測多評法用于虎杖藥材的質(zhì)量評價鮮有報道?；诖耍狙芯坎捎肬PLC法建立虎杖指紋圖譜，再結(jié)合一測多評法測定虎杖藥材中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素4種有效成分的含量，并利用相似度評價和化學(xué)計量學(xué)分析方法進行綜合評價，旨在為虎杖藥材的整體質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有H-Class型UPLC儀（美國Waters公司）、Vanquish型UPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、1290 Infinity型UPLC儀（美國Agilent公司）、ME204E型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.1 mg）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（美國Merck公司）。

1.2 主要試劑

本研究所用的主要試劑有購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號JOT-10422，純度98.85%）和購自中國食品藥品檢定研究院的虎杖苷對照品（批號111575-201603，純度87.3%）、大黃素對照品（批號110756-201913，純度96.0%）、白藜蘆醇對照品（批號111533-201703，純度99.4%）、大黃素甲醚對照品（批號110758-201817，純度99.2%）;乙腈（德國Merck公司）、甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

15批來自不同種植基地的虎杖藥材（表1）均經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蓼科植物虎杖P. cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7? ? ?μm），流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，12%A→20%A;7～10 min，20%A→28%A;10～12 min，28%A;12～15 min，28%A→30%A;15～16 min，30%A→80%A;16～20 min，80%A），流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為290 nm，進樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含50 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取虎杖藥材粉末（過三號篩，下同）約0.1 g，精密稱定，精密加入稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得）25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min;冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量;搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察 取供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。以虎杖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.13%（n=6），相對峰面積的RSD為0.16%～0.48%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液（編號S1）適量，分別于制備后在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以虎杖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.15%（n=6），相對峰面積的RSD為0.32%～0.51%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一批虎杖藥材粉末（編號S1）約0.1 g，平行6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以虎杖苷色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD為 0.25%～0.44%（n=6），相對峰面積的RSD為1.16%～2.08%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 虎杖藥材指紋圖譜的建立和色譜峰的指認(rèn)

取15批虎杖藥材粉末各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對15批虎杖藥材的UPLC指紋圖譜進行共有峰標(biāo)識，以S1號樣品的指紋圖譜作為參照圖譜進行全譜峰匹配，共標(biāo)識出12個共有峰，如圖1所示;以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），如圖2所示。通過與對照品的保留時間以及紫外-可見3D光譜進行比對，指認(rèn)了其中5個成分，其中峰2為虎杖苷、峰6為白藜蘆醇、峰9為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰11為大黃素、峰12為大黃素甲醚，如圖3所示。

2.5 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》計算15批虎杖藥材的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，15批虎杖樣品藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.865～0.976;來自安徽安慶（編號S4～S6）、重慶石柱（編號S1～S3）的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度較低，而來自江西（編號S7～S12）和浙江（編號S13～S15）的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度較高，說明安徽、重慶的虎杖藥材質(zhì)量與江西、浙江的虎杖藥材存在較大的差異;江西和浙江兩產(chǎn)地之間的樣品指紋圖譜相似度雖然也有一定的差異，但與安徽、重慶產(chǎn)樣品相比，差異較小。

2.6 指紋圖譜的化學(xué)計量學(xué)分析

化學(xué)計量學(xué)已廣泛應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地、基原、炮制和真?zhèn)舞b別等方面[11]，分為有、無監(jiān)督兩種統(tǒng)計方法。其一般先進行無監(jiān)督的系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，觀察樣本之間是否有分類趨勢，再采用偏最小二乘判別分析或者正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進行有監(jiān)督的模式識別，以顯示樣本間差異主要由哪些變量引起，并尋找差異性標(biāo)志物[6]。

2.6.1 聚類分析 以12個共有峰的“峰面積/稱樣量”為變量，以夾角余弦為距離，采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對15批不同產(chǎn)地虎杖藥材進行系統(tǒng)聚類，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)判別條件距離為5時，15批虎杖藥材被大致分為4類，其中編號S7～S12的樣品聚為Ⅰ類，編號S1～S3的樣品聚為Ⅱ類，編號S13～S15的樣品聚為Ⅲ類，編號S4～S6的樣品聚為Ⅳ類。該結(jié)果呈現(xiàn)一定的產(chǎn)地規(guī)律性：編號S7～S12的虎杖藥材來自江西，編號S1～S3的虎杖藥材來自重慶，編號S13～S15的虎杖藥材來自浙江，編號S4～S6的虎杖藥材來自安徽，說明不同產(chǎn)地的虎杖藥材具有一定的差異性，這與相似度評價結(jié)果基本一致。

2.6.2 OPLS-DA 根據(jù)聚類分析結(jié)果，進一步運用SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件對15批虎杖藥材進行OPLS-DA，其得分圖如圖5所示。由圖5可知，15批虎杖藥材按不同產(chǎn)地分為4組，即重慶產(chǎn)樣品（S1～S3）、安徽產(chǎn)樣品（S4～S6）、江西產(chǎn)樣品（S7～S12）、浙江產(chǎn)樣品（S13～S15）各聚為一類，且4組樣品聚類良好、分離明顯。本研究建立的模型參數(shù)R2X（cum）為0.852，R2Y（cum）為0.908，Q2（cum）為0.808，三者數(shù)值均趨近于1，表明該分組模型具有較強的解釋和預(yù)測能力[12]。運用統(tǒng)計推斷方法分析該模型[13]，將模型隨機排列200次做置換檢驗，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，R2和Q2截距值分別為0.122和-0.793，置換檢驗?zāi)Ｐ陀疑戏降恼鎸峈2和Q2值均大于樣本隨機排列后得到的R2和Q2值，說明建立的OPLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象[13]，可以用于不同產(chǎn)地虎杖藥材的模式識別。采用變量投影重要性（VIP）法，以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出7個差異性標(biāo)志物，按影響大小排序依次為峰7>峰9（大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷）>峰6（白藜蘆醇）>峰8>峰2（虎杖苷）>峰1>峰10，結(jié)果如圖7所示。

2.7 含量測定

2.7.1 線性關(guān)系考察 取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含虎杖苷189.00 μg、白藜蘆醇255.10 μg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷168.54 μg、大黃素162.79 μg的混合對照品貯備液。取上述混合對照品貯備液適量，加甲醇依次稀釋2、5、10、50倍，得到每1 mL含虎杖苷94.50、37.80、18.90、3.78 μg，含白藜蘆醇127.55、51.02、25.51、5.10 μg，含大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷84.27、33.71、16.85、3.37 μg，含大黃素81.40、32.56、16.28、3.26 μg的系列混合對照品溶液。取上述混合對照品貯備液和系列混合對照品溶液各1 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果如表3所示。

2.7.2 精密度試驗 取“2.7.1”項下混合對照品溶液（每1 mL含虎杖苷37.80 μg、白藜蘆醇51.02 μg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷33.71 μg和大黃素32.56 μg）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素峰面積的RSD分別為0.11%、0.13%、0.17%和0.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號S1）適量，分別于制備后在室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素峰面積的RSD分別為0.22%、0.35%、0.11%和0.41%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復(fù)性試驗 取同一批虎杖藥材粉末（編號S1）約0.1 g，平行6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算樣品含量。結(jié)果，樣品中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素的平均含量分別為2.68%、0.55%、1.48%和0.55%，RSD分別為0.87%、1.15%、0.93%和1.23%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知成分含量的虎杖藥材粉末（編號S1）約0.05 g，共9份，每3份一組，分別按1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 1.5的質(zhì)量比加入4種對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素的平均加樣回收率分別為100.34%、100.54%、100.34%和99.62%，RSD分別為0.58%、0.86%、0.51%和0.90%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.6 相對校正因子的計算 因為虎杖藥材中虎杖苷的含量較高，且其對照品易得，故本研究以虎杖苷為內(nèi)參物（S），按照下述公式計算相對校正因子：fsi=fs/fi=Cs×Ai/（Ci×AS）。式中，fsi為內(nèi)參物與其他成分（i）的相對校正因子，fs為內(nèi)參物的校正因子，fi為其他成分（i）的校正因子，Cs為內(nèi)參物的對照品質(zhì)量濃度，Ai為其他成分（i）的對照品峰面積，Ci為其他成分（i）的對照品質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物的對照品峰面積[14]。根據(jù)“2.7.1”項下線性關(guān)系考察結(jié)果，以對照品的質(zhì)量濃度及其對應(yīng)的峰面積計算內(nèi)參物虎杖苷與白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素的相對校正因子。結(jié)果，f虎杖苷/白藜蘆醇的平均值為1.647，RSD為0.7%;f虎杖苷/大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的平均值為0.890，RSD為1.9%;f虎杖苷/大黃素的平均值為1.287，RSD為2.4%，表明相對校正因子的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。

2.7.7 耐用性試驗 精密吸取“2.7.1”項下混合對照品溶液（每1 mL含虎杖苷37.80 μg、白藜蘆醇51.02 μg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷33.71 μg和大黃素32.56 μg）1? ?μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別考察不同UPLC儀、色譜柱、流速和柱溫對相對校正因子的影響。結(jié)果，相對校正因子的RSD均小于1.0%，表明上述不同條件對虎杖苷與白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素的相對校正因子無明顯影響，如表4所示。

2.7.8 色譜峰的定位 根據(jù)“2.7.7”項下耐用性試驗結(jié)果，以虎杖苷色譜峰為參照峰，計算白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素色譜峰相對于參照峰的相對保留時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同的UPLC儀、色譜柱、柱溫和流速時，各待測成分相對保留時間的RSD均小于5.0%，說明相對保留時間穩(wěn)定，可以用于待測成分色譜峰的定位。

2.7.9 樣品含量測定 精密稱取15批虎杖藥材粉末，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以外標(biāo)法計算樣品中虎杖苷的含量;再分別采用外標(biāo)法和一測多評法（以虎杖苷為內(nèi)參物）計算虎杖藥材中白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素的含量，并計算兩種方法所測含量的相對平均偏差，結(jié)果如表5所示。

由表5可知，采用外標(biāo)法和一測多評法測定的白藜蘆醇含量的相對平均偏差為0.92%～2.56%，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量的相對平均偏差為0～1.08%，大黃素含量的相對平均偏差為0～0.75%，均小于3.0%，說明一測多評法與外標(biāo)法的測定結(jié)果無明顯差異。15批虎杖藥材中，安徽產(chǎn)藥材中的虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的平均含量較高，重慶產(chǎn)藥材中的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量較高;而以上述4種成分的總量計，安徽產(chǎn)藥材的總量最高，重慶產(chǎn)藥材次之，江西產(chǎn)藥材第三，浙江產(chǎn)藥材最低，由此提示安徽和重慶所產(chǎn)虎杖藥材的質(zhì)量可能較優(yōu)。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

在指紋圖譜和一測多評法的構(gòu)建過程中，筆者采用UPLC儀在20 min內(nèi)即可實現(xiàn)主要色譜峰的良好分離，大大節(jié)約了分析時間。針對虎杖中的蒽醌類和二苯乙烯類成分，筆者分別選擇254、290、306 nm這3個不同的檢測波長對其進行考察，結(jié)果顯示各色譜峰在254 nm波長處的信號較弱;虎杖苷在306 nm波長處的響應(yīng)較強，但其他色譜峰的響應(yīng)較弱;當(dāng)選擇290 nm作為檢測波長時，所有色譜峰的基線平穩(wěn)且干擾較小，同時能檢測出更多特征成分，且各色譜峰的峰面積相差不大，因此最終選取290 nm作為本研究的檢測波長。在流動相的選擇方面，筆者選擇乙腈-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%乙酸溶液等4種不同的流動相系統(tǒng)進行試驗，結(jié)果顯示以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰的分離度及對稱因子較好;進一步通過優(yōu)化乙腈-0.2%甲酸溶液的洗脫程序，可使虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素的分離度均達到1.5以上，滿足一測多評法的分析要求。

3.2 指紋圖譜分析

本研究建立了15批虎杖藥材的UPLC指紋圖譜，確定了12個共有峰，并指認(rèn)了其中5個成分。15批虎杖藥材的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.865～0.976。安徽和重慶所產(chǎn)虎杖藥材的質(zhì)量與江西、浙江產(chǎn)藥材存在較大的差異;而江西和浙江兩產(chǎn)地的藥材指紋圖譜相似度雖然也有一定的差異，但與安徽、重慶產(chǎn)藥材相比差異較小。聚類分析和OPLS-DA均將15批虎杖樣品藥材分為4類，呈現(xiàn)出一定的產(chǎn)地規(guī)律性。通過VIP法以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異性較大的組分，分別為峰7、峰9（大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷）、峰6（白藜蘆醇）、峰8、峰2（虎杖苷）、峰1和峰10，說明以上7個成分對虎杖藥材指紋圖譜的影響較大，下一步將結(jié)合質(zhì)譜分析和藥理研究對上述成分的譜效關(guān)系進行深入分析。

3.3 含量測定結(jié)果分析

傳統(tǒng)的單一成分定量難以全面反映藥材的質(zhì)量，而多指標(biāo)檢測方法因?qū)φ掌凡灰撰@得，導(dǎo)致檢測成本較高。本研究利用UPLC儀的高效分離能力和高靈敏度的特點，實現(xiàn)了對虎杖藥材中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素4種成分的一測多評;而有效成分大黃素甲醚因受到色譜峰附近小雜質(zhì)峰的影響，校正因子不穩(wěn)定，因此未被納入一測多評。對一測多評法與外標(biāo)法進行比較后發(fā)現(xiàn)，兩者含量測定結(jié)果的相對平均偏差在5.0%以內(nèi)，說明兩種方法的測定結(jié)果基本一致。一測多評法的經(jīng)濟性與適用性較強，結(jié)合UPLC法可大大縮短分析時間，從而為虎杖藥材的質(zhì)量評價及控制提供了新思路。本研究根據(jù)15批虎杖藥材的含量測定結(jié)果，推測安徽、重慶所產(chǎn)虎杖藥材的質(zhì)量較優(yōu);而考慮到重慶的虎杖藥材產(chǎn)量大，建議可選擇重慶為虎杖飲片、配方顆粒及相關(guān)復(fù)方制劑的原料產(chǎn)地。

綜上所述，本研究所建立的UPLC指紋圖譜結(jié)合一測多評法可便捷、可靠地對虎杖藥材進行質(zhì)量評價;安徽、重慶所產(chǎn)虎杖藥材的質(zhì)量較優(yōu)。這可為虎杖藥材的譜效關(guān)系研究及資源合理利用提供數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻

[ 1 ] 肖培根.新編中藥志：第一卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：579-582.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：217.

[ 3 ] 張兵，李光銳，段吉雄.十堰房縣：虎杖“生威”企強民富[J].民生周刊，2021（7）：62-63.

[ 4 ] 時圣明，潘明佳，王文倩，等.虎杖的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2016，39（2）：317-321.

[ 5 ] 劉東方，趙麗娜，李銀峰，等.中藥指紋圖譜技術(shù)的研究進展及應(yīng)用[J].中草藥，2016，47（22）：4085-4094.

[ 6 ] 于洋，李軍，李寶國.化學(xué)計量學(xué)在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用[J].中成藥，2018，40（5）：1139-1142.

[ 7 ] 劉慧文，王國凱，儲宣寧，等.不同產(chǎn)地虎杖HPLC指紋圖譜及6種成分含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2018，32（3）：13-17.

[ 8 ] 張清峰，付瑩娟，陳繼光，等.高效液相色譜法同時測定虎杖中五種活性成分[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（3）：216-219.

[ 9 ] 范玲，嚴(yán)冬，李爽，等.一測多評法測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素及大黃素甲醚的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（7）：103-107.

[10] 邵進明，戴勝云，徐文芬，等.一測多評法同時測定虎杖中4種不同類型成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（24）：2045-2049.

[11] 孫立麗，王萌，任曉亮.化學(xué)模式識別方法在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用進展[J].中草藥，2017，48（20）：4339- 4345.

[12] 黃躍前，程學(xué)仁，吳文平，等.基于指紋圖譜與多元統(tǒng)計分析的梔子不同炮制品評價[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報，2020，36（6）：765-770.

[13] 孫冬梅，羅思妮，魏梅，等.不同基原大黃指紋圖譜、多成分定量結(jié)合多元統(tǒng)計分析的質(zhì)量評價研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2021，37（1）：83-90.

[14] 黃敏燁，李振雨，童培珍，等.基于UPLC指紋圖譜和一測多評法的土貝母藥材質(zhì)量評價[J].中國中藥雜志，2020，45（14）：3459-3466.

（收稿日期：2021-02-01 修回日期：2021-07-12）

（編輯：胡曉霖）