煙管頭草水提物對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移與侵襲的影響

劉波 余佳 王坤 晏晨 黃麗榮 駱衡

摘 要 目的：研究煙管頭草水提物（AECC）對前列腺癌PC3細胞增殖、遷移與侵襲的影響。方法：將細胞分為對照組和AECC不同質量濃度組（5、10、20、40、80 μg/L），加入相應藥物或培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間（24、48、72 h）后，檢測細胞存活率。將細胞分為對照組和AECC低、中、高質量濃度組（20、40、80 μg/L），同法培養(yǎng)24 h后，采用Hoechst 33258染色法和流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況;采用Transwell實驗檢測細胞遷移數和侵襲數;采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應和Western blot法檢測AECC低、中質量濃度組細胞中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路相關遷移與凋亡蛋白[β-catenin、基質金屬蛋白酶7（MMP-7）、髓細胞瘤病毒致癌基因（c-Myc）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）]的mRNA和蛋白表達水平。結果：隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，AECC不同質量濃度組細胞存活率均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01），且呈不斷降低趨勢。與對照組比較，AECC各質量濃度組細胞的早期凋亡率（中質量濃度組除外），細胞遷移數和侵襲數，以及AECC低、中質量濃度組細胞中MMP-7、c-Myc（低質量濃度組除外）、Bcl-2（低質量濃度組mRNA除外）的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;AECC各質量濃度組細胞的晚期凋亡率，AECC低、中質量濃度組細胞中β-catenin、caspases-3（低質量濃度組除外）、Bax（低質量濃度組mRNA除外）的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：AECC可抑制PC3細胞的增殖、遷移與侵襲，其作用機制可能與調控β-catenin信號通路相關的遷移與凋亡因子的表達有關。

關鍵詞 煙管頭草;前列腺癌PC3細胞;β-連環(huán)蛋白;增殖;遷移;侵襲

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of the water extract from Carpesium cernuum （AECC） on the proliferation，? metastasis and invasion of prostate cancer PC3 cells. METHODS： Cells were divided into control group and different concentration groups of AECC （5， 10， 20， 40， 80 μg/L）， and then treated with relevant medicine or medium for different time （24， 48， 72 h）. The survival rates of cells were detected. Cells were divided into control group， and AECC low， medium and high concentration groups （20， 40， 80 μg/L）. After cultured for 24 h， Hoechst 33258 staining and flow cytometry were used to detect the apoptosis of cells. The number of cell metastasis and invasion were detected by Transwell assay. RT-qPCR and Western blot assay were applied to detect the mRNA and protein expression of β-catenin signaling pathway related migration and apoptosis proteins （β-catenin， MMP-7， c-Myc， caspase-3， Bcl-2 and Bax） in AECC low and medium concentration groups. RESULTS： With the increase of the concentration and culture time， the survival rates of cells in AECC different concentration groups were significantly lower than control group （P<0.05 or P<0.01）， and showed a decreasing trend. Compared with control group， the early apoptosis rate （except the medium concentration group） and the number of cell metastasis and invasion in AECC groups， the mRNA and protein expression of MMP-7， c-Myc （except for the low concentration group） and Bcl-2 （except for mRNA of the low concentration group） in AECC low and medium concentration groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Late apoptosis rate of AECC groups， the mRNA and protein expression of β-catenin， caspases-3 （except for the low concentration group）， Bax （except for mRNA of the low concentration group） in AECC low and medium concentration groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： AECC could inhibit the proliferation， metastasis and invasion of PC3 cells; the mechanism of which may be associated with regulating the expression of β-catenin signaling pathway related migration and apoptotic factors.

KEYWORDS? ?Carpesium cernuum; Prostate cancer PC3 cells; β-catenin; Proliferation; Metastasis; Invasion

前列腺癌是發(fā)病率較高的男性惡性腫瘤之一。隨著我國社會人口老齡化，前列腺癌發(fā)病率和病死率正逐年上升，嚴重影響男性的生活質量和生命安全[1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計報告顯示，2020年全球范圍內前列腺癌患者有141萬例，死亡病例為37.5萬例[2]。前列腺癌的發(fā)展進程快、易發(fā)生轉移，后期可形成去勢抵抗性前列腺癌，給患者的預后和治療帶來挑戰(zhàn)[3]。目前，臨床常用的治療方法為雄激素剝奪療法，其中阿比特龍、恩雜魯胺等一線治療用藥可延長患者總生存期，但在臨床上表現出明顯的副作用和耐藥等問題，影響其臨床療效[4]。因此，尋求安全有效的抗前列腺癌藥物具有重要意義。

煙管頭草Carpesium cernuum L.為菊科天名精屬多年生草本植物，別名煙袋草、杓兒菜，民族藥中也稱為野煙葉，廣泛分布于我國西南、華中等地，常藥用其秋季采摘的干燥全草[5]。煙管頭草味辛，具有清熱解毒、破瘀止血、消腫止痛等功效，主要用于治療感冒發(fā)熱、牙痛、咽喉腫痛、尿路感染、淋巴結核、皮膚瘙癢、毒蛇咬傷、血淋、乳腺炎等病癥[6-7]。貴州省土家族地區(qū)的中醫(yī)常將煙管頭草以水煎煮，用于治療前列腺癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、肺癌、肝癌等多種癌癥，且均具有一定療效[8]。本課題組前期研究發(fā)現，煙管頭草水提物（以下簡稱“AECC”）對前列腺增生細胞具有顯著的抑制作用[9]，但其對前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲的影響及作用機制并不明確。

腫瘤細胞的黏附能力是影響前列腺癌增殖、侵襲與遷移的重要因素，其中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是腫瘤細胞中一類重要的黏附分子，其可抑制遷移相關蛋白基質金屬蛋白酶7（MMP-7）和骨髓瘤病毒癌基因（c-Myc）的表達，從而促進胱天蛋白酶3（caspases-3）和B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）相關X蛋白（Bax）等凋亡蛋白的表達，進而抑制細胞增殖、遷移與侵襲[10-12]。由此可見，β-catenin信號通路與前列腺癌的增殖、遷移與侵襲密切相關。基于此，本文擬研究AECC對前列腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響，以期為煙管頭草的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有3111型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、ME204E型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、SYNERGY-H4型多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）、ECLIPSE TS100-F型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）、DMI8型熒光顯微鏡（德國Leica公司）、AllegraX-15R型高速離心機（美國Beckman公司）、NovoCyte型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences公司）、StepOne PlusTM型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Abi公司）、JY300HE型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、Odyssey CLX型雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)（美國LifeGen Technologies公司）。

1.2 主要藥品與試劑

煙管頭草全草采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣，經貴州中醫(yī)藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為菊科天名精屬植物煙管頭草C. cernuum L.的全草。其他藥品與試劑有DEME高糖培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號8121156），胎牛血清（杭州天杭四季青公司，批號201020703），胰酶（以色列BI公司，批號2043176），Trizol提取試劑（上海沃凱生物科技公司，批號213406），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國Becton Dickson公司，批號40302ES20），四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、青鏈霉素混合液、0.1%結晶紫染色液、全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為298931、D8370、20201203、P7630、BC3711），Hoechst 33258染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C0003、PC0020、P0012AC），PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW2569M），兔Bcl-2單克隆抗體、兔Bax單克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab32124、ab32503），兔GAPDH單克隆抗體、兔caspase-3單克隆抗體、兔c-Myc單克隆抗體、兔MMP-7多克隆抗體、兔β-catenin單克隆抗體、DyLightTM 800標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（美國CST公司，批號分別為5174、9665、13987、71031、8480、5151）;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計與合成，水為純凈水。

1.3 細胞

本研究所用前列腺癌PC3細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，保存于貴州省中國科學院天然產物重點實驗室。

2 方法

2.1 AECC的制備

取煙管頭草1 kg，粉碎，以2 L水加熱回流提取1 h，共提取3次，過濾;合并3次濾液，濃縮，即得煙管頭草浸膏（約246 g）。稱取上述浸膏0.2 g，加入DMSO 1 mL溶解，然后加水49 mL，制成質量濃度為4.0 g/L的AECC母液，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

PC3細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（簡稱“完全培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 PC3細胞存活率的檢測

采用MTT法進行檢測。取對數生長期PC3細胞，以5 000個/孔接種于96孔板中，每孔100 ?L，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;待細胞貼壁后，隨機分為對照組和AECC不同質量濃度組（5、10、20、40、80? ? ? μg/L，質量濃度參考文獻[9]設置），另設不含細胞只含完全培養(yǎng)基的空白組，每組設置5個復孔。對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基100 μL，AECC各質量濃度組分別加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基100 ?L，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時，向各組細胞加入MTT溶液20 μL，于37 ℃條件下孵育4 h后，以2 500 r/min離心15 min，棄上清;沉淀中加入DMSO 150 μL，采用酶標儀于490 nm波長處測定各孔吸光度（OD），然后按照文獻[13]方法，計算細胞存活率[細胞存活率（%）=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%]。上述實驗重復3次。

2.4 PC3細胞分組與給藥

取對數生長期的PC3細胞，以5×105個/皿接種于60 mm3的培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基5 mL ，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;待細胞貼壁后，隨機分成對照組和AECC低、中、高質量濃度組（20、40、80 μg/L，質量濃度根據“2.3”項下結果設置），每組設置3個平行皿。對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基5 mL，AECC各質量濃度組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)實驗。

2.5 PC3細胞凋亡情況的檢測

2.5.1 Hoechst 33258染色實驗 取對數生長期的PC3細胞，按“2.3”項下方法接種、分組與給藥后，收集細胞，分別取適量制成密度為1×105 mL-1的均勻細胞液;取上述細胞液10 ?L滴于載玻片上，加入固定液10 ?L，固定20 min;棄固定液，以PBS清洗3次，每次5 min;加入Hoechst 33258 染色液10 ?L，避光染色15 min;棄染色液，以PBS清洗3次，每次5 min。取潔凈的蓋玻片，滴加少許熒光淬滅液，蓋于上述載玻片上。采用熒光顯微鏡進行觀察，各組細胞選取3個視野，在DAPI通道下觀察并拍照（鏡下凋亡細胞呈藍白色熒光）。上述實驗重復3次。

2.5.2 流式細胞儀檢測實驗 取“2.5.1”項下收集的各組PC3細胞適量，制成密度為5×105 mL-1的均勻細胞液，按試劑盒說明書相關方法操作后，以200目細胞篩過濾，濾液采用流式細胞儀進行檢測，并計數各組細胞凋亡率。上述實驗重復3次。

2.6 PC3細胞遷移能力的檢測

將PC3細胞以DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使其處于饑餓狀態(tài);然后以1×105個/孔接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，同時在Transwell小室下層加入完全培養(yǎng)基750 ?L。按 “2.4”項下方法分組、給藥后，取出小室，用棉簽擦拭小室上層內側底部細胞以清除未遷移的細胞，然后置于甲醇中固定15 min，再以0.1%結晶紫染色液染色20 min。在顯微鏡下選取3個視野進行觀察（遷移細胞被染成紫色），計算各組細胞遷移數。上述實驗重復3次。

2.7 PC3細胞侵襲能力的檢測

將Matrigel膠低溫解凍后，加入6倍體積DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋混勻。將稀釋后的Matrigel膠鋪于Transwell小室濾膜上層，放至凝固;然后后續(xù)操作同“2.6”項下方法。在顯微鏡下選取3個視野進行觀察，計算各組細胞侵襲數。上述實驗重復3次。

2.8 PC3細胞中β-catenin信號通路相關基因mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）進行檢測。取對數生長期的PC3細胞，按“2.4”項下方法分組與給藥（因煙管頭草高質量濃度組細胞存活數較少，無法提取相關基因mRNA和蛋白，故后續(xù)僅進行其低、中質量濃度組的相關檢測）;收集各組細胞，分別加入Trizol試劑提取總RNA，再逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（50 ?L）為：cDNA模板2 ?L、2× UltraSYBR Mixture （High Rox） 25 ?L、上下游引物各1 ?L、ddH2O 21 ?L（PCR引物序列和產物長度見表1）。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。以GADPH為內參，采用2-ΔΔCt法計算β-catenin、MMP-7、c-Myc、caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表達水平。上述實驗重復3次。

2.9 PC3細胞中β-catenin信號通路相關蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期的PC3細胞，按“2.4”項下方法接種、分組與給藥后，收集細胞;采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，轉膜，以5%脫脂牛奶封閉1 h;以TBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入β-catenin、MMP-7、c-Myc、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 30 000），避光孵育2 h;以TBST緩沖液洗滌10 min×3次，經雙色紅外激光掃描成像儀成像。采用Image J 1.8.0軟件進行分析，以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。上述實驗重復3次。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.0進行數據的統(tǒng)計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 AECC對PC3細胞增殖的影響

培養(yǎng)24、48、72 h后，與對照組比較，AECC各質量濃度組細胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;且隨AECC質量濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率呈下降趨勢，詳見表2。當AECC質量濃度為20 μg/L、作用24 h時，細胞存活率為（69.45±0.92）%，提示該質量濃度提取物對PC3細胞有顯著的抑制作用，因此分別設置20、40、80 μg/L為AECC的低、中、高質量濃度，并選擇24 h為其作用時間。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.05，**P<0.01

3.2 AECC對PC3細胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色結果顯示，對照組細胞形態(tài)飽滿、染色面積廣;煙管頭草各質量濃度組隨給藥濃度增加，細胞數目減少，染色面積減少，凋亡細胞呈現較強藍白色熒光，詳見圖1。流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，AECC各質量濃度組細胞早期凋亡率（中質量濃度組除外）均顯著降低，晚期凋亡率均顯著升高（P<0.01），詳見表3、圖2。

3.3 AECC對PC3細胞遷移和侵襲能力的影響

與對照組比較，AECC各質量濃度組細胞的遷移數和侵襲數均顯著降低（P<0.01），詳見表4、圖3。

3.4 AECC對PC3細胞中β-catenin信號通路相關基因mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較，AECC中劑量組細胞中MMP-7、c-Myc、Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），β-catenin、caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;AECC低劑量組細胞中MMP-7的mRNA和蛋白表達水平以及Bcl-2的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），β-catenin的mRNA和蛋白表達水平以及Bax的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表5、表6、圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.05，**P<0.01

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

前列腺癌是全球男性最常見的惡性腫瘤之一，且隨著人們飲食習慣的改變，前列腺癌患者不斷增多;其潛伏期長，大部分患者早期無明顯癥狀，但當確診病情時，卻已發(fā)展至晚期[14-15]。與此同時，化療帶來的耐藥性等問題也會使得前列腺癌復發(fā)，進而導致病情惡化[16]，故尋求安全有效的前列腺癌治療藥物受到廣泛關注。相關研究表明，腫瘤細胞的黏附能力與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[17]，因此抑制腫瘤細胞的黏附能力可作為腫瘤的防治的策略之一。

AECC具有清熱解毒、止痛等作用[7]。本研究探討了AECC對人前列腺癌PC3細胞增殖、遷移與侵襲的影響。MTT實驗結果顯示，隨AECC濃質量濃度和作用時間的增加，AECC各質量濃度組細胞的存活率均顯著低于對照組，且呈不斷降低的趨勢，說明其對PC3細胞的增殖具有抑制作用。Hoechst染色和流式細胞儀檢測結果顯示，AECC各質量濃度組PC3細胞的早期凋亡率（中質量濃度組除外）均顯著降低，晚期凋亡率均顯著升高（P<0.01），說明其具有誘導細胞凋亡的作用，且主要作用于細胞凋亡晚期。Transwell實驗結果顯示，AECC各質量濃度組細胞遷移數和侵襲數均顯著降低，說明其具有抑制細胞遷移與侵襲的作用。

腫瘤細胞的黏附能力是評價腫瘤惡性進展的一個重要指標，其中黏附因子β-catenin的上調能促進其在細胞質中的積累，進而抑制遷移因子（如MMP-7、c-Myc等）的釋放，增強細胞間的黏連，影響細胞遷移與侵襲能力[18-19]。其中，MMP-7作為基質金屬蛋白酶，能降解細胞外基質蛋白;c-Myc作為一種可易位原癌基因，能影響腫瘤新血管的生成;兩者下調均能抑制細胞遷移和侵襲[20-21]。線粒體途徑和caspase途徑能協同誘導細胞凋亡[22-23]。其中，caspase-3屬于caspase家族的“明星分子”，其產生的促凋亡片段誘導細胞凋亡，現已成為腫瘤治療的重要靶點[24]。Bcl-2和Bax作為相互拮抗的同源調控因子，兩者形成二聚體后可調控線粒體膜電位，進而改變膜通透性，從而誘導細胞凋亡[25-26]。隨著Bax/Bcl-2二聚體的表達量增加，其能激活caspase-3，開啟凋亡級聯反應，進而促進細胞凋亡[27]。有研究顯示，β-catenin通路的活化能介導caspase途徑和線粒體途徑，影響細胞黏附，進而抑制細胞增殖[28]。由此可見，β-catenin信號通路的活化可促進腫瘤細胞的黏附作用，進而抑制細胞增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現，經AECC干預后，PC3細胞中MMP-7、c-Myc（低質量濃度組除外）、Bcl-2（低質量濃度組除外）的mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低，β-catenin、caspase-3（低質量濃度組除外）、Bax的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，說明AECC抑制PC3細胞遷移、侵襲的作用可能與調控β-catenin信號通路有關。

綜上所述，AECC可抑制PC3細胞的增殖、遷移與侵襲，其作用機制可能與調控β-catenin信號通路相關的遷移與凋亡因子的表達有關。

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（收稿日期：2021-02-11 修回日期：2021-05-03）

（編輯：唐曉蓮）