自組裝納米多肽水凝膠負(fù)載干細(xì)胞對軟骨損傷修復(fù)的研究

曾統(tǒng) 唐碩 張迪 鄒峰 鄒學(xué)農(nóng) 陳海堡 靳松

【關(guān)鍵詞】絲蛋白降解;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;軟骨分化;水凝膠;自組裝

骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率隨著人口老齡化程度的增加明顯增高，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響身體健康的疾病之一，其主要病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨的破壞與缺損，因此關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)是骨性關(guān)節(jié)炎的治療關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）是一類來源于骨髓的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有自我更新、組織再生和抗炎修復(fù)等功能[1]。研究表明BMSC在特定誘導(dǎo)條件下可以轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)[2]。BMSC來源廣泛，體外培養(yǎng)可誘導(dǎo)類軟骨細(xì)胞分化，是一種非常有前景的可應(yīng)用于臨床治療軟骨缺損修復(fù)的種子細(xì)胞[3]。自組裝多肽納米纖維水凝膠通過簡單調(diào)節(jié)分子間電荷作用和氫鍵之間的平衡，使兩親性多肽聚集成了不同形態(tài)的組裝體進(jìn)而得到了具有等級(jí)結(jié)構(gòu)的宏觀多肽材料[4]。前期實(shí)驗(yàn)證明自組裝多肽形成的水凝膠支架能夠?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)提供良好條件[5]。本研究將新西蘭兔的BMSC接種至加載納米質(zhì)粒骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（pBMP2）及環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（cRGDfK）功能性多肽支架上培養(yǎng)，研究自組裝多肽形成的納米級(jí)結(jié)構(gòu)特征及BMSC在支架材料上的生長狀態(tài)、生物相容性、向軟骨細(xì)胞分化情況及軟骨修復(fù)效果，為其進(jìn)一步作為骨組織工程支架的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔20只，雌性，兔齡（11.01±1.03）月，體質(zhì)量（5.12±1.21）kg，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)2020d022），所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

二、主要材料和儀器

10%胎牛血清購自美國HyClone公司;高糖型DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺購自美國Gibco公司;胰酶、0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、青霉素鏈霉素雙抗、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和CCK-8檢測試劑盒購自美國Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒和TRIzolRNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒購自中國尚寶生物。主要儀器包括低速離心機(jī)（Thermo，德國）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、超聲波清洗機(jī)（科凈達(dá)，中國）、原子力顯微鏡（AsylumResearch，美國），激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon，日本），酶標(biāo)儀（VarioskanFlash，美國）、實(shí)時(shí)PCR儀（Bio-Rad，美國）、安捷倫1100高效液相色譜（HPLC）儀（Agilent，美國）、質(zhì)譜儀（FinniganLCQ，美國）、冷凍干燥機(jī)（Labconco，美國）。

三、方法

1.多肽自組裝水凝膠支架的制備和檢測

設(shè)計(jì)2條攜帶pBMP2及cRGDfK軟骨細(xì)胞特異性黏附肽的兩親性多肽，分別為PA1（C12AAADDD-GAGAGAGY）和PA2（C12AAADDD-cRGDfK），委托上海波泰公司用固相自動(dòng)多肽合成儀合成;采用HPLC儀純化并檢測其純度;質(zhì)譜儀檢測其平均分子量。根據(jù)文獻(xiàn)[6]在無菌條件下取10mg兩親性多肽粉末溶于400μl0.1mol/L氫氧化鈉溶液中;充分振蕩混勻溶解，然后在37℃培養(yǎng)箱中溫育1h，直到粉末完全溶解。然后再繼續(xù)添加無菌的雙蒸水至多肽溶液總體積為1ml，此時(shí)自組裝多肽臨界點(diǎn)為1%，多肽溶液呈黏稠狀，放置4℃冰箱保存。凝膠纖維的制備是直接將pH8的多肽溶液用1ml的注射器注射至0.1mol/L的鹽酸溶液中，即得到白色的凝膠狀纖維，利用掃描電鏡檢測支架結(jié)構(gòu)，使用原子力顯微鏡觀察自組裝納米多肽的纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)。

2.BMSC的分離和培養(yǎng)鑒定

將兔固定后消毒鋪巾，利多卡因20ml局部麻醉，利用骨穿穿刺針采集新鮮骨髓，按1∶3體積比加入10%胎牛血清、100kU/L青霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻后移入25ml的Hank培養(yǎng)瓶中差速貼壁法培養(yǎng)，3d后棄培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質(zhì)，然后每3d換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。待BMSC細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞儀檢測BMSC表面蛋白CD34、CD45、CD90和CD105的表達(dá)[7]。

3.多肽自組裝水凝膠與BMSC共培養(yǎng)

生物相容性檢測（活細(xì)胞/死細(xì)胞雙重染色）：配制DMEM/F12培養(yǎng)液，濾膜過濾滅菌混合后渦旋5s，加入BMSC混勻，調(diào)整濃度為2×106/ml細(xì)胞懸液，接種于有多肽自組裝水凝膠的24孔板中，每孔100μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，采用Calcein-AM/PI試劑進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）并且拍照記錄，其中活細(xì)胞顯示出黃綠色熒光，死細(xì)胞顯示出紅色熒光[7]。

使用CCK-8法檢測水凝膠上BMSC的增殖情況：在96孔培養(yǎng)板分別滴加50μl工作液，成膠后分別在空白孔、多肽自組裝水凝膠上滴加100μl3×104/ml的第2代BMSC細(xì)胞懸液。分為BMSC組、水凝膠組和BMSC復(fù)合水凝膠組，在培養(yǎng)6h、12h、1d、2d、3d、7d時(shí)，每組中各取1個(gè)孔加入1μlCCK-8溶液，37℃孵育1h，酶標(biāo)儀檢測450nm吸光度;使用GraphPadPrism7.0軟件繪制生長曲線圖。

水凝膠對BMSC成軟骨分化的影響：實(shí)時(shí)定量PCR檢測蛋白聚糖（AGN）、Ⅱ型膠原a1（COL2a1）、成軟骨分化調(diào)控基因Sox-9mRNA在不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4周）的表達(dá)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中設(shè)置空白組、誘導(dǎo)液（CM）組、水凝膠組、水凝膠與CM混合組，加入3×104/孔的第3代BMSC。分化培養(yǎng)1、2、3、4周后，吸盡孔內(nèi)液體，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔加入100μl細(xì)胞裂解液并反復(fù)吹打。鏡下觀察已無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，按檢測試劑盒說明書檢測。結(jié)果以Ct值表示，β-actin為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量[8]。引物序列見表1。

4.體外軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)

建立雙側(cè)膝髕股關(guān)節(jié)股骨髁部淺表層軟骨缺損（軟骨全層厚度的25%）兔模型，分組植入凝膠。取20只成年健康新西蘭大白兔，隨機(jī)分4組，每組5只。正常組手術(shù)顯露關(guān)節(jié)后不造模，缺損對照組造模后不處理，水凝膠組造模后植入水凝膠支架，水凝膠載荷干細(xì)胞組在造模后植入水凝膠支架和BMSC復(fù)合物。造模：用水合氯醛靜脈麻醉后，常規(guī)消毒鋪無菌單，取膝關(guān)節(jié)正中側(cè)切口，逐層切開皮膚、皮下軟組織、淺深筋膜，顯露膝關(guān)節(jié)股骨側(cè)，使用口腔鉆在其軟骨層進(jìn)行鉆孔，形成長2.5mm、寬1.0mm、深1.5mm的錐形軟骨缺損，生理鹽水沖洗，進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)后逐層縫合。3個(gè)月后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，取軟骨缺損組織行甲苯胺藍(lán)染色，應(yīng)用國際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（ICRS）評分系統(tǒng)評估染色結(jié)果，評分越高代表修復(fù)效果越好[8]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果

一、自組裝水凝膠的鑒定與觀察

兩親性多肽設(shè)計(jì)及合成的檢測：設(shè)計(jì)含pBMP2及cRGDfK功能性多肽自組裝水凝膠，用固相自動(dòng)多肽合成儀合成;采用HPLC分析目標(biāo)多肽出現(xiàn)3個(gè)峰值，見圖1A。在PeakNo.3時(shí)，RetTime為19左右，面積（Area）最大，出現(xiàn)多肽洗脫最高峰，此時(shí)多肽純度（Conc.）為96.70%;純化后收集目標(biāo)肽，然后冷凍干燥后行質(zhì)譜儀檢測其平均分子量為3219，證實(shí)了與理論分子量設(shè)計(jì)是一致的，見圖1B。其目標(biāo)肽RGDK-＼IKVAVAK-/KGGGGAAAAK-C16H31O化學(xué)結(jié)構(gòu)可見pBMP2序列及cRGDfK序列2個(gè)肽鏈分支結(jié)構(gòu)，見圖1C。水凝膠形成后，原子力顯微鏡下觀察顯示支架表面粗糙、凹凸不平，有利于細(xì)胞黏附和遷移，見圖1D、E。

二、BMSC的培養(yǎng)和鑒定

原代BMSC培養(yǎng)48h后開始貼壁，細(xì)胞呈梭形或者多角形;培養(yǎng)至第2代后，細(xì)胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，增殖迅速。取第3代生長狀態(tài)良好BMSC，流式細(xì)胞儀檢測CD34-FITC和CD90-PE、CD45-FITC和CD105-PE單克隆抗體，以同型非特異性IgG-PE、IgG-FITC作陰性對照，CD90陽性和CD34陰性的比例為95.10%，CD105陽性和CD45陰性的比例為91.22%，即CD90和CD105高度表達(dá)，而CD34和CD45未能表達(dá)或表達(dá)極低水平，符合BMSC表面抗原表達(dá)，見圖2。

三、水凝膠與BMSC的生物相容性及其對BMSC增殖及成軟骨分化的影響

培養(yǎng)72h后，熒光顯微鏡下觀察兔BMSC在自組裝水凝膠中生長狀態(tài)穩(wěn)定，形態(tài)良好，輪廓清晰，分布均勻。細(xì)胞染色示以綠染的活細(xì)胞為主，只有極少數(shù)紅染的死細(xì)胞，見圖3A。CCK-8檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，BMSC復(fù)合水凝膠組在培養(yǎng)3d時(shí)吸光度高于BMSC，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.231，P<0.001），見圖3B?？瞻捉M、水凝膠、CM組和水凝膠與CM混合組的AGN、COL2a1、Sox-9mRNA表達(dá)在第2～4周比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FAGN=245.135，PAGN<0.001;FCOL2a1=57.254，PCOL2a1<0.001;FSox-9=247.154，PSox-9<0.001），其中有水凝膠的環(huán)境更有利于BMSC成軟骨分化，見圖3C。

四、兔軟骨缺損模型大體觀察及甲苯胺藍(lán)染色分析

兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果的大體觀察及甲苯胺藍(lán)染色分析顯示，水凝膠載荷干細(xì)胞修復(fù)最理想，缺損對照組軟骨缺損范圍大、炎癥細(xì)胞浸潤多，水凝膠組軟骨缺損范圍較缺損對照組明顯減少，水凝膠載荷干細(xì)胞組炎性細(xì)胞消失且和正常組形態(tài)基本相近。4組的ICRS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=99.537，P<0.001），干細(xì)胞載荷水凝膠組評分高于水凝膠組（LSD-t=45.526、P<0.001）及缺損對照組（LSD-t=156.751，P<0.001），見圖4。

討論

自組裝納米多肽水凝膠支架材料是由多種氨基酸構(gòu)成并且具有疏水性和親水性區(qū)域的一類纖維，有良好的生物相容性、可降解、無毒性及免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[9]。水凝膠支架在啟動(dòng)軟骨細(xì)胞分化、維持細(xì)胞的存活起著重要的作用已被廣泛報(bào)道[10]。有研究顯示，將水凝膠支架肽鏈延長，上載能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的TGF-β1短肽序列，可成功修復(fù)猴股骨髁軟骨缺損模型，這一嶄新的設(shè)計(jì)理念給軟骨仿生材料的研制帶來極大的啟示[11]。有學(xué)者曾利用絲素蛋白β折疊將神經(jīng)生長因子（NGF）負(fù)載于支架上，NGF能緩慢釋放3個(gè)月以上[12]。

本研究設(shè)計(jì)含pBMP2及cRGDfK功能性多肽自組裝水凝膠，用固相自動(dòng)多肽合成儀合成并且證實(shí)與理論分子量設(shè)計(jì)是一致。原子力顯微鏡觀察自組裝多肽可以形成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并且提供腔隙。倒置顯微鏡觀察顯示BMSC的生長良好。目前尚未發(fā)現(xiàn)BMSC抗原特異性表型標(biāo)記，根據(jù)文獻(xiàn)大致為陽性表達(dá)CD90、CD44、CD34、CD54、CD73、CD29、CD13、CD146、CD106和CD105，陰性表達(dá)CD34、CD31、CD45、CD49d、CD14、CD10和CD11b[12]。本研究取第3代BMSC行流式細(xì)胞儀檢測表面抗原標(biāo)志物，結(jié)果表明CD90和CD105高度表達(dá)，而CD34和CD45未能表達(dá)或表達(dá)極低水平，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[13]。

細(xì)胞與材料的生物相容性是細(xì)胞在材料表面遷移、增殖與分化的前提[14]。本研究的BMSC與水凝膠共培養(yǎng)的雙重染色顯示以綠染的活細(xì)胞為主，只有極少數(shù)紅染的死細(xì)胞，說明生物相容性良好。CCK-8法結(jié)果顯示，BMSC復(fù)合水凝膠組在培養(yǎng)3d時(shí)細(xì)胞增殖能力高于BMSC組，表明在特定的分化刺激培養(yǎng)條件下水凝膠支架有助BMSC向成軟骨細(xì)胞分化。水凝膠本身由溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z形態(tài)后并不具備特定的形狀。在既往的研究中，水凝膠常用于腔隙型骨缺損的修復(fù)，本研究選擇兔軟骨缺損模型大體觀察及甲苯胺藍(lán)染色分析，結(jié)果顯示水凝膠有利于關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)，并且自組裝水凝膠載荷干細(xì)胞對修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損效果更好。

綜上所述，BMSC負(fù)載于多肽自組裝水凝膠支架中可通過暴露于納米纖維表面的cRGDfK環(huán)肽特異性黏附和募集間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨分化，從而有助修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。這種新型多肽納米纖維水凝膠材料可為臨床上骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷修復(fù)治療提供新的研究方向。