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    金銀花SSR指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析

    2015-05-30 17:34徐石勇李歐靜張舒瑋鄧慧劉征輝
    天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:指紋圖譜遺傳多樣性金銀花

    徐石勇 李歐靜 張舒瑋 鄧慧 劉征輝 王永 蘭青闊

    摘 要:以金銀花及其常見變種為材料,利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子指紋圖譜,并用于遺傳多樣性分析。選擇25個(gè)SSR位點(diǎn)用于多態(tài)性分析,其中3個(gè)位點(diǎn)具有較強(qiáng)多態(tài)性,并構(gòu)建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜,包括3對(duì)引物在6個(gè)供試材料中擴(kuò)增到的18條多態(tài)性條帶信息。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)金銀花及其變種的遺傳多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠(yuǎn),僅0.28。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)87個(gè)市售金銀花進(jìn)行分析,能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。

    關(guān)鍵詞:金銀花;SSR標(biāo)記;指紋圖譜;遺傳多樣性

    中圖分類號(hào):Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.003

    金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或初開的花,具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效,為常用大宗中藥材?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明金銀花中含有木犀草黃素、肌醇、皂甙、綠原酸,糖類、蛋白質(zhì)、維生素、多種化合物及多種微量元素,一些常用藥如銀翹解毒丸、清開靈、銀黃片等均以金銀花為主要原料。隨著我國對(duì)金銀花開發(fā)利用的突破性進(jìn)展,其在茶飲、日化、化妝品和保健品等領(lǐng)域的需求急劇增大。為滿足市場(chǎng)需求,我國近年來大面積種植金銀花藥材,但在種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析方面還沒有一套標(biāo)準(zhǔn)化的方法。

    簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR),也稱微衛(wèi)星DNA,是一類由幾個(gè)(一般為1~5個(gè))核苷酸為重復(fù)單位組成的核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性、分布廣等優(yōu)點(diǎn),常用于蔬菜遺傳育種[1]、基因定位[2]、遺傳圖譜構(gòu)建[3]、種質(zhì)鑒定等。玉米[4]、小麥[5]、棉花[6]等主要農(nóng)作物已建立成熟的基于SSR標(biāo)記的種子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及配套的指紋圖譜。本研究以金銀花及其常見變種為材料,應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立指紋圖譜,并對(duì)河北、山東、河南金銀花樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析,為促進(jìn)金銀花藥材鑒定標(biāo)準(zhǔn)化與品種選育提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、金銀花、金銀花4倍體等標(biāo)準(zhǔn)品(依次編號(hào)為S1~S6,表1),以及購自山東、河南的87個(gè)市售金銀花樣品,由天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供,研磨后用于DNA提取。

    1.2 基因組DNA提取

    參照Murray&Thompson[7]方法,做適當(dāng)改良后用于金銀花基因組DNA提取。DNA濃度用NanoDrop-1000 spectrophotometer(Thermo)檢測(cè)并稀釋至50 ng·μL-1,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 SSR位點(diǎn)信息與引物

    從GenBank數(shù)據(jù)庫查詢金銀花核酸序列369條,使用BatchPrimer3在線軟件掃描分[8]獲得32個(gè)候選SSR位點(diǎn),并設(shè)計(jì)SSR-PCR引物。并結(jié)合文獻(xiàn)查閱,確定25對(duì)引物(表2)用于多態(tài)性分析。

    1.4 SSR-PCR分析

    PCR反應(yīng)采用10 μL體系:其中2×GoTaq Green Master Mix(Promega)5 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL,DNA模板0.5 μL(50 ng·μL-1),滅菌去離子水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72℃ 30 s);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR儀為ABI veriti 96 well Thermol cycler。聚丙烯酰胺凝電泳:膠濃度為8%,電壓250 V,電泳1 h;采用銀染法進(jìn)行顯色。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    凝膠顯色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照,使用GeneTools(Sygene)軟件對(duì)電泳圖譜中穩(wěn)定且易分辨的條帶進(jìn)行分子量分析;聚類分析使用SLT-NTSYS(2.10)軟件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 金銀花SSR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

    以6份材料DNA為模板,對(duì)25對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn),25對(duì)引物中4對(duì)無擴(kuò)增條帶,有13對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶大于1條,說明該13個(gè)SSR位點(diǎn)在6個(gè)材料中具有多態(tài)性。其中位點(diǎn)jp.ssr48、jp.ssr58和jp.ssr59多態(tài)性較高(圖1),適合于金銀花SSR分子指紋圖譜的構(gòu)建。

    2.2 金銀花SSR指紋圖譜構(gòu)建

    通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,比較3個(gè)SSR位點(diǎn)在6份材料中的多態(tài)性。將每個(gè)樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進(jìn)行“1,0”標(biāo)注,構(gòu)建基于Excel格式的SSR指紋圖譜[9]。SSR指紋圖譜包含了6個(gè)材料3個(gè)SSR位點(diǎn)信息,共18個(gè)條帶,平均每對(duì)引物 6條(表3)。

    2.3 金銀花SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析與應(yīng)用

    對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明6個(gè)材料分為2大類(圖2),大毛花及其4倍體為一類,灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬為另一類,山銀花與金銀花遺傳距離較遠(yuǎn),僅0.28。山銀花中灰氈毛忍冬、華南忍冬遺傳距離最近,其次為紅腺忍冬,再次為黃褐毛忍冬。

    使用上述3對(duì)SSR引物,對(duì)購自河北省巨鹿縣、山東省平邑縣、河南省封丘縣的87個(gè)金銀花樣品進(jìn)行PCR-SSR檢測(cè)及聚類分析。結(jié)果表明,三產(chǎn)地的樣品與山銀花的遺傳距離較遠(yuǎn),全部為金銀花樣品;但又可分為兩類,其中一類為來自河北省巨鹿縣的50個(gè)樣品和來自河南省封丘縣的6個(gè)樣品,其一致性很強(qiáng),表明兩地金銀花品種的親緣關(guān)系很近;來自山東省平邑縣的8個(gè)樣品被歸于另一類,但又細(xì)分為5小類。

    3 結(jié)論與討論

    來源純正、品質(zhì)優(yōu)良的藥用植物資源是中藥現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要前提。金銀花是我國常用大宗中藥材,亟需對(duì)其開展遺傳多樣性分析并建立標(biāo)準(zhǔn)化的種質(zhì)資源鑒定方法。自2007年以來,我國科學(xué)家應(yīng)用RAPD[10]、RFLP[11-12]、同工酶[13]、ISSR[14-15]、DNA Barcoding[16]等標(biāo)記技術(shù)對(duì)金銀花及其變種進(jìn)行遺傳多樣性分析,取得了顯著的效果。但上述標(biāo)記技術(shù)也存在著重現(xiàn)性差、樣品用量大、周期長、操作復(fù)雜等缺陷,未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。SSR標(biāo)記具有鑒別力高、開發(fā)成本低、操作相對(duì)自動(dòng)化、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn),被普遍認(rèn)為是最接近于理想化的品種鑒定技術(shù)[17-20]。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,通過網(wǎng)絡(luò)可以免費(fèi)獲得海量的EST等序列信息及具有SSR掃描及引物設(shè)計(jì)功能的生物軟件,這為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供經(jīng)濟(jì)、便利的條件。

    蔣超等[21]對(duì)忍冬及其變種紅白忍冬的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,初步了解其SSR多態(tài)性特點(diǎn),并通過試驗(yàn)證明了SSR標(biāo)記可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。本研究通過對(duì)2種金銀花及其4種山銀花偽品進(jìn)行SSR標(biāo)記位點(diǎn)探索開發(fā),構(gòu)建小規(guī)模的指紋圖譜,并初步應(yīng)用于金銀花種植資源遺傳多樣性分析及種質(zhì)鑒定分析。結(jié)果表明,SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。但本研究存在樣本基數(shù)小、篩選位點(diǎn)少等問題,需要進(jìn)一步從全國范圍內(nèi)擴(kuò)大種質(zhì)資源的搜集,開展大規(guī)模的EST-SSR位點(diǎn)篩選。

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