益生菌對大鼠急性胰腺炎腸道細菌易位感染的調控作用及機制①

譚超超，王衡新

（1湖南省人民醫(yī)院檢驗科，長沙 430005；2天地恒一制藥股份有限公司，長沙 410331）

急性胰腺炎(acute panereatitis，AP)是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病，病因復雜，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人民群眾的生命健康[1-4]。其中，重癥急性胰腺炎（severe acute panereatitis，SAP）的死亡率高達20%，而繼發(fā)感染是重癥急性胰腺炎致死致殘的主要原因之一，因此，如何有效地控制SAP的繼發(fā)感染是臨床改善患者預后的關鍵。

大量的臨床資料及動物實驗研究證實，SAP的繼發(fā)感染是由腸道細菌及其代謝產物易位所引起，腸道是上述感染發(fā)生的主要場所，而感染的起因就是腸黏膜屏障功能障礙[1-4]。腸道正常菌群是腸道黏膜屏障的重要組成部分，在維持腸道黏膜屏障功能上起著至關重要的作用[5]。腸道微生態(tài)失衡、腸道黏膜屏障功能障礙是急性胰腺炎病情加重和復雜化的重要原因。本研究構建AP大鼠動物模型，通過益生菌阻止腸道屏障功能障礙，減少腸道細菌易位感染，進一步明確腸道菌群在急性胰腺炎易位感染中的重要作用，從恢復腸道屏障功能和重建腸道菌群微生態(tài)角度，為防治急性胰腺炎繼發(fā)感染提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32只6周齡的SD大鼠，體重300 g左右（所有大鼠均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004，使用許可證號：SYXK(湘)2020-0017。

1.2 主要試劑與儀器益生菌雙歧桿菌及乳酸桿菌（內蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司），細菌基因提取試劑盒及熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR,qPCR）試劑盒（中國大連Takara），牛黃膽酸鈉(Sigma公司)，內毒素檢測試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）。D－乳酸以及二胺氧化酶檢測試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司），血清炎癥因子檢測試劑盒（Invitrogen公司）。

1.3 急性胰腺炎動物模型的復制及動物分組將上述SD大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為假手術組（對照組），急性胰腺炎組（模型組），急性胰腺炎益生菌組（益生菌組）以及急性胰腺炎益生菌對照組（益生菌對照組）。益生菌組大鼠術前灌胃喂養(yǎng)2.5×109CFU/d的雙歧桿菌及乳酸桿菌制成的微生態(tài)制劑，2 d。其他各組灌胃喂養(yǎng)等份量玉米粉及淀粉等混制的安慰劑，其他處理一致，無菌條件下進入腹腔，對模型組、益生菌組、益生菌對照組分別逆膽管注射 5%牛黃膽酸鈉(1mL/kg)，速度 0.2 mL/min。3 min后可見胰腺區(qū)彌漫性充血腫脹，觀察5 min后縫合關腹[6]；假手術組注射等量無菌生理鹽水，4組均于實驗動物中心飼養(yǎng)，溫度控制在(22±2)℃，自由進食進水，晝夜明暗交替，各組大鼠于術后24 h處死，取標本。所有實驗均遵照實驗動物保護條例和相關的實驗動物倫理委員會的倫理學標準。

1.4 腸道優(yōu)勢菌群分析所有實驗動物在構建模型成功后24 h，在嚴格無菌操作下，取小腸內容物1～3 g，提取細菌基因組總DNA，根據(jù)試劑說明書要求（中國大連Takara）進行糞便優(yōu)勢菌qPCR法檢測。具體操作參考Tan等方法進行,細菌特異性引物組和用于qPCR的反應條件按照Tan文獻[3]報道設定，所有反應均重復進行3次，細菌數(shù)量單位以每克糞便（濕重）的log10（簡寫為lg）細菌數(shù)表示。

1.5 細菌易位感染及病理檢測所有實驗動物在構建模型成功后24 h，在嚴格無菌操作下，取肝臟左葉組織、脾臟、腎臟和腸系膜淋巴結(MLN)，在含無氧緩沖液的無菌研磨器中制成10%勻漿，30 min內取組織勻漿接種于普通血平板和厭氧血平板上，37℃分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)，計數(shù)菌落，以組織勻漿中培養(yǎng)出菌落即為細菌易位感染陽性。同時取胰腺組織進行HE染色組織病理學觀察。

1.6 腸道黏膜通透性和血清炎癥因子水平的檢測所有實驗動物在構建模型成功后24 h，處死取血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清用于內毒素、腸道通透性相關指標D-乳酸以及二胺氧化酶以及炎癥因子白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-α)測定。其中內毒素水平采用鱟試驗法進行檢測（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）。D-乳酸以及二胺氧化酶水平均采用分光光度法檢測（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。血清炎癥因子采用酶聯(lián)免疫吸附法（Invitrogen炎癥因子ELISA試劑盒）測定。

1.7 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)建庫、分析均采用SPSS 18.0軟件。正態(tài)分布的連續(xù)變量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示。組與組之間比較采用t檢驗，不同指標之間相關性分析采用Pearson相關系數(shù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠病理及易位感染分析結果對照組大鼠胰腺病理HE染色切片顯示大鼠胰腺組織結構清晰，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠胰腺寬稀，組織結構壞死，可見大量炎性細胞浸潤。益生菌組胰腺大部分組織結構清晰，可見少量炎性細胞浸潤，嚴重程度較模型組顯著減輕。而益生菌對照組胰腺組織病理改變比益生菌組壞死及炎性浸潤更嚴重，與模型組比較接近（圖1）。細菌易位感染培養(yǎng)結果顯示對照組無易位感染，模型組6只細菌培養(yǎng)陽性，易位感染發(fā)生率為（75%），益生菌組及益生菌對照組發(fā)生率分別為12.5%和87.5%。益生菌組易位感染率顯著低于模型組（F=6.35，P=0.01）以及益生菌對照組（F=9.00，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理學改變

2.2 各組大鼠腸道菌群qPCR結果熒光定量PCR分析結果顯示益生菌組乳酸桿菌(8.59±0.96)lg拷貝數(shù)/g、雙歧桿菌(8.36±0.89)lg拷貝數(shù)/g，顯著高于模型組乳酸桿菌(6.85±0.68)lg拷貝數(shù)/g、雙歧桿菌(5.68±0.78)lg拷貝數(shù)/g及益生菌對照組乳酸桿菌(6.78±0.74)lg拷貝數(shù)/g、雙歧桿菌(6.02±0.85)lg拷貝數(shù)/g。而益生菌組腸球菌(7.05±0.67)lg拷貝數(shù)/g、腸桿菌(8.05±0.86)lg拷貝數(shù)/g顯著低于模型組腸球菌(8.69±1.05)lg拷貝數(shù)/g、腸桿菌(9.86±0.89)lg拷貝數(shù)/g及益生菌對照組腸球菌(8.74±0.86)lg拷貝數(shù)/g、腸桿菌(9.68±0.85)lg拷貝數(shù)/g（圖2）。

圖2 急性胰腺炎腸道優(yōu)勢菌群分析

2.3 各組大鼠腸道通透性及炎癥因子水平比較各組大鼠腸道黏膜通透性和炎癥因子的檢測結果顯示益生菌組內毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平、IL-6及TNF-ɑ水平顯著低于模型組及益生菌對照組（表1）。

表1 各組大鼠腸道黏膜通透性和炎癥因子的檢測結果（±s）

表1 各組大鼠腸道黏膜通透性和炎癥因子的檢測結果（±s）

注：與對照組比較,*P＜0.05,與模型組比較,#P＜0.05,與益生菌組比較,&P＜0.05。

組別內毒素/（EU/mL）二胺氧化酶/（ku/L）D-乳酸/（mmol/L）IL-6/（pg/mL）TNF-ɑ/（pg/mL）對照組（n=8）0.10±0.041.27±0.958.05±2.3211.35±5.3615.65±6.98模型組（n=8）益生菌組（n=8）0.62±0.18*0.40±0.15*#6.85±2.15*4.35±1.68*#13.65±4.25*8.65±5.20*#56.85±13.58*35.65±11.24*#44.69±14.36*34.25±9.68*#益生菌對照組（n=8）6.58±1.85*&0.68±0.12*&14.35±4.23*&53.65±13.25*&42.25±9.87*&

2.4 腸道優(yōu)勢菌群與腸道黏膜通透性及炎癥因子水平的相關性分析Pearson相關分析結果顯示：腸球菌、腸桿菌均與內毒素、腸道通透性指標二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎癥因子IL-6呈正相關，其中腸桿菌與二胺氧化酶相關強度最大（r=0.51，P=0.00），雙歧桿菌、乳酸桿菌與二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎癥因子IL-6呈負相關，其中雙歧桿菌與內毒素負相關強度最大（r=-0.56,P=0.00）（表2）。

表2 腸道優(yōu)勢菌群與腸道黏膜通透性及炎癥因子水平的相關性分析

3 討論

腸道是引起急性胰腺炎繼發(fā)感染的細菌的主要來源[5,7-8]。SAP時，腸道菌群微生態(tài)平衡被破壞，導致腸道黏膜屏障功能障礙，通透性顯著增加，是腸道細菌發(fā)生易位感染的重要原因[5，9-11]。前期研究提示急性胰腺炎易位感染患者腸道菌群發(fā)生顯著改變，易位感染患者正常菌群數(shù)量減少，腸道致病菌大量繁殖[3,12]。本研究的腸道微生態(tài)制劑根據(jù)急性胰腺炎腸道菌群的改變而制成，有助于重建腸道菌群微生態(tài)平衡。

本研究通過逆膽管注射牛膽磺酸鈉構建急性胰腺炎動物模型，同時應用微生態(tài)制劑恢復腸道菌群，研究結果證實益生菌有助于恢復腸道菌群微生態(tài)平衡，益生菌組易位感染發(fā)生率較模型組降低62.5%。。本研究實時熒光定量檢測腸道優(yōu)勢菌群發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎模型組大鼠腸道內雙歧桿菌屬細菌、乳桿菌屬細菌明顯減少，致病菌腸桿菌科細菌、腸球菌等均明顯升高。而益生菌灌胃喂養(yǎng)可著增加腸道內雙歧桿菌屬細菌、乳桿菌屬細菌，控制致病菌腸桿菌科細菌、腸球菌增殖。此外病理分析結果也提示益生菌有助于減輕急性胰腺炎嚴重程度，可顯著降低腸道細菌易位感染。

二胺氧化酶、內毒素和D-乳酸是評價腸道黏膜通透性變化及屏障功能損傷狀態(tài)的常用指標，其水平升高表明腸道黏膜屏障受損，通透性增大。為了進一步明確益生菌對腸道菌群及急性胰腺炎的調控作用，本研究對各組SD大鼠急性胰腺炎腸道通透性及炎癥因子進行了分析，研究結果顯示益生菌組內毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平、IL-6及TNF-ɑ水平顯著低于模型組及益生菌對照組，結果提示益生菌有助于維護腸道黏膜屏障，從而控制急性胰腺炎炎癥的發(fā)生發(fā)展及疾病進展。

本研究結果顯示：腸球菌、腸桿菌與內毒素、二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎癥因子IL-6呈正相關，雙歧桿菌、乳酸桿菌與二胺氧化酶活性、D-乳酸含量及炎癥因子IL-6呈負相關。提示腸道菌群參與急性胰腺炎腸道屏障功能及炎癥反應，通過微生態(tài)制劑可改善腸道微生態(tài)，從而控制疾病進一步進展和惡化。國內外多項研究均證明，在急性胰腺炎大鼠動物模型中，益生菌有助于阻止腸道屏障功能障礙，顯著減少腸道致病菌的繁殖和腸道細菌易位感染，降低SAP死亡率[13-16]。提示，適時給予微生態(tài)制劑改善AP患者腸道菌群是臨床控制SAP繼發(fā)感染、降低SAP死亡率的有效措施之一。

綜上所述，本研究初步證實益生菌有助于恢復急性胰腺炎腸道菌群生態(tài)，控制致病菌的增殖，改善腸道屏障功能，對控制急性胰腺炎進展、阻止腸道細菌易位感染都有重要的意義。